Method Article
ナノゲルは、生物製剤の送達のための優れた汎用性の高いナノ粒子プラットフォームです。タンパク質ベースのペイロードをカプセル化できる刺激応答性ポリ(エチレン)グリコールベースの高分子ナノゲルを、水性条件下でのワンステップ架橋コナノ重合戦略を使用して合成しました。これらの新規ナノ粒子の最適な作製と特性評価について、以下で紹介します。
架橋高分子ナノ粒子からなるナノゲルは、その汎用性の高いボトムアップ合成と生体適合性により、数多くの化学的および生物学的治療薬の送達のために開発されてきました。ナノゲル合成にはこれまでさまざまな方法が採用されてきましたが、生物学的ペイロードの完全性を損なう可能性のある刺激の強い有機溶媒や高温を使用せずにそれを達成した方法はほとんどありません。対照的に、ここで紹介する方法論は、穏やかな反応条件を使用して、100 nm未満のサイズのタンパク質を充填したナノゲルの合成を達成します。ここでは、水性ベースのシングルステップ架橋共重合技術を使用して合成されたナノゲル内のタンパク質ベースのペイロードの非共有結合カプセル化の方法を紹介します。この技術では、最初にタンパク質ベースのペイロードをカチオン性第四級アンモニウムモノマーに静電結合し、同時に過硫酸アンモニウムと N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミンを使用して架橋および共重合して、タンパク質ペイロードをトラップするナノゲルを形成します。ナノゲルのサイズと多分散指数は動的光散乱(DLS)を使用して決定され、表面形態は透過型電子顕微鏡(TEM)によって評価されます。ナノゲル内に閉じ込められたタンパク質の質量は、カプセル化効率を計算することによって決定されます。さらに、酸化還元応答性構造要素の段階的な分解によるナノゲルの放出制御能力も、バイオリダクションアッセイで評価されます。この手法を使用したナノゲルの合成と特性評価のすべての注意点を示すために、ナノ粒子最適化データの例を提供します。一般に、平均サイズ57nmおよび多分散指数値0.093で、均一サイズのナノゲルが得られました。76%という高い封止効率を達成しました。さらに、ナノゲルは、グルタチオンの存在下で48時間にわたって新規の酸化還元応答性成分が徐々に分解することにより、カプセル化されたタンパク質の最大86%の制御された放出を示しました。
ナノゲルは、架橋されたポリマーネットワーク構造を持つ3次元のサブミクロンサイズのハイドロゲルであり、形態学的完全性に影響を与えることなく、コアシェル内に大量の流体を保持できます1。一般に、ナノゲルは、油中水型逆マイクロエマルジョン2,3のような不均一なコロイド系における物理的または化学的架橋による機能性モノマーの重合によって合成される。両親媒性共重合体は、水性環境下でナノスケールの構造に自己組織化することができます。ただし、ジスルフィドまたはアミドベースのカップリングを含む化学的架橋戦略、クリックケミストリーを使用して安定化させるか、物理的に誘導(疎水性、静電、または水素結合戦略)または光誘起4。これらの戦略の中で、ポリマーの物理的自己組織化とそれに続く化学的架橋は、成功したナノゲル製造技術として報告されています5。歴史的には、最初のナノゲルは1990年代にVingradovら6、秋吉ら7、Lemieuxら8によって導入されましたが、最近では、天然ポリマーと合成ポリマーの両方で構成されるさまざまなスマートナノゲルが開発され、多様な生物医学的応用が検討されています9。
ナノゲルは、広範な貨物保持能力、大きな表面積、生体内安定性、ならびにカスタマイズ可能な化学的および機械的特性を有する10。ナノゲルの合成もスケーラブルであり、水性ベースにすることができます。さらに、ナノゲルの強化された含水量は、ナノゲルを敏感な生物学的ペイロードの効果的な担体にする11。さらに、表面積が大きいため、複数のバイオコンジュゲーションのニーズを満たすことができるため、ターゲティングモダリティをアタッチしてアクティブターゲティングが可能になります。特に、ナノゲル設計の汎用性により、広範囲の刺激応答性モノマーを使用することができ、これにより、それらの物理化学的特性9の精密な制御が可能になる。このユニークなエンジニアリング性により、従来使用されていたリポソーム、ミセル、またはポリメロソーム12,13では達成が困難であったナノゲル設計の合理的な改善が可能になる。特別に設計されたモノマー内に刺激応答性部分を組み込むことにより、ナノゲルは、pH、酸化還元条件、酵素などのさまざまな生理学的に関連する刺激に応答してペイロードの制御された放出を誘発するように設計することができる9,14。このようなスマートナノゲルは、従来のナノゲルよりも有用であり、なぜなら、それらは、拡張された血液循環に対して優れた安定性を有し、そして、それらの貨物の完全性を維持し、所望の標的部位におけるその制御された放出を媒介するための生理学的条件に耐えることができるからである15。実際、ナノゲルは、その汎用性の高い性質により、生物医学分野での牽引力を獲得しており、多数のセラノスティクスおよび診断アプリケーションのための刺激応答性ナノゲルの開発において顕著な進歩を遂げています2,16,17。
生物製剤は、タンパク質、ペプチド、および/または核酸からなる医薬品のカテゴリーを代表することができ、その驚くべき選択性により治療環境に革命をもたらし、それによって最も急速に成長している治療薬のクラスになりました18。実際、このような治療薬の市場が拡大していることは、2023年に米国連邦医薬品協会(FDA)による承認が急増したことからも明らかで、生物学的製剤は全医薬品承認の~40%を占めています19。その特異性と効力に加えて、新規創薬標的の迅速な発見、より効率的なバイオエンジニアリングプロセス、およびこれらの治療薬の 生体内 運命に関する知識の深化により、それらの使用が増加しています20。従来の生物製剤には、干渉RNA、置換タンパク質、サイトカイン、ホルモンなどがあり、これらは通常、組換えDNA技術を用いて生成される21。1982年にヒト組換えインスリンが承認されて以来、がん(トラスツズマブ、アベルマブなど)、炎症性腸疾患(アダリムマブ、セルトリズマブなど)、まれな遺伝性疾患(ミポメルサン、ミオザイム、アルデュラザイム、ファブラザイムなど)など、多くの疾患に対して生物学的製剤が開発されてきた21。生物製剤とその標的との相互作用の高い特異性は、理論的にはオフターゲット効果を相殺するはずですが、望ましくない副作用に関連するそれらの使用にはいくつかの臨床的懸念が浮上しています22。これらの副作用は、誇張された薬理学(標的の過剰刺激)と免疫原性の2つのカテゴリーに分類できます。さらに、半減期が短い、バイオアベイラビリティが限られている、プロテアーゼによる損傷、保存期間が短い、および高価な製造プロセスが、治療上の利点を制限しています21。これらの問題を緩和する従来の方法は、これらの生物製剤の共有結合的修飾を含み、それがそれらの機能、したがって有効性を損なう可能性がある23。あるいは、治療用ペイロードをカプセル化するナノメディシンアプローチは、薬理学的特性、最も重要なことに、強化された浸透および保持(EPR)効果24を介して炎症部位への受動的標的化に多くの利点を与えることができる。他のナノ粒子関連の利点には、循環時間の延長、クリアランス率の低下、製剤の柔軟性の向上、血管系の透過性および細胞取り込みの改善が含まれる可能性がある25。現在、生物学的ペイロードの送達のために多種多様なナノ粒子製剤が研究されていますが、ナノゲルの多機能性を模倣できるものはほとんどありません。実際、ナノゲルは、リポソームおよびミセルベースのナノ粒子によって達成される負荷容量を超えており、ほとんどの無機ナノ粒子よりも高いコロイド安定性を示します。このように、ナノゲルは、さまざまな生物学的治療薬の送達のための貴重なプラットフォームを提供します。
我々はこれまでに、新規のマトリックスメタロプロテイナーゼ応答性架橋高分子ナノゲル内に抗酸化酵素を送達することに成功しており、そこでは、使用された穏やかなカプセル化戦略により、放出時にタンパク質の生理活性が維持された26。この研究では、タンパク質ベースのペイロードの送達のための酸化還元応答性ナノゲルの最適化された合成を実証します。特に、この合成法により、刺激の強い有機溶媒や高温を使用せずに、温和な条件で目的のペイロードをカプセル化したナノゲル合成が可能になります。我々は、細胞内環境内の酸化還元恒常性を利用して、カプセル化されたペイロード27,28の放出を調節した。通常、自然に豊富な抗酸化グルタチオン(GSH)は、その濃度がそれぞれ2〜20μMから1〜10mMの範囲である細胞外および細胞内の酸化還元電位を制御します29,30。現在までに、多数の酸化還元感受性ナノ粒子が報告されており、これはin vivoでの薬物の制御放出を可能にする実証済みの信頼性の高い戦略となっています27,28。実際、ジスルフィド結合は、ジスルフィド含有架橋剤31,32、ジスルフィド含有モノマー33からの生分解性ポリマーの自己組織化、および酸化還元応答性ポリマープロドラッグまたは薬物/ポリマーコンジュゲート34,35を使用して、高分子ナノ材料内に設置されています.したがって、この研究では、高分子ナノ粒子内に独自の高GSH感受性ジスルフィド架橋剤が組み込まれ、カプセル化されたタンパク質ペイロードの制御された放出を可能にすることを調査しています。
この研究では、ナノゲルの設計は、特異性とペイロード送達に対処するための次の基準を中心に行われました:内皮の効率的な浸透と in vivo 安定性を確保するための、小さなサイズ(~100 nm)と均一なサイズ分布(多分散指数(PI)<0.3)27;タンパク質ペイロードの効率的なカプセル化、およびGSHに応答したペイロードの制御された放出。我々は、所望のタンパク質ペイロードの76%のカプセル化効率で、均質なサブ100nmサイズのナノ粒子を示したGSH応答性架橋ナノゲルの合成を報告する。
1. 酸化還元応答性架橋剤の合成
2. グルタチオンによるジスルフィド架橋剤の切断試験
3. 酸化還元応答性ナノゲル合成
4. ナノゲルの形態学的特性評価
5. マイクロビシンコニン酸(BCA)アッセイを用いたナノゲル内包タンパク質(BSA)の定量
6. グルタチオン存在下でのナノゲルからのタンパク質放出の定量化
ポリ(エチレングリコール)(PEG)ジスルフィドジアクリレート架橋剤の合成とキャラクタリゼー ション酸化還元応答性架橋剤は、 N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルを2-アミノエチルメタクリレートに求核置換することにより、アミド結合の形成を介して合成されました(図1)。必要な製品の合成は、主に 1HNMR(補足図1)によって検証されました。これは、製品サンプルを重水素化DMSOに溶解することによって行われ、δ3.48-3.53のPEG鎖のエチレン単位に対応する共鳴と(N)CH2-CH 2 に対応するトリプレットの組み合わせが行われましたδ3.59-3.65のグループを使用して、製品の形成を識別できます。形成された生成物のさらなる特性評価は、FT-IR(補足図2)、MALDI-ToF(補足図3)、 および13C NMR(補足図4)を使用しても行われました。
ナノゲルに組み込む前に、架橋剤(4.55 mg/mL)の切断性を、GSH(11 mM)とPBSで37°C、24時間インキュベートして評価しました。次に、得られた製品をAPCI-MSを用いて検討しました(図2)。586.2969 m/z([M + H]+ ここで M = CH3C(CH2) COOCH2CH2NHOOCCH2CH2O[CH2CH2O]7CH2CH2SH)で切断されたフラグメントのピークを同定することができました(図 2)。
ナノゲル合成と物理化学的特性評価
ナノゲルの合成手順を 図3に示します。ナノゲルの合成を確認するために、ナノゲルの凍結乾燥に続いて 、1H NMRおよびFT-IRを実施した。NMRスペクトルでは、δ1.25とδ2.10のピークは、ポリマー構造中のメタントリイルとメタニリリジエンの水素原子を示しています(補足図5)。また、δ3.70のブロードピークは、PEGのメチレン水素原子に相当します(補足図5)。したがって、NMRスペクトルはアクリルアミド鎖の存在を確認し、したがって重合が発生して目的の生成物を形成することを確認します。FT-IR スペクトルでは、アクリルアミドの C=C ストレッチに対応する領域 1637-1640 cm-1 にピークがないことが重合を示しています(補足図 6)。重合およびペイロードのカプセル化をさらに確認するために、ナノゲル反応混合物を、プロトコルで与えられた反応時間全体にわたって一定の時間間隔でDLS測定を行った(図4)。ここで、8.302nmのBSAに対応するピークは、ナノゲル内にさらにカプセル化されるにつれて徐々に減少し、精製後にBSAピークは見えず、ナノゲル構造26内にタンパク質がカプセル化されていることを示唆している。
表1 は、概念実証として、Cy7タグ付きウシ血清アルブミン(Cy7BSA)をロードしたナノゲルの物理化学的特性評価の結果を示しています。それらの合成後、ナノゲルを遠心分離または透析によって精製し、それらの物理化学的特性はTEMおよびDLSによって特徴付けられました(図5A、B)。ナノゲルの流体力学的半径は、50〜100nmの範囲である場合に適切であると考えられる。強度分布グラフに複数のピークが示されている場合、それはさまざまなサイズのナノゲル集団が存在するためである可能性が最も高いことに注意してください(補足図7A)。さらに、このような製品サンプルでは、相関関数は滑らかなシグモイド曲線とは対照的に不規則に見えます。これは否定的な結果として解釈されるべきであり、破棄されるべきです。許容可能なDLSサイズの結果は、対象サイズに定義された単一のピークが存在することによって観察できます(補足図7B)。さらに、PIは一定でなければならず、0.227まで許容されます。これに対し、空のナノゲルは一貫性がなく、サイズが大きいことを示しています(図5C、D)。ナノゲルのゼータ電位は、ナノゲルの正電荷を確保するようにも特徴付けられており、これにより細胞膜との静電相互作用が可能になり、それによって細胞の取り込みが促進されます(表1)。
エンプティナノゲルおよびCy7BSAを充填したナノゲルの貯蔵時の安定性も、4°Cで1ヶ月間保存し、25°Cの脱イオン水中でそれらのサイズおよびゼータ電位を測定した後にも調査した(補足図8A、B)。全体のサイズまたはゼータ電位にはほとんど変化が観察されず、したがって、これらの共有結合性架橋ナノゲルの安定性が向上したことを示しています。
測定すべきもう一つの重要なパラメータは、ナノゲルのカプセル化効率であり、これはペイロードを生理学的劣化から保護するために必要である43,44。このプロトコルは、サプライヤーの指示に従ってタンパク質のカプセル化効率(EE%)を分析するために開発されました。したがって、このプロトコルは、基本的に、BSAの標準濃度曲線を参照することにより、洗浄中の未知のタンパク質濃度を補間することを含みます。micro-BCAアッセイから得られた値は、精製されたナノゲルの洗浄中に存在するタンパク質の割合についてのアイデアを提供します。したがって、ナノゲルにうまく閉じ込められるタンパク質の割合を間接的に示します(表1)。得られる効率値は70%より高く、各合成間で大きな差を示さないようにする必要があります。カプセル化効率の値が低いほど、否定的な結果を表し、これらの定式化を破棄する必要があることを示します。これらの結果は、ナノゲルの高いカプセル化能力を裏付けるものであり、タンパク質送達におけるナノゲルの有望な応用が浮き彫りになりました。
ナノゲルの酸化還元応答性の評価
ナノゲルのGSH応答性を、37°Cの生理学的濃度(10mM)で調べた(図6A)29。このGSHの濃度は、GSHおよびGSH応答性ナノ材料の生理学的測定に関する文献を参照することによって決定された28,32。カプセル化されたCy7BSAの最大86%が48時間以内に放出されました(図6B)。一方、GSHを添加しなかった対照実験では、15%のタンパク質が放出されただけで、これは表面吸着されたタンパク質14,45のバースト放出を反映している可能性があります。
カプセル化されたタンパク質の生物学的完全性がナノゲルの合成、分解、または保存中に損なわれたかどうかを判断するために、ろ過によって単離されたタンパク質を凍結乾燥し、FT-IR分析を行いました(図7A)。タンパク質の三次元構造は、ポリペプチド鎖46内のペプチド結合のC=O基およびN-H基の水素結合によって作成されるαヘリックス、βシート、βターン、ランダムコイルなどの二次構造から構成される。このような二次構造に関連する赤外線吸収は、1700 cm-1 および1600 cm-1の領域に現れます。この領域に現れるアミドIバンドの分析は、タンパク質がナノゲルの合成、分解および貯蔵47の任意の段階で変性を受けるかどうかを示すことができる。ネイティブBSAの赤外線吸収を、反応混合物から単離されたBSAと比較し、ナノゲルをGSHとインキュベートした後、およびナノゲルを30日間保存した後で行いました。ナノゲル合成およびGSHインキュベーション後に単離されたBSAの場合、1662 cm-1 のピークは、BSAの構造における無傷のβターンの優位性を表しています。しかし、ナノゲルから30日間保存したBSAに1613 cm-1 のピークが現れることは、タンパク質の凝集に起因する分子間βシート構造の形成を示しています。FT-IR分析で得られた結果を確認するために、円二色性(CD)分析も実施しました(図7B)。天然BSAの曲線と一致する曲線から明らかなように、ナノゲル反応混合物から単離されたタンパク質とGSH後のインキュベーションは、タンパク質のαヘリックス構造の特徴であるCDスペクトルの208nmと222nmの紫外領域の2つの負のバンドに変化がなかったため、変化しませんでした。30日後にナノゲルから単離されたBSAでは、これらのピークにわずかな収差が見られ、これは何らかの凝集を示している可能性があります。
図1:PEGジスルフィドジアクリレート架橋剤の合成を示すスキーム。 塩基性条件下では、第一級アミンである2-アミノエチルメタクリレートがNHSエステル上で求核攻撃を行うと、アミド結合が形成され、架橋剤が生成されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:大気圧化学イオン化 - GSHとのインキュベーション後の切断されたPEGジアクリレートジスルフィド生成物の質量スペクトル。 データは、切断された生成物M = C26H49NO11SH+の分子イオンピークを示しています。ここで、[M + H]+ = 586.2969 m/zです 。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:酸化還元応答性高分子ナノゲルの合成。ワンステップの水性ラジカル重合ナノゲル合成。モノマーは最初にドデシル硫酸ナトリウム(SDS)のミセル内にカプセル化され、N、N、N'、N'-テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)および過硫酸アンモニウム(APS)によってin situ重合が開始されました。高溶解性アクリルアミド(AM)は、水性環境でナノゲルの安定性を維持し、2-(アクリロイルオキシ)エチルトリメチルアンモニウムクロリド(AETC)は、所望のタンパク質ペイロードの静電テンプレートを維持し、早期放出を減少させます。さらに、PEGジスルフィドジアクリレート架橋剤は、ペイロードの制御された放出を可能にします。SDSは後で精製方法によって除去されます。脱イオン水に対して3回の洗浄による遠心分離、または透析による遠心分離。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:特定の時間間隔でのナノゲル反応混合物の動的光散乱(DLS)測定。 BSAタンパク質(8.302nm)に関連するピークの強度の漸進的な減少は、タンパク質のカプセル化および4時間にわたる重合進行を追跡するために使用された 。
図5:Cy7-BSA_NG3およびEmpty_NG1の特性評価 (A)Cy7BSAを充填したナノゲルの負の染色TEM (Cy7BSA_NG3)。200nmのスケールバー。(B)Cy7BSA_NG3のサイズ分布と相関関数を示すDLSトレース。X軸上のDHは、ナノゲルの流体力学的直径またはサイズを指します。(C)空のナノゲル(Empty_NG1)のネガティブ染色TEM。200nmのスケールバー。(D)Empty_NG1のサイズ分布と相関関数を示すDLSトレース。X軸上のDHは、ナノゲルの流体力学的直径またはサイズを指します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:Cy7BSAカプセル化ナノゲル上のGSH活性の調査(Cy7BSA_NG3)(A)カプセル化ペイロードのGSH媒介制御放出。(B)10 mM GSHインキュベーションを48時間以上行った37°CでのCy7BSAの累積放出この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図7:ナノゲル反応条件、GSHを介したナノゲルの分解、およびナノゲルの長期保存がカプセル化されたBSAの構造的完全性に及ぼす影響。 BSAの種々の条件への曝露による二次構造の変化を、(A)FT-IRおよび(B)円二色性(CD)により確認した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ナノゲル | サイズ(nm) | 多分散指数(PI) | 派生平均カウント率(kcps) | ゼータ電位(mV) | カプセル化効率(%) |
Empty_NG1 | 269.1 ± 14.80 | 0.4965±0.0875 | 1820年±189年 | -8.23 ± 0.04 | 0 |
BSA_NG2 | 107.4 ± 36.22 | 0.201 ± 0.0035 | 2645±174 | -2.977 ± 0.07 | 83.40±0.5 |
Cy7BSA_NG3 | 57.15±11.79 | 0.093 ± 0.0019 | 4965±233 | 24.78 ± 0.86 | 76.40±0.2 |
表1:ナノゲルの完全な物理化学的特性評価。 ナノゲルの構造特性は、サイズ、多分散性(PI)、導出された平均カウントレート、ゼータ電位などにまとめられています。比較のために、それぞれのカプセル化効率も含まれています。
補足図1:PEGジアクリレートジスルフィド架橋剤の 1HNMRスペクトル。 1H NMR (400 MHz, (CD3)2SO): δ8.05 (t, 2H), 6.07 (s,2H), 5.69-76 (m, 2H), 4.05-4.09 (m, 8H), 3.61-3.65 (t, 4H), 3.57-3.59 (t, 4H), 3.48-3.53 (m, 56H), 2.88-20.91 (t, 4H), 2.31-2.34 (t, 4H), 1.88 (s, 6H).*残留溶剤(CH3)2SO(δ 2.50)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:PEGジアクリレートジスルフィド架橋剤のフーリエ変換赤外分光法(FT-IR)。 N-アミンC(O)N-Hストレッチ:3700-3200 cm-1 (ブロード);アルキルsp3 C-Hストレッチ:2950-2850 cm-1 (強い)、カルボニルC = Oストレッチ:1650 cm-1 (強い)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:PEGジアクリレートジスルフィドのマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間(MALDI-ToF)スペクトル。 計算された質量 (C50H92N2O22S2+): 1137.5656 m/z, 実際: 1137.5660 m/z. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図4:PEGジアクリレートジスルフィド架橋剤の 13C核磁気共鳴(NMR)スペクトル。13C NMR(400 MHz、(CD3)2SO):δ171.04、166.89、135.18、125.36、69.98-70.24、69.20、64.38、64.54、38.23、36.79、35.58、18.49。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図5:凍結乾燥ナノゲルの 1HNMRスペクトル。 1H NMR(400 MHz、D2O):δ3.70(s)、δ2.1(m)、δ1.25(m)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図6:凍結乾燥ナノゲルのフーリエ変換赤外分光法(FT-IR)。 N-アミンC(O)N-Hストレッチ:3700-3200 cm-1;アルキルsp3 C-Hストレッチ:2950-2850 cm-1 (強い)、カルボニルC = Oストレッチ:1655 cm-1 (強い);C-O-Cストレッチ:1095 cm-1 (シャープ)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図7:ナノゲルの特性評価。 (A)複数のピークの存在と不規則な相関曲線を特徴とする負のDLS結果。(B)単一の明確に定義されたピークと滑らかなシグモイド相関曲線の存在を特徴とする、正のDLS結果。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図8:サイズとゼータ電位の測定によるナノゲルの長期安定性の調査。 (A)空のナノゲルと(B)Cy7BSAを充填したナノゲルの両方を、30日間にわたってDLS分析を行いました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
バイオ医薬品業界における標的特異的バイオ医薬品の需要の高まりにより、in vivoの薬理学的プロファイルを改善しながら、急速な生理学的劣化を防ぎ、望ましくない副作用を相殺できる技術の必要性が高まっています。このことを念頭に置いて、タンパク質をロードしたナノゲルを合成するための簡単な手順について説明します。プロトコルに示されているように、酸化還元応答性架橋剤は、ナノゲル合成の前に合成する必要があります。次に、残りの主要なモノマーを添加し、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を添加した後、N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)と過硫酸アンモニウム(APS)によるin situラジカル重合を開始します。高溶解性アクリルアミド(AM)は、水性環境でナノゲルの安定性を維持し、2-(アクリロイルオキシ)エチルトリメチルアンモニウムクロリド(AETC)塩は、所望のタンパク質ペイロードの静電テンプレートを維持し、早期放出を減少させる26。さらに、PEGジスルフィドジアクリレート架橋剤は、ペイロード28,32の制御された放出を可能にします。SDSは後で精製方法によって除去されます。脱イオン水または透析に対して3回の洗浄による遠心分離。
世界中の多くの研究者が、さまざまな異なる合成戦略を使用して高分子ナノ粒子を合成しています1,48,49。当社の合成プロトコールは、有機溶媒や高温を使用しないため、一般的に使用される方法とは基本的に異なります。これを考慮に入れると、私たちの手順の新規性は、ユーザーの能力がナノゲルの合成を成功させる上で重要な役割を果たす可能性があることを意味します。ナノゲル合成における重要なステップは、空気中の酸素がアクリレートおよびメタクリレートの重合を妨げる可能性があるため、目的の生成物の損失を避けるために制御された方法で行われなければならない不活性雰囲気の維持を確保することです。したがって、不活性条件下での各試薬の混合と添加を正しく行うには、ある程度の練習が必要になる場合があります。それにもかかわらず、概説されたプロトコルは、ナノゲルに特定の特性を付与するために、例えば、ナノゲルをさらなるバイオコンジュゲーティブ手順に適したものにするためのアクリレート化されたヘテロ二官能性モノマーの使用など、多数の他のモノマーを合成に追加することができるため、汎用性の高い方法論を提供します。さらに、まれな単一遺伝子疾患だけでなく、慢性疾患や進行性疾患をも治療するための遺伝子治療の使用が大幅に復活しているため、十分な最適化を行うことで、核酸ベースのペイロードのカプセル化を探求することが可能です50。
要約すると、100 nm未満のサイズと効率的なペイロード保持能力を持つナノゲルを再現性よく合成するための、マイルドな水性ベースの戦略を提示しました。さらに、ナノゲル内に新規のジスルフィド架橋剤を組み込むことにより、細胞内還元剤に応答して閉じ込められたペイロードの制御された放出を実証しました。また、この合成戦略がペイロードを損なわないことも実証しました。このプロトコルは、刺激応答性ナノセラピーの分野におけるさらなるイノベーションの基盤を提供します。ナノゲルは、その独特で柔軟な合成条件により、今後のドラッグデリバリー分野で重要な役割を果たすことが期待されています。
著者には、開示すべき利益相反はありません。申告する財務上の詳細はありません。
インペリアル・カレッジ・ロンドン化学科とMedical Research Council Institute of Life Sciencesのご支援に感謝いたします。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
2-( acryloyloxy)ethyl]trimethylammonium chloride solution | Sigma Aldrich | 496146 | |
2-aminoethyl methacrylatehydrochloride | Sigma Aldrich | 516155 | |
4,7,10,13,16,19,22,25,32,35,38,41, 44,47,50,53-Hexadecaoxa-28,29-dithiahexapentacontanedioic acid di-N-succinimidyl ester | Sigma Aldrich | 671630 | |
Acrylamide | Sigma Aldrich | 23701 | |
Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | 248614 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | B6917 | |
Cy7- labelled bovine serum albumin | Nanocs | BS1-S7-1 | |
Deuterated dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 547239 | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270997 (anhydrous) and D65100 | |
Glutathione | Sigma Aldrich | G4251 | |
Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine | Sigma Aldrich | 411019 | |
Phosphate buffered saline | ThermoFisher | 10010023 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | 436143 | |
Triethylamine | Sigma Aldrich | 471283 | |
Uranyl Acetate | Agar Scientific | AGR1260A | |
Equipment necessary for nanogel synthesis and characterisation | |||
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter units (100kDa MWCO) | Merck Millipore | C7715 | |
Camera | Olympus | Veleta | |
Carbon-coated copper grids | Agar Scientific | AGS160 | |
Dialysis tubing (100kDa MWCO) | Spectrum labs | 11405949 | |
Dynamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano Ultra | |
Freeze dryer | Labconco | WZ-03336-01 | |
Infrared spectroscopy | Agilent | Cary 630 FTIR | |
iTEM software | Olympus | ||
Mass spectrometry | Waters | Micromass MALDI microMX MALDI Q-ToF | |
MF-MilliporeTM membrane filter (0.45/0.2μm pore size) | Merck Millipore, UK | HAWP04700, GSWP04700 | |
Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
Plate reader | Beckman | Coulter-PARADIGM | |
Proton and Carbon-13 nuclear magnetic resonance data | Bruker | 400MHz AV-400 NMR spectrometer | |
Rotary evaporator | Buchi | R-114 Rotary Vap System | |
Single-use needles | Sterican | 4665643 | |
Suba-Seal septa | Sigma Aldrich | Z124575 | |
Transmission electron microscopy | Phillips | CM 100 TEM | |
UV-vis spectrophotometer | Nanodrop | Nanodrop One/One C microvolume |
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