Um Contraste de Três Técnicas de Inoculação usado para determinar a raça do fusarium desconhecido oxysporum f.sp. niveum Isolados

Gerenciar o murmúrio fusarium de melancia requer o conhecimento das raças patógenas presentes. Aqui, descrevemos os métodos de inoculação de root-dip, infestado de kernel e métodos modificados de inoculação de mergulho de bandeja para demonstrar sua eficácia na digitação racial do fungo patogênico Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

Fusarium murcha de melancia (Citrullus lanatus), causada por Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), ressurgiu como uma grande restrição de produção no sudeste dos EUA, especialmente na Flórida. A implantação de estratégias integradas de manejo de pragas, como cultivares resistentes à raça, requer informações sobre a diversidade e densidade populacional do patógeno nos campos dos produtores. Apesar de alguns progressos no desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico molecular para identificar isolados de patógenos, a determinação racial muitas vezes requer abordagens de bioensação.

A digitação de raça foi conduzida por inoculação de mergulho radicular, método de semeadura infestada de kernel, e o método modificado de mergulho de bandeja com cada um dos quatro diferenciais de melancia (Diamante Negro, Cinza Charleston, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). Os isolados recebem uma designação de raça por cálculo da incidência da doença cinco semanas após a inoculação. Se menos de 33% das plantas para uma cultivar específica fossem sintomáticas, elas eram categorizadas como resistentes. As cultivares com incidência superior a 33% foram consideradas suscetíveis. Este artigo descreve três métodos diferentes de inoculação para determinar raça, mergulho radicular, núcleo infestado e inoculação modificada de mergulho de bandeja, cujas aplicações variam de acordo com o design experimental.

Os fungos soilborne que compõem o complexo de espécies de oxisporo fusarium oxysporum (FOSC) são patógenos hemibiotrópicos impactantes que podem causar doenças graves e perda de rendimento em uma variedade diversificada de culturas¹. O murche fusarium de melancia, causado por F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), vem aumentando em escopo, incidência e gravidade em todo o mundo nas últimas décadas ^2,3. Nas mudas, os sintomas do murche fusarium muitas vezes se assemelham a amortecimento. Em plantas mais antigas, a folhagem se torna cinza, clorolítica e necrótica. Eventualmente, a murcha das plantas progride para o colapso total da planta e a morte⁴. A perda direta de rendimento ocorre devido aos sintomas e morte da planta, enquanto a perda indireta de rendimento pode ocorrer devido aos danos solares causados pela eliminação do dossel foliar⁵. A reprodução sexual e as estruturas reprodutivas associadas nunca foram observadas em F. oxysporum. No entanto, o patógeno produz dois tipos de esporos assexuados, micro e macroconidia, bem como estruturas de sobrevivência maiores e de longo prazo chamadas clamídesporos, que podem sobreviver no solo por muitos anos⁶.

O FOSC é classificado em especial formae com base em faixas de hospedeiras observadas, geralmente limitadas a uma ou algumas espécies^{hospedeiras 1}. Embora pesquisas recentes tenham indicado que este complexo de espécies pode ser um composto de 15 espécies diferentes, as espécies particulares que infectam a melancia são atualmente desconhecidas⁷. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) é o nome dos grupos de cepas que infectam exclusivamente Citrullus lanatus ou a melancia domesticada ^8,9. As cepas de f. oxysporum dentro da maioria das especialidades de forma patogênica mostram certos níveis de diversidade em relação aos seus componentes genéticos e virulência em relação a uma espécie hospedeira. Por exemplo, uma cepa pode infectar todas as cultivares de um hospedeiro, enquanto outra só pode infectar as cultivares mais suscetíveis. Para explicar essa variação, esses grupos são informalmente classificados em raças baseadas em relações evolutivas ou características fenotípicas comuns. Dentro de Fon, quatro raças (0, 1, 2 e 3) foram caracterizadas com base em sua patogenicidade contra um conjunto de cultivares de melancia selecionadas, com a descoberta da raça 3 ocorrendo recentemente¹⁰.

Apesar dessa aparente diversidade, as morfologias dos esporos ou hifas não são distinguíveis entre as raças das raças Fon, o que significa que ensaios moleculares ou fenotípicos são necessários para identificar a raça única de um isolado¹¹. Pesquisas moleculares identificaram algumas diferenças genéticas. Por exemplo, o papel dos efeitos Secreted in Xylem (SIX) tem sido estudado há anos em F. oxysporum, e alguns desses efeitos foram localizados nos cromossomos trocados durante a transferência horizontal de genes¹². Por exemplo, SIX6 é encontrado nas corridas 0 e 1 fon, mas não na corrida 2¹³. Seis efeitos foram implicados na patogenicidade de F. oxysporum f. sp. lycopersici e F. oxysporum f. sp. cubense, que causam murcha fusarium no tomate e banana, respectivamente 14,15,16,17. A análise de perfis de efeitos SEIS entre cepas de F. oxysporum f. sp. spiniciae, o patógeno murcho fusarium no espinafre, permitiu uma classificação que reflete com precisão a diversidade genética e fenotípica¹⁸. No entanto, as diferenças entre os mecanismos de virulência das raças Fon não são atualmente totalmente compreendidas, e os ensaios moleculares desenvolvidos após seu uso mostraram resultados inconsistentes e imprecisos¹⁹. Portanto, os resultados fenotípicos dos ensaios de infecção são atualmente a melhor maneira de classificar isolados.

F. oxysporum inicialmente infecta hospedeiros através das raízes antes de subir o xilema²⁰. Isso torna a inoculação direta das raízes de uma determinada cultivar hospedeira uma maneira eficaz de realizar a digitação racial e é a base dos métodos de inoculação de mergulho de raiz e de mergulho de bandeja²¹. Quando não infecta um hospedeiro, F. oxysporum reside no solo e pode permanecer adormecido por anos. Cultivares de melancia suscetíveis no solo de um campo de interesse é uma maneira de testar a presença de Fon. Expandir este método para incluir cultivares de diferentes níveis conhecidos de resistência no solo que é deliberadamente infestado com Fon também é uma boa maneira de realizar a digitação racial (Tabela 1) e é a base do método infestado de sementes de kernel. O método modificado de mergulho de bandeja é uma variação do método original de mergulho de bandeja que permite uma digitação de corrida de alto rendimento onde muitas plantas e isolados de campo podem ser investigados rapidamente²². Fatores importantes de um bioensaio de digitação rápida e bem-sucedida incluem o uso de cultivares que documentaram diferenças na resistência às diferentes raças de patógenos, garantindo que o inóculo seja biologicamente ativo e abundante durante a infecção, mantendo um ambiente propício para o patógeno e hospedeiro, e usando um sistema de classificação consistente para gravidade ou incidência da doença. Este artigo descreve o mergulho raiz^23,24, semeamento infestado^{de 25,26}, e métodos modificados de mergulho de bandeja²² para digitação de raça fenotípica com base nos princípios descritos acima.

1. Determinando a raça por método de mergulho raiz (RDM)

1. Preparação do ambiente experimental
   1. Como a expressão dos sintomas é altamente dependente das condições ambientais, mantenha plantas em uma área controlada. Monitore a umidade relativa, temperatura, fotoperíodo e intensidade da luz (Figura 1).
      1. Coloque a temperatura entre 26-28 °C, umidade relativa do ar para 50-75%, e estabeleça um fotoperíodo de 16 horas para garantir o crescimento adequado da planta e a saúde.
         NOTA: Para evitar a hipóxia, a murcha das mudas e/ou apodrecimento de sementes, não sobrea água ou deixe água parada ao redor das mudas.
      2. Use duas luzes de tubo fluorescentes, cada uma com pelo menos 1850 lúmens de luz e uma temperatura de cor de 2.800 K por banco de luzes para suportar o crescimento fotossintético.
      3. Mantenha a área limpa e use práticas higiênicas, incluindo a remoção de resíduos de solo e detritos vegetais, para evitar danos causados por pragas e infecções incidentais.
   2. Condições de plantio
      1. Encha 8 x 16 células (25 cm de largura x 50 cm de comprimento) começando planos com meio de plantio e bata para baixo para comprimir ligeiramente o solo (Figura 2).
      2. Obter sementes das quatro cultivares diferenciais: Black Diamond/Sugar Baby, Charleston Grey/Allsweet/Dixielee, Calhoun Grey e PI-296341-FR.
      3. Semear sementes com seu ápice (extremidade pontiaguda) apontando para cima para uma profundidade igual ao seu comprimento. Depois que as sementes forem semeadas, cubra o meio contendo as sementes enterradas com a Terra 100% Fuller ou outra alternativa de argila bentonita a uma profundidade de 0,3175-0,635 cm.
      4. Misture os apartamentos para amortecer o meio sem criar água em pé ou de piscina. Depois, mantenha a mídia úmida por neblina por 20 s a cada 180 minutos, ou rega à mão uma vez por dia até a germinação de sementes por aproximadamente 5 dias. Após a germinação, a água uma vez por dia e, conforme necessário, para suportar o crescimento das mudas.
   3. Preparação da mídia
      NOTA: Ambas as mídias são firmes com ágar granulado extra para permitir a colheita de esporos raspando a superfície.
      1. Meio de suco V8 esclarecido (V8)
         1. Prepare 500 mL de suco V8 clarificado (V8)²⁷ adicionando 100 mL de v8 original 100% de suco vegetal com 1% caco₃ a 400 mL de água destilada.
         2. Adicione 7,5 g de ágar granulado.
         3. Misture bem os ingredientes, autoclave, e deixe esfriar a 50 °C antes de derramar em pratos estéreis de Petri.
      2. Mídia de ágar dextrose de batata de quarto de força (qPDA)
         1. Prepare o meio qPDA adicionando 4,5 g de ágar granulado a 500 mL de água destilada, adicione 3,8 g de ágar de dextrose de batata.
         2. Misture bem os ingredientes, autoclave, e deixe esfriar a 50 °C antes de despejar 12-15 mL em pratos petri estéreis.
2. Preparação de tratamentos experimentais
   1. Prepare o inóculo.
      1. Cinco dias pós-plantação (dpp), coloque discos de papel infiltrados (1-1,25 cm de diâmetro) contendo o f . oxysporum preferencial isolado em uma placa V8 e uma qPDA e armazene-os em uma incubadora (~28 °C) durante oito dias²⁸ (Figura 3A).
      2. No oitavo dia de crescimento fúngico e no dia anterior à inoculação (ver seção 1.3.2), transfira as placas V8 e qPDA da incubadora para um armário de biossegurança.
      3. Para cada isolação, dispense 6 mL de água desionizada esterilizada em cada placa de cultura V8 e qPDA.
      4. Desalojar conidia raspando um espalhador de células estéreis pela superfície média (Figura 3B). Acumule a suspensão conidial líquida e transfira-a para um tubo de cultura estéril de 50 mL (Figura 3C).
      5. Repita este processo até que o volume total de suspensão conidial líquida no tubo de cultura de 50 mL seja de aproximadamente 12 mL.
      6. Antes de seguir para outro isolado, esterilize a superfície da área de trabalho e o espalhador celular com álcool. Esterilize o espalhador de células passando-o através de um queimador Bunsen depois de mergulha-lo em ≥70% de etanol.
      7. Uma vez que as suspensões conidiais líquidas tenham sido transferidas para tubos de cultura para todos os isolados, quantifique as contagens de esporos. Primeiro, o vórtice um tubo de cultura individual de 50 mL e dispense 10 μL em cada câmara de um hemacytómetro. Em seguida, calcule o número de esporos no hemacytómetro como descrito anteriormente²⁹.
      8. Prepare a solução inóculo final transferindo o volume calculado para 10⁶ + 10% para outro tubo de cultura estéril e leve o volume total a 30 mL adicionando água deionizada estéril.
      9. Armazene esses tubos de cultura durante a noite a 8 ± 1 °C.
         NOTA: Isso pode ser feito sem perda de viabilidade conidial, como indicado por dados não publicados.
3. Inoculação
   1. Prepare a inoculação.
      1. Antes do dia da inoculação, a água robusta de mudas de treze dias de idade para a capacidade de transporte do solo.
      2. Prelabel as estacas com informações pertinentes, incluindo o isolado a ser testado, a cultivar de melancia e a data da inoculação.
      3. Coloque apartamentos de isopor de 6 x 12 células (20 cm de largura x 40 cm de comprimento), previamente higienizados com alvejante de 10% e bem enxaguados, para receber as plantas inoculadas.
      4. Preposição todos os materiais necessários (ver a Tabela de Materiais).
   2. Inocular as raízes da planta.
      1. Regar robustamente as plantas várias horas antes de iniciar a inoculação. Pelo menos 2 horas após a rega, remova as plantações dos apartamentos de isopor de 8 x 16 células e enxágue suas raízes para remover quaisquer partículas de material de plantio.
      2. Armazene temporariamente as plantas enxaguadas em recipientes limpos com água da torneira até o uso, mantendo as cultivares separadas umas das outras (Figura 4A). Separe as plantas em grupos de seis indivíduos e mantenha os grupos de mudas envoltos em toalhas de papel molhadas em uma bandeja de laboratório para evitar a dessecação.
      3. Coloque 25-30 cm³ de solo no fundo de cada célula da bandeja de isopor 6 x 12 e use uma garrafa de esguicho para molhar o solo até ficar visivelmente úmido.
      4. Inocular as plantas e replantá-las de acordo com a cultivar, de tal forma que Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, e então PI 296341 01 FR são plantadas da esquerda para a direita.
      5. Começando pelo controle saudável, coloque um grupo de seis mudas intactas da mesma cultivar nos tubos de 50 mL contendo o inóculo. No caso do controle saudável, use água da torneira em vez de uma suspensão de esporos. Inocular as plantas com o controle positivo (Fon corrida 3) por último.
      6. Uma vez dentro do tubo, certifique-se de que as raízes da planta alcancem e sejam expostas ao inóculo (água da torneira).
      7. Vórtice os tubos com raízes de plantlet submersos por 30 s (Figura 4B). Após o vórtice, coloque uma única planta por célula nos apartamentos de isopor 6 x 12. Coloque as plantas da mesma cultivar na mesma coluna na bandeja.
      8. Após a colocação, higienize as mãos enluvadas segurando-as em baldes de 0,7% de solução de cloro disponível para 30 s, seguida por uma lavagem de água da torneira por 1 min.
      9. Em seguida, cubra as plantais colocadas com meio de plantio e coloque suavemente. Usando uma seringa ou pipeta, rega cuidadosamente as plantações com 20 mL por planta, evitando espirrar.
      10. Antes de seguir para o próximo conjunto de plantas, higienize novamente as mãos enluvadas usando solução de cloro e uma lavagem de água da torneira.
      11. Depois de todas as plantações terem sido replantadas, recorta-as novamente minimamente para evitar o escoamento do inóculo.
      12. Segure as plantas durante a noite em um ambiente fechado e escuro com uma temperatura média de 27 °C. No dia seguinte, transfira as plantas para a estufa, mantendo a temperatura média em 27 °C.
4. Manutenção e cuidado de plantas inoculadas
   1. Para evitar o transbordamento de água excedente, rega os apartamentos levemente três vezes ao dia durante 4-5 dias até que as plantas se estabilizem.
   2. Verifique as bandejas 2-3 vezes por dia por pelo menos três dias para garantir uma cobertura adequada e uniforme da rega.
   3. Evite a secagem devido à luz solar ou sombreamento girando os apartamentos e/ou fornecendo sombreamento/rega suplementar conforme necessário.
   4. A 3 dpp, fertilize as plantas com um fertilizante de liberação rápida de 20-20-20 (10 g/3,78 L) a uma taxa de 3-6 mL por litro de água.
   5. Fertilize semanalmente por 3-4 semanas.
   6. Mantenha a mesma iluminação e condições ambientais ao longo desta etapa.

2. Determinação da corrida pelo método do kernel infestado (IKM)

1. Infestação dos grãos
   1. Prepare o inóculo.
      1. Seja de uma amostra armazenada ou recém-coletada, isole e cultive um F. oxysporum f. sp. niveum strain of interest on a plate of qPDA ao ponto de seu crescimento cobrir metade da placa.
         NOTA: Isso demonstra que ele é ativo e viável, o que é necessário para infestação substancial do grão em etapas posteriores.
   2. Prepare os grãos.
      1. Em uma escala, meça 200 g de grãos de centeio (Secale spp.) (ou maxie var. wheat (Triticum spp.) em qualquer recipiente suficientemente grande e despeje-os em um ou mais frascos de vidro Erlenmeyer de vidro 1 L. Adicione água da torneira estéril aos frascos para cobrir completamente os grãos até pelo menos 5 cm (Figura 5A).
      2. Mergulhe os grãos à temperatura ambiente (~24 °C) por 2 h. Drenar a água dos frascos; ligar a abertura com um pedaço de rolo de algodão embrulhado em pano de queijo; e cubra a abertura com envoltório de papel alumínio (Figura 5B).
   3. Descontaminar os grãos. Uma vez que o grão tenha água absorída, autoclave-o duas vezes em duas maneiras distintas de matar outros micróbios indesejados antes da inoculação.
      1. Durante a primeira vez, autoclave o grão nos frascos preparados em um ciclo de gravidade (121,2 °C, 1,06 kg/cm²) por 1h com 5 min de secagem. Deixe os frascos esfriarem à temperatura ambiente.
      2. Antes de autoclavar pela segunda vez, transfira os grãos para um pequeno saco de cultivo de cogumelos com um filtro de 0,5 μm. Retire o ar do saco e dobre o excesso de plástico ao redor do saco.
      3. Coloque o saco em uma lixeira de plástico, com segurança automática. Cubra a lixeira com envoltório de papel alumínio (Figura 5C).
         NOTA: Não utilize uma caixa de metal ao autoclavar os grãos nos sacos, pois isso pode fazer com que os sacos derretirem.
      4. Autoclave a lixeira em um ciclo de gravidade por 1h com 5 minutos de tempo de secagem, o mesmo ciclo de antes.
         NOTA: Apenas autoclave a bolsa na segunda vez, não a primeira, pois o filtro e a porta podem ficar comprometidos se as bolsas forem autoclavadas duas vezes. Evite a condensação no filtro, permitindo que os sacos esfriem lentamente e completamente antes de removê-los da autoclave, pois o filtro do saco de crescimento ficará comprometido se ficar molhado.
   4. Inocular os grãos.
      1. Trabalhando com a placa de cultura e o saco em um armário de biossegurança, discos de ágar cortados, 6 mm de diâmetro, da zona de crescimento ativo na placa de cultura com um furo de cortiça #4 de tamanho estéril. Desdobre o saco. Usando uma técnica estrita estéril, coloque 5 discos de ágar no saco. Use um cilindro graduado estéril de 50 mL para medir 35 mL de água estéril da torneira e adicioná-lo ao saco.
      2. Enrole um pouco a abertura do saco e depois pulverize o exterior com 70% de etanol para esterilizar a superfície.
         NOTA: Não pulverize o filtro, pois essa umidade também o comprometerá.
      3. Feche o saco dobrando os cantos em direção ao centro e, em seguida, mais de duas vezes acima do filtro. Fixar o saco com grampos de saco e tubos de vinil transparentes fornecidos pelo fabricante.
         NOTA: Os grampos são reutilizáveis.
      4. Remova o saco do armário de biossegurança.
   5. Armazene o patógeno para crescimento.
      1. Guarde a bolsa ereto. Certifique-se de que o filtro seja retirado do lado oposto do saco para permitir a troca máxima de gás (Figura 5D).
      2. Incubar os materiais em temperatura ambiente por aproximadamente três semanas. Redistribua os grãos regularmente para garantir o crescimento do patógeno.
         NOTA: As bolsas não são reutilizáveis.
2. Infecção de mudas de melancia com grãos infestados
   1. Sementes de melancia de origem como descrito anteriormente.
   2. Determine os grupos experimentais.
      NOTA: A única cepa do patógeno necessária são os isolados que estão sendo testados para identificação de raça. No entanto, controles negativos e positivos ajudarão a fazer comparações com plantas sem infecção ou um nível específico de infecção.
      1. Para preparar um controle negativo, utilize grãos de trigo esterilizados de acordo com o método anteriormente mencionado, mas sem inoculação.
      2. Para preparar um controle positivo, use grãos de trigo inoculados com uma cepa já classificada para comparação com o isolado desconhecido.
   3. Misture solo e grãos.
      1. Meça 14 grãos de grãos infestados em um grande saco plástico (Figura 5E). Encha potes plásticos (15 cm de diâmetro x 10 cm de altura) com mistura de vasos para medir a quantidade de mistura necessária. Esvazie a mistura no saco. Crie uma almofada de ar no saco e torça ou sele-a fechada.
      2. Misture os grãos e o solo invertendo o saco várias vezes. Para um controle negativo, realize o mesmo processo em uma bolsa diferente com grãos limpos. Para um controle positivo, realize o mesmo processo em uma bolsa diferente com grãos infestados com a cepa de comparação.
      3. Encha quatro potes esterilizados pela superfície com a mistura de solo infestada. Para um controle negativo, pote essa mistura antes de manusear qualquer solo contaminado por Fon.
   4. Semear as sementes de melancia.
      1. Semear seis sementes em cada panela. Certifique-se de que cada pote contém apenas sementes de uma cultivar. Posicione as sementes com o ápice da semente voltada para cima para permitir o crescimento adequado durante o surgimento (Figura 6A).
      2. Usando uma garrafa de spray, molhe a parte superior de 0,3-0,6 cm de solo com água. Coloque um prato de plástico transparente (15 cm de diâmetro) sobre cada panela para criar um ambiente úmido para germinação de sementes (Figura 6B).
   5. Estabelecer condições de crescimento.
      1. Rega os potes três vezes ao dia com uma garrafa de spray para manter a turísia sem escoamento até que as sementes germinem (aproximadamente 5 dias).
         NOTA: A quantidade de água utilizada aumentará com o tamanho da planta e o tamanho do vaso.
      2. Uma vez que as sementes tenham germinado, mova o prato superior para a parte inferior da panela.
      3. Regar as plantas diariamente conforme necessário para o crescimento ideal da planta. Exponha as plantas a um fotoperíodo de 16 horas em condições de iluminação semelhantes às descritas anteriormente e a uma temperatura de 27 °C (± 1 °C).

3. Determinando a raça pelo método modificado de mergulho de bandeja (MTDM)

1. Preparação dos materiais para inoculações
   1. Estabeleça condições de plantio.
      1. Encha 48 células (3,68 cm de largura x 5,98 cm de comprimento x 4,69 cm de profundidade) insere com areia pasteurizada a vapor: turfa: vermiculite (4:1:1) e bata para baixo para comprimir ligeiramente o solo. Coloque as pastilhas em bandejas plásticas (27,9 cm de largura x 53,3 cm de comprimento x 5,1 cm de profundidade).
      2. Semear as sementes com seu ápice (extremidade proximal) apontando para cima a uma profundidade igual ao seu comprimento.
      3. Fonte das sementes como descrito anteriormente.
      4. Depois, mantenha a mídia úmida por neblina por 20 s a cada 180 minutos ou rega à mão uma vez por dia.
      5. Após a germinação (aproximadamente 5 dias), a água uma vez por dia e conforme necessário para suportar o crescimento das mudas.
   2. Prepare a mídia.
      1. Prepare o meio qPDA adicionando 5.625 g de ágar granulado a 500 mL de água destilada; adicionar 4,875 g de dextrose de batata ágar. Misture bem os ingredientes, autoclave e esfrie a 50 °C antes de derramar em pratos estéreis de Petri. Sele as placas de Petri com parafilm e guarde os pratos em uma geladeira (4 °C) até usar.
      2. Para preparar o caldo médio, pese e adicione 24 g de dextrose de batata em uma garrafa de 1 L. Leve a mistura a 1000 mL adicionando água destilada à garrafa, e coloque a garrafa em uma placa quente e mexa até dissolver. Dispense 100 mL do caldo em frascos de Erlenmeyer de 250 mL. Use pano de queijo para selar os frascos e autoclave.
   3. Prepare o inóculo.
      1. Sete dias antes do plantio, inocular cinco placas qPDA com papel^{infiltrado 28} e armazená-las em uma área incubada por oito dias em um ciclo escuro de 14 h/10 h²².
      2. No sétimo dia, transfira dois plugues de 1 cm² ágar em cada frasco de 250 mL Erlenmeyer contendo dextrose de batata de 100 mL. Coloque os frascos de Erlenmeyer em um shaker de bancada a 200 rpm por 7 dias em um ciclo claro/escuro de 14 horas/10h.
      3. No dia da inoculação (14 dias após a semeadura), colhe os esporos filtrando o inóculo através de quatro camadas de pano de queijo estéril.
      4. Determine a concentração microconidial nos frascos usando um hemócito como descrito anteriormente. Prepare uma suspensão inóculo 7 L em uma banheira de plástico (40,6 cm de largura x 67,3 cm de comprimento x 16,8 cm de profundidade) transferindo o volume correto de suspensão de esporos para água estéril para uma concentração final de esporos de 1 × 10⁶ mL⁻¹ (Figura 7A).
2. Inoculação
   1. Quatorze dias após a semeadura (pelo menos primeiro estágio de folha verdadeira), transfira as pastilhas celulares com as mudas em bandejas de teia (26,9 cm de largura x 53,7 cm de comprimento x 6,28 cm de profundidade). Coloque delicadamente as bandejas com as mudas em uma banheira de plástico contendo a suspensão do 7 L inóculo. Inocular cada bandeja uma de cada vez (Figura 7B).
   2. Deixe as mudas permanecerem no inóculo sem serem perturbadas por 15 minutos. Após 15 minutos, transfira suavemente as pastilhas celulares contendo as mudas inoculadas em bandejas sem orifícios (largura de 27,9 cm x 53,3 cm de comprimento x 5,1 cm de profundidade). Repita este processo para cada bandeja.
   3. Coloque as bandejas sem buracos no banco da estufa e na água, conforme necessário. Mantenha a mesma iluminação e condições ambientais descritas para o bioensaio de mergulho radicular.

4. Classificação de doenças

1. Selecione intervalos de tempo para classificação.
   1. Para os métodos de mergulho de raiz e de mergulho de bandeja modificado, comece a classificar uma semana após as plantações serem inoculadas e continue semanalmente por mais quatro semanas.
      NOTA: O conjunto de dados combinado incluirá cinco conjuntos de observações durante este período.
   2. Ao usar o método do kernel, só comece a classificar quando as mudas surgirem e continuar semanalmente para um total de seis classificações.
2. Observe e calcule a incidência.
   1. Durante cada classificação, tire imagens digitais para documentar o progresso da doença.
   2. Relatar a incidência de murchar e morrer vegetal. Calcule a incidência tomando a soma das plantas sintomáticas em comparação com o controle saudável e o número de plantas mortas como proporção do número total de plantas naquela cultivar.
3. Analise os resultados. Compare os padrões de infecção entre as cultivares e entre os grupos de experimentos se foram utilizados controles.

Esses experimentos ajudam a definir a resistência relativa de cultivares comumente cultivadas (Tabela 1). Essas informações podem então ser usadas para orientar recomendações de gerenciamento com base nas populações locais de Fon. Em outras palavras, se a raça 0 ou 1 é conhecida por estar presente em um campo comercial, então o agricultor pode estar inclinado a crescer uma variedade "resistente" como Calhoun Gray, Sunsugar, ou equivalente. Os resultados dos bioensativos utilizando todos os métodos mostram que quando as mudas foram infectadas com um isolado da Raça 1, as cultivares Black Diamond e Charleston Grey morreram ou apresentaram sintomas graves, enquanto as cultivares Calhoun Grey e PI apresentaram resistência (Tabela 2 e Figura 8A).

Todos os métodos mostraram que quando as mudas foram infectadas com um isolado da Raça 3, quase todas as plantas de todas as cultivares morreram ou apresentaram sintomas graves (Figura 8B). Esses resultados demonstram como os bioensadores usando ambos os métodos de inoculação diferenciam com sucesso entre raças de Fon. O aparecimento de plantas doentes deve ser o mesmo para todos os métodos. A única diferença está na forma como as cultivares são agrupadas espacialmente. Para os métodos de mergulho de raiz e de dray-dip modificados, as cultivares serão organizadas por colunas da bandeja, enquanto no método do kernel, as cultivares serão agrupadas em seus próprios vasos.

Figura 1: Área experimental para RDM. Devido à variabilidade dos sintomas, que é altamente dependente de condições ambientais como umidade relativa, temperatura, fotoperódo e intensidade de luz, a manutenção de uma área experimental regulada é importante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Preparando os apartamentos de partida para RDM. Encha 8 x 16 células (25 cm de largura x 50 cm de comprimento) começando planos com meio de plantio e toque para baixo para comprimir ligeiramente o solo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Preparação de suspensão conidial para RDM. (A) Isolamento e cultivo. Seja de uma amostra armazenada ou recém-coletada, isole e cultive um F. oxysporum f. sp. niveum strain of interest on a plate of qPDA to the the so the the growth covers half the plate. Isso demonstra que é ativo e viável, o que é necessário para infestação substancial do grão em etapas posteriores. (B) Desalojar conidia. Desalojar conidia raspando um espalhador de células estéreis pela superfície média. (C) Deposição de suspensão. Acumule a suspensão de conidia líquida e transfira-a para um tubo de cultura estéril de 50 mL. Abreviação: qPDA = um quarto de resistência batata dextrose agar medium. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Organização e vórtice de mudas para RDM. (A) Separação de cultivares. Armazene temporariamente as plantas enxaguadas em recipientes limpos com água da torneira até o uso, mantendo as cultivares separadas. (B) Vórtice de mudas. Vórtice os tubos com raízes de plantlet submersos por 30 s para o plantio de uma única planta por célula nos apartamentos de isopor 6 x 12. Plantas da mesma cultivar são colocadas na mesma coluna na bandeja. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Preparação e infestação de grãos para IKM. (A) Imbibição de frutos de centeio. Em uma escala, meça 200 g de grãos de centeio (Secale spp.) (ou maxie var. wheat (Triticum spp.) em qualquer recipiente suficientemente grande e despeje-os em um ou mais frascos de vidro Erlenmeyer de vidro 1 L. Adicione água da torneira estéril nos frascos para cobrir completamente os grãos até pelo menos 5 cm. (B) Drenando os frascos. Escorra a água dos frascos, conecte a abertura com um pedaço de rolo de algodão embrulhado em pano de queijo e cubra a abertura com envoltório de papel alumínio. (C) Configuração de autoclave. Coloque o saco em uma lixeira de plástico, com segurança automática. Não use uma caixa de metal ao autoclavar os grãos nos sacos, pois isso pode fazer com que os sacos derretirem. Cubra a lixeira com papel alumínio. (D) Armazenamento de sacos. Guarde a bolsa ereto. Certifique-se de que o filtro seja retirado do lado oposto do saco para permitir a troca máxima de gás. (E) Meça 14 grãos de grãos infestados em um grande saco plástico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Semeadura e germinação de sementes de melancia. (A) Semear sementes de cultivar em vasos. Semear seis sementes em cada panela. Certifique-se de que cada pote contém apenas sementes de uma cultivar. Posicione as sementes com o ápice da semente voltada para cima para permitir o crescimento adequado durante o surgimento. (B) Germinação de sementes. Usando uma garrafa de spray, molhe a parte superior de 0,3-0,6 cm de solo com água. Coloque um prato de plástico transparente (15 cm de diâmetro) abaixo e sobre cada panela para criar um ambiente úmido para germinação de sementes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Preparação inóculo e inoculação de mudas para MTDM. (A) Preparação do inóculo. Determine a concentração microconidial nos frascos usando um hemócito como descrito anteriormente. Prepare uma suspensão de 7 L inóculo em uma banheira de plástico (40,6 cm de largura × 67,3 cm de comprimento × 16,8 cm de profundidade) transferindo o volume correto de suspensão de esporos para água estéril para uma concentração final de esporos de 1 × 10⁶ mL⁻¹. (B) Inoculando as mudas. Quatorze dias após a semeadura (pelo menos primeiro estágio de folha verdadeira), transfira as pastilhas celulares com as mudas em bandejas de teia (26,9 cm de largura × 53,7 cm de comprimento × 6,28 cm de profundidade). Coloque delicadamente as bandejas com as mudas em uma banheira de plástico contendo a suspensão do 7 L inóculo. Inocular cada bandeja uma de cada vez. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Resultados fenotípicos dos métodos de identificação racial. (A) Resultados da corrida 1. Os resultados dos bioensativos utilizando (A) todos os métodos mostram que quando as mudas foram infectadas com um isolado da Raça 1, as cultivares Black Diamond e Charleston Grey morreram ou apresentaram sintomas graves, enquanto as cultivares Calhoun Grey e PI apresentaram resistência. (B) Resultados da corrida 3. Todos os métodos mostraram que quando as mudas foram infectadas com um isolado da Raça 3, quase todas as plantas de todas as cultivares morreram ou apresentaram sintomas graves. (O aparecimento de plantas doentes deve ser o mesmo para todos os métodos. Ordem de plantio (da esquerda para a direita) mostrada por setas: Diamante Negro (seta azul), Cinza Charleston (seta roxa), Cinza Calhoun (seta marrom), Planta Introdução 296341-FR (arqueiro verde). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Corrida do Fusarium oxysporum f. sp. O Niveum. A raça do Fusarium oxysporum f. sp. niveum é determinada por reações suscetíveis ou resistentes a um conjunto de diferenciais de melancia. As cultivares listadas em cada linha são as mais utilizadas para representar cada nível de resistência durante a avaliação da raça de um isolado. Esta tabela foi modificada a partir de ⁴. Abreviaturas: S = suscetível; R = resistente.

Tabela 2: Identificação de raças. Os valores utilizados nesta tabela refletem a incidência ou o número de plantas sintomáticas, em comparação com o controle saudável, e o número de plantas mortas como proporção do número total de plantas naquela cultivar. Os números em cada célula refletem a incidência relatada ao final do período de observação. Uma cultivar é considerada suscetível quando pelo menos 1/3^ou 33% das plantas dessa cultivar são sintomáticas ou mortas. A raça do patógeno é então determinada com base em quais cultivares foram consideradas suscetíveis. Em outras palavras, o desempenho do patógeno contra cultivares com crescente resistência determina a raça do isolado. Esses resultados não são de um teste real e são bastante mostrados para transmitir como as raças são identificadas a partir dos resultados desses métodos. Abreviaturas: MTD = método modificado de gotejamento de bandeja; BD = Diamante Negro; CH. G = Cinza Charleston; Cal G. = Calhoun Grey; PI = Introdução vegetal 296341-FR; S = sintomático; AS = assintomática.

Três métodos de digitação racial foram apresentados. Cada um desses métodos é mais adequado para questões particulares e condições experimentais. O método de inoculação de kernel infestado (infestação do solo) é talvez mais simples e simples, tornando-o especialmente útil para a avaliação da patogenicidade³⁰. Usar este método para digitação de raça simples é altamente eficaz. No entanto, a aplicação do método para determinar a resistência de uma cultivar específica pode ser um desafio, uma vez que cada planta pode não enfrentar o mesmo grau de infecção ou exposição, e níveis igualmente altos de doença podem ser necessários para testar a resistência das cultivares de interesse. Este é o caso porque o inóculo produzido dessa forma não é bem quantificado, e a proporção de propagules viáveis, ou o número de propagules infecciosos que atingem a zona raiz, não é bem regulada³¹. Além disso, este método é limitado por inconsistências na proximidade dos núcleos plantados à zona raiz. Se muito distantes, os esporos podem não germinar, ou a hifa pode não se desenvolver o suficiente para alcançar as raízes.

O método de mergulho radicular^32,33 é mais trabalhoso e demorado; no entanto, como a quantidade de propagules viáveis interagindo com a planta é mais precisamente medida, a resistência do hospedeiro pode ser descrita com mais precisão, facilitando a triagem de resistência. Além disso, diferenças na virulência dentro da mesma raça podem ser mais facilmente detectadas. Este método tem o benefício adicional que, geralmente, as plantas se tornam sintomáticas mais cedo e de forma mais expressiva do que no método do kernel. Uma variante do método de mergulho radicular usando clamíduos na suspensão do inóculo em vez de conidia pode não ter esse benefício⁶. Da mesma forma, o método modificado de mergulho de bandeja²² é intensivo em mão-de-obra, mas permite fenotipagem de alto rendimento quando muitos isolados e mudas precisam ser rastreados.

Os fatores compartilhados para os três métodos incluem seleção de cultivares, condições de cultivo e requisitos para higiene. Dependendo do que estiver disponível comercialmente, algumas cultivares podem ser substituídas^21,34. Sugar Baby e Black Diamond podem ser usados para determinar isolados da raça 0, enquanto Charleston Gray, Allsweet e Dixielee foram descritos como resistentes à raça 0, mas suscetíveis à corrida 1. Calhoun Gray e Sunsugar são resistentes às corridas 0 e 1 e suscetíveis às corridas 2 e 3. O desenvolvimento da doença de Fon é altamente dependente da temperatura. Deve-se tomar cuidado para garantir que as condições experimentais controlem essa variável. Ao escolher um meio de plantio, misturas comerciais gerais que incluem musgo de turfa e/ou gesso e permitem uma boa aeração devem ser satisfatórias. Devem ser tomadas precauções para evitar a contaminação cruzada dos meios de plantio em ambos os métodos, especialmente do saco de origem.

Após o uso de um dos métodos descritos, a doença deve ser avaliada com precisão e forma consistente. Pesquisadores anteriores tipicamente decidiram sobre um limiar no qual as plantas são categorizadas como suscetíveis ou resistentes^35,36. Por exemplo, se menos de 33% das plantas de uma cultivar específica fossem sintomáticas, então essa cultivar seria categorizada como resistente ao isolado definido em relação ao perfil suscetível da cultivar. O conjunto de limiares é definido pelo pesquisador e a questão que deseja abordar. A variabilidade entre os raters e pelo mesmo rater entre as plantas tem sido amplamente relatada^37,38. Fatores como qualidade da semente utilizada, qualidade do solo, densidade inóculo, idade de armazenamento dos isolados e viés rater^39,40 contribuem para essa variabilidade⁸. Devido a essa variabilidade nas respostas da inoculação e da cultivar PI, são necessárias múltiplas replicações experimentais; idealmente, pelo menos três, mas cinco replicações são recomendadas, com 6 plantas por replicação por variedade.

Embora os ensaios moleculares tenham sido desenvolvidos para detectar isolados^fon 41,42,43, os resultados não foram consistentes devido à natureza polifiléptica de F. oxysporum e à variabilidade geográfica e genômica do complexo de espécies 44,45,46. Além disso, embora pesquisas anteriores tenham estabelecido a importância dos efeitos Secretados em Xylem (SEIS) em plena virulência, o complemento exato dos efeitos que definem a estrutura racial dos isolados de Fon ainda não foi determinado¹³. Diagnósticos moleculares para raça ainda estão sendo desenvolvidos, para os quais essas técnicas fenotípicas são fundamentais para avaliar sua precisão e utilidade na corrida fon^{digitando 19,47}.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Gostaríamos de reconhecer o Dr. Ali e o Laboratório de Diagnóstico Molecular vegetal, bem como o Dr. Pingsheng Ji da Universidade da Geórgia, cuja liderança e apoio ajudaram a estabelecer nosso programa Fon.