La gestione dell'appassimento del Fusarium dell'anguria richiede la conoscenza delle razze patogene presenti. Qui, descriviamo il root-dip, la semina del kernel infestato e i metodi di inoculazione a immersione del vassoio modificati per dimostrare la loro efficacia nella tipizzazione della razza del fungo patogeno Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

L'appassimento del fusarium dell'anguria (Citrullus lanatus), causato dal Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), è riemerso come un importante vincolo di produzione nel sud-est degli Stati Uniti, in particolare in Florida. L'implementazione di strategie di gestione integrata dei parassiti, come le cultivar resistenti specifiche per razza, richiede informazioni sulla diversità e la densità di popolazione dell'agente patogeno nei campi dei coltivatori. Nonostante alcuni progressi nello sviluppo di strumenti diagnostici molecolari per identificare gli isolati di patogeni, la determinazione della razza richiede spesso approcci di biodosaggio.

La tipizzazione della razza è stata condotta mediante inoculazione root-dip, metodo di semina del kernel infestato e metodo di immersione del vassoio modificato con ciascuno dei quattro differenziali di anguria (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). Agli isolati viene assegnata una designazione di razza mediante il calcolo dell'incidenza della malattia cinque settimane dopo l'inoculazione. Se meno del 33% delle piante per una particolare cultivar erano sintomatiche, sono state classificate come resistenti. Quelle cultivar con incidenza superiore al 33% sono state considerate sensibili. Questo articolo descrive tre diversi metodi di inoculazione per accertare la razza, il root-dip, il kernel infestato e l'inoculazione a vassoio modificato, le cui applicazioni variano a seconda del disegno sperimentale.

I funghi terrestri che compongono il complesso di specie Fusarium oxysporum (FOSC) sono patogeni emibiotrofici di impatto che possono causare gravi malattie e perdita di resa in una vasta gamma di colture¹. L'appassimento del fusarium dell'anguria, causato da F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), è aumentato in portata, incidenza e gravità in tutto il mondo negli ultimi decenni ^2,3. Nelle piantine, i sintomi dell'appassimento di Fusarium spesso assomigliano allo smorzamento. Nelle piante più vecchie, il fogliame diventa grigio, clorotico e necrotico. Alla fine, l'avvizzimento delle piante progredisce fino al collasso completo delle piante e alla morte⁴. La perdita diretta di resa si verifica a causa dei sintomi e della morte delle piante, mentre la perdita di resa indiretta può verificarsi a causa dei danni del sole causati dall'eliminazione della chioma fogliare⁵. La riproduzione sessuale e le strutture riproduttive associate non sono mai state osservate in F. oxysporum. Tuttavia, l'agente patogeno produce due tipi di spore asessuate, micro e macroconidi, nonché strutture di sopravvivenza più grandi e a lungo termine chiamate clamidospore, che possono sopravvivere nel terreno per molti anni⁶.

Il FOSC è classificato in formae speciales in base agli intervalli di ospiti osservati, di solito limitati a una o poche specie ospiti¹. Sebbene recenti ricerche abbiano indicato che questo complesso di specie può essere un composto di 15 specie diverse, le specie particolari che infettano l'anguria sono attualmente sconosciute⁷. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) è il nome dei gruppi di ceppi che infettano esclusivamente il Citrullus lanatus o l'anguria addomesticata ^8,9. I ceppi di F. oxysporum all'interno della maggior parte delle forme specialis patogene mostrano determinati livelli di diversità per quanto riguarda le loro componenti genetiche e la virulenza nei confronti di una specie ospite. Ad esempio, un ceppo può infettare tutte le cultivar di un ospite, mentre un altro può infettare solo le cultivar più sensibili. Per spiegare tale variazione, questi gruppi sono informalmente classificati in razze basate su relazioni evolutive o caratteristiche fenotipiche comuni. All'interno di Fon, quattro razze (0, 1, 2 e 3) sono state caratterizzate in base alla loro patogenicità rispetto a una serie di cultivar di anguria selezionate, con la scoperta della razza 3 che si è verificata recentemente¹⁰.

Nonostante questa apparente diversità, le morfologie delle spore o delle ife non sono distinguibili tra le razze delle razze Fon, il che significa che sono necessari saggi molecolari o fenotipici per identificare la razza unica di un isolato¹¹. La ricerca molecolare ha identificato alcune differenze genetiche. Ad esempio, il ruolo degli effettori Secreted in Xylem (SIX) è stato studiato per anni in F. oxysporum e alcuni di questi effettori sono stati localizzati sui cromosomi scambiati durante il trasferimento genico orizzontale¹². Ad esempio, SIX6 si trova nelle gare Fon 0 e 1 ma non in gara 2¹³. SEI effettori sono stati implicati nella patogenicità di F. oxysporum f. sp. lycopersici e F. oxysporum f. sp. cubense, che causano l'appassimento di Fusarium su pomodoro e banana, rispettivamente 14,15,16,17. L'analisi dei profili effettori SIX tra ceppi di F. oxysporum f. sp. spiniciae, il patogeno appassito di Fusarium sugli spinaci, ha consentito una classificazione che riflette accuratamente la diversità genetica e fenotipica¹⁸. Tuttavia, le differenze tra i meccanismi di virulenza delle razze Fon non sono attualmente del tutto comprese, e i saggi molecolari sviluppati sul loro uso hanno mostrato risultati incoerenti e imprecisi¹⁹. Pertanto, i risultati fenotipici dei test di infezione sono attualmente il modo migliore per classificare gli isolati.

F. oxysporum inizialmente infetta gli ospiti attraverso le radici prima di farsi strada nello xilema²⁰. Ciò rende l'inoculazione diretta delle radici di una determinata cultivar ospite un modo efficace per eseguire la tipizzazione della razza ed è alla base dei metodi di inoculazione root-dip e tray-dip²¹. Quando non infetta un ospite, F. oxysporum risiede nel terreno e può rimanere dormiente per anni. Coltivare cultivar di anguria sensibili nel terreno da un campo di interesse è un modo per testare la presenza di Fon. Espandere questo metodo per includere cultivar di diversi livelli noti di resistenza nel terreno che è deliberatamente infestato con Fon è anche un buon modo per eseguire la tipizzazione della razza (Tabella 1) ed è la base del metodo di semina del nocciolo infestato. Il metodo di immersione del vassoio modificato è una variante del metodo originale del vassoio-immersione che consente una tipizzazione della corsa ad alta produttività in cui molte piante e isolati di campo possono essere studiati rapidamente²². Fattori importanti di un biotest rapido e di successo includono l'uso di cultivar che hanno differenze documentate nella resistenza alle diverse razze patogene, assicurando che l'inoculo sia biologicamente attivo che abbondante durante l'infezione, mantenendo un ambiente favorevole sia per l'agente patogeno che per l'ospite e utilizzando un sistema di valutazione coerente per gravità o incidenza della malattia. Questo articolo descrive i metodi root-dip^23,24, la semina del kernel infestata^25,26 e i metodi di tray-dip²² modificati per la tipizzazione fenotipica della razza basata sui principi sopra descritti.

1. Determinazione della razza mediante il metodo root-dip (RDM)

1. Preparazione dell'ambiente sperimentale
   1. Poiché l'espressione dei sintomi dipende fortemente dalle condizioni ambientali, mantenere le piante in un'area controllata. Monitorare l'umidità relativa, la temperatura, il fotoperiodo e l'intensità della luce (Figura 1).
      1. Impostare la temperatura a 26-28 °C, l'umidità relativa al 50-75% e impostare un fotoperiodo di 16 ore per garantire un'adeguata crescita e salute delle piante.
         NOTA: Per prevenire l'ipossia, l'avvizzimento della piantina e / o la putrefazione dei semi, non innaffiare eccessivamente o lasciare l'acqua stagnante intorno alle piantine.
      2. Utilizzare due luci a tubo fluorescente, ciascuna con almeno 1850 lumen di luce e una temperatura di colore di 2.800 K per banca di luci per supportare la crescita fotosintetica.
      3. Mantenere l'area pulita e utilizzare pratiche igieniche, compresa la rimozione del terreno di scarto e dei detriti vegetali, per prevenire danni da parassiti e infezioni accidentali.
   2. Condizioni di impianto
      1. Riempire 8 x 16 celle (25 cm di larghezza x 50 cm di lunghezza) partendo da appartamenti con terreno di semina e toccare verso il basso per comprimere leggermente il terreno (Figura 2).
      2. Ottieni semi delle quattro cultivar differenziali: Black Diamond / Sugar Baby, Charleston Grey / Allsweet / Dixielee, Calhoun Grey e PI-296341-FR.
      3. Semina i semi con il loro apice (estremità appuntita) rivolto verso l'alto ad una profondità pari alla loro lunghezza. Dopo che i semi sono stati seminati, coprire il mezzo contenente i semi sepolti con 100% Fuller's Earth o altra alternativa di argilla bentonitica ad una profondità di 0,3175-0,635 cm.
      4. Nebulizzare gli appartamenti per smorzare il mezzo senza creare acqua in piedi o in piscina. Successivamente, mantenere il supporto umido nebulizzando per 20 s ogni 180 minuti o annaffiando a mano una volta al giorno fino alla germinazione dei semi per circa 5 giorni. Dopo la germinazione, innaffia una volta al giorno e secondo necessità per sostenere la crescita delle piantine.
   3. Preparazione dei media
      NOTA: Entrambi i supporti sono fatti solidi con agar extra granulato per consentire la raccolta delle spore raschiando la superficie.
      1. Succo medio V8 chiarificato (V8)
         1. Preparare 500 mL di succo medio V8 chiarificato (V8)²⁷ aggiungendo 100 mL di succo vegetale originale V8 100% chiarificato con 1% CaCO_{da 3} a 400 ml di acqua distillata.
         2. Aggiungere 7,5 g di agar granulato.
         3. Mescolare bene gli ingredienti, in autoclave, e lasciare raffreddare a 50 °C prima di versare in piastre di Petri sterili.
      2. Quarto di destrosio di patate agar media (qPDA)
         1. Preparare qPDA medium aggiungendo 4,5 g di agar granulato a 500 ml di acqua distillata, aggiungere 3,8 g di agar destrosio di patate.
         2. Mescolare bene gli ingredienti, in autoclave, e lasciare raffreddare a 50 °C prima di versare 12-15 ml in piastre di Petri sterili.
2. Preparazione di trattamenti sperimentali
   1. Preparare l'inoculo.
      1. Cinque giorni dopo il trapianto (dpp), posizionare dischi di carta infiltrati (diametro 1-1,25 cm) contenenti l'isolato di F. oxysporum preferito su una piastra V8 e una piastra qPDA e conservarli in un incubatore (~ 28 ° C) per otto giorni²⁸ (Figura 3A).
      2. L'ottavo giorno di crescita fungina e il giorno prima dell'inoculazione (vedere paragrafo 1.3.2), trasferire le piastre V8 e qPDA dall'incubatrice a un armadio di biosicurezza.
      3. Per ogni isolato, erogare 6 ml di acqua deionizzata sterilizzata su ogni piastra di coltura V8 e qPDA.
      4. Rimuovere i conidi raschiando uno spandicellulare sterile sulla superficie del mezzo (Figura 3B). Raggruppare la sospensione conidiale liquida e trasferirla in un tubo di coltura sterile da 50 ml (Figura 3C).
      5. Ripetere questo processo fino a quando il volume totale della sospensione conidiale liquida nel tubo di coltura da 50 mL è di circa 12 ml.
      6. Prima di procedere a un altro isolato, sterilizzare in superficie l'area di lavoro e lo spandicellulare con alcool. Sterilizzare lo spandiconcime facendolo passare attraverso un bruciatore Bunsen dopo averlo immerso in etanolo ≥70%.
      7. Una volta che le sospensioni conidiali liquide sono state trasferite in tubi di coltura per tutti gli isolati, quantificare il conteggio delle spore. In primo luogo, ruotare un singolo tubo di coltura da 50 ml ed erogare 10 μL in ciascuna camera di un emacitometro. Quindi, calcolare il numero di spore nell'emacitometro come precedentemente descritto²⁹.
      8. Preparare la soluzione finale di inoculo trasferendo il volume calcolato per 10⁶ + 10% su un altro tubo di coltura sterile e portare il volume totale a 30 ml aggiungendo acqua deionizzata sterile.
      9. Conservare questi tubi di coltura durante la notte a 8 ± 1 °C.
         NOTA: Questo può essere fatto senza perdita di vitalità conidiale, come indicato da dati non pubblicati.
3. Inoculazione
   1. Preparare l'inoculazione.
      1. Prima del giorno dell'inoculazione, innaffia in modo robusto piantine di tredici giorni alla capacità di carico del suolo.
      2. Preetichettare i pali con informazioni pertinenti, tra cui l'isolato da testare, la cultivar di anguria e la data di inoculazione.
      3. Posizionare 6 piatti in polistirolo a 12 celle (larghezza 20 cm x 40 cm di lunghezza), precedentemente igienizzati con candeggina al 10% e ben risciacquati, per ricevere le piante inoculate.
      4. Preposizionare tutti i materiali necessari (vedi la Tabella dei materiali).
   2. Inoculare le radici delle piante.
      1. Innaffia in modo robusto le piante diverse ore prima di iniziare l'inoculazione. Almeno 2 ore dopo l'irrigazione, rimuovere le piantine dagli appartamenti in polistirolo a 8 x 16 celle e risciacquare le radici per rimuovere eventuali particelle di materiale di piantagione aderenti.
      2. Conservare temporaneamente le piante risciacquate in contenitori puliti con acqua di rubinetto fino all'uso, mantenendo le cultivar separate l'una dall'altra (Figura 4A). Separare le piantine in gruppi di sei individui e tenere i gruppi di piantine avvolti in asciugamani di carta bagnati su un vassoio di laboratorio per evitare l'essiccazione.
      3. Posizionare 25-30 cm³ di terreno sul fondo di ogni cella del vassoio di polistirolo a matrice 6 x 12 e utilizzare una bottiglia di schizzo per bagnare il terreno fino a quando non è visibilmente umido.
      4. Inoculare le piante e ripiantarle in ordine secondo la cultivar, in modo tale che Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey e quindi PI 296341 01 FR siano piantati da sinistra a destra.
      5. Iniziando con il controllo sano, posizionare un gruppo di sei piantine non danneggiate della stessa cultivar nei tubi da 50 ml contenenti l'inoculo. Nel caso del controllo sano, utilizzare l'acqua del rubinetto al posto di una sospensione di spore. Inoculare le piante con il controllo positivo (Fon gara 3) per ultimo.
      6. Una volta all'interno del tubo, assicurarsi che le radici della pianta raggiungano e siano esposte all'inoculo (acqua del rubinetto).
      7. Vortice i tubi con le radici delle piantine sommerse per 30 s (Figura 4B). Dopo il vortice, posizionare una singola piantina per cella negli appartamenti di polistirolo 6 x 12. Posizionare le piante della stessa cultivar nella stessa colonna nel vassoio.
      8. Dopo il posizionamento, disinfettare le mani guantate tenendole in secchi di soluzione di cloro disponibile allo 0,7% per 30 s, seguito da un risciacquo con acqua di rubinetto per 1 minuto.
      9. Successivamente, coprire le piantine posizionate con terreno di semina e impostare delicatamente. Utilizzando una siringa o una pipetta, innaffiare accuratamente le piantine con 20 ml per piantina evitando schizzi.
      10. Prima di procedere alla successiva serie di piante, disinfettare nuovamente le mani guantate usando una soluzione di cloro e un risciacquo con acqua di rubinetto.
      11. Dopo che tutte le piantine sono state ripiantate, innaffiarle di nuovo in minima parte per prevenire il deflusso dell'inoculo.
      12. Tenere le piantine durante la notte in un ambiente chiuso e buio con una temperatura media di 27 °C. Il giorno seguente, trasferire le piante in serra, mantenendo la temperatura media a 27 °C.
4. Manutenzione e cura delle piante inoculate
   1. Per evitare il trabocco di acqua in eccesso, innaffiare leggermente gli appartamenti tre volte al giorno per 4-5 giorni fino a quando le piante non si stabilizzano.
   2. Controllare i vassoi 2-3 volte al giorno per almeno tre giorni per garantire una copertura adeguata e uniforme delle annaffiature.
   3. Evitare l'asciugatura dovuta alla luce solare o all'ombreggiatura ruotando gli appartamenti e / o fornendo ombreggiature / annaffiature supplementari se necessario.
   4. A 3 dpp, concimare le piante con un fertilizzante a rilascio rapido 20-20-20 (10 g / 3,78 L) ad una velocità di 3-6 ml per litro di acqua.
   5. Concimare settimanalmente per 3-4 settimane.
   6. Mantenere le stesse condizioni di illuminazione e ambientali durante questa fase.

2. Determinazione della razza con il metodo del kernel infestato (IKM)

1. Infestazione dei chicchi
   1. Preparare l'inoculo.
      1. Da un campione immagazzinato o appena raccolto, isolare e coltivare un ceppo di interesse F. oxysporum f. sp. niveum su una piastra di qPDA al punto che la sua crescita copre metà della piastra.
         NOTA: Questo dimostra che è attivo e vitale, che è necessario per l'infestazione sostanziale del grano nelle fasi successive.
   2. Preparare i kernel.
      1. Su una scala, misurare 200 g di bacche di segale (Secale spp.) (o noccioli di grano Maxie var. (Triticum spp.) in qualsiasi contenitore sufficientemente grande e versarli in uno o più palloni di vetro Erlenmeyer da 1 L. Aggiungere acqua di rubinetto sterile ai palloni per coprire completamente i grani fino ad almeno 5 cm (Figura 5A).
      2. Immergere i chicchi a temperatura ambiente (~24 °C) per 2 ore. Scolare l'acqua dai palloni; tappare l'apertura con un pezzo di rotolo di cotone avvolto in una garza; e coprire l'apertura con un involucro di alluminio (Figura 5B).
   3. Decontaminare i kernel. Una volta che il grano ha assorbito l'acqua, autoclave due volte in due modi distinti per uccidere altri microbi indesiderati prima dell'inoculazione.
      1. Durante la prima volta, autoclave il grano nei palloni preparati su un ciclo di gravità (121,2 °C, 1,06 kg/cm²) per 1 ora con un tempo di asciugatura di 5 minuti. Lasciare raffreddare i palloni a temperatura ambiente.
      2. Prima di autoclavare la seconda volta, trasferire i grani in un piccolo sacchetto per la coltivazione di funghi con un filtro da 0,5 μm. Rimuovere l'aria dal sacchetto e quindi piegare la plastica in eccesso attorno al sacchetto.
      3. Metti il sacchetto in un bidone di plastica sicuro per l'autoclave. Coprire il cestino con un involucro di alluminio (Figura 5C).
         NOTA: non utilizzare un bidone metallico durante l'autoclave dei grani nei sacchetti, in quanto ciò potrebbe causare la fusione dei sacchetti.
      4. Autoclave del bidone su un ciclo di gravità per 1 ora con 5 minuti di tempo di asciugatura, lo stesso ciclo di prima.
         NOTA: Solo autoclave il sacchetto la seconda volta, non la prima, in quanto il filtro e la porta potrebbero essere compromessi se i sacchetti vengono autoclavati due volte. Evitare la condensa sul filtro lasciando raffreddare lentamente e completamente i sacchetti prima di rimuoverli dall'autoclave perché il filtro a maniche di coltivazione si comprometterà se si bagna.
   4. Inoculare i chicchi.
      1. Lavorando con la piastra di coltura e il sacchetto in un armadio di biosicurezza, tagliare dischi di agar, 6 mm di diametro, dalla zona di crescita attiva sulla piastra di coltura con un foro di sughero sterile #4. Apri la borsa. Usando una rigorosa tecnica sterile, metti 5 dischi di agar nella borsa. Utilizzare un cilindro graduato sterile da 50 ml per misurare 35 mL di acqua di rubinetto sterile e aggiungerlo al sacchetto.
      2. Arrotolare leggermente l'apertura del sacchetto e quindi spruzzare l'esterno con etanolo al 70% per sterilizzare in superficie.
         NOTA: non spruzzare il filtro in quanto anche l'umidità lo comprometterà.
      3. Chiudere il sacchetto piegando gli angoli verso il centro e poi oltre due volte sopra il filtro. Fissare la borsa con morsetti per sacchetti e tubi in vinile trasparente forniti dal produttore.
         NOTA: i morsetti sono riutilizzabili.
      4. Rimuovere la borsa dall'armadio di biosicurezza.
   5. Conservare l'agente patogeno per la crescita.
      1. Conservare la borsa in posizione verticale. Assicurarsi che il filtro sia tirato lontano dal lato opposto del sacchetto per consentire il massimo scambio di gas (Figura 5D).
      2. Incubare i materiali a temperatura ambiente per circa tre settimane. Ridistribuire regolarmente i grani per garantire una crescita uniforme dell'agente patogeno.
         NOTA: Le borse non sono riutilizzabili.
2. Infezione di piantine di anguria con grano infestato
   1. Fonte semi di anguria come descritto in precedenza.
   2. Determinare i gruppi sperimentali.
      NOTA: L'unico ceppo o gli unici ceppi dell'agente patogeno richiesti sono gli isolati sottoposti a test per l'identificazione della razza. Tuttavia, i controlli negativi e positivi aiuteranno a fare confronti con le piante senza infezione o un livello specifico di infezione.
      1. Per preparare un controllo negativo, utilizzare chicchi di grano sterilizzati secondo il metodo precedentemente menzionato ma senza inoculazione.
      2. Per preparare un controllo positivo, utilizzare chicchi di grano inoculati con un ceppo già classificato per il confronto con l'isolato sconosciuto.
   3. Combina terra e grano.
      1. Misurare 14 grani di chicchi infestati in un grande sacchetto di plastica (Figura 5E). Riempire vasi di plastica (15 cm di diametro x 10 cm di altezza) con una miscela di invasatura per misurare la quantità di miscela necessaria. Svuotare il mix nel sacchetto. Crea un cuscino d'aria nella borsa e ruotala o sigillala chiusa.
      2. Mescolare i chicchi e il terreno invertendo il sacchetto più volte. Per un controllo negativo, eseguire lo stesso processo in un sacchetto diverso con kernel puliti. Per un controllo positivo, eseguire lo stesso processo in un sacchetto diverso con chicchi infestati dal ceppo di confronto.
      3. Riempi quattro vasi sterilizzati in superficie con la miscela di terreno infestata. Per un controllo negativo, invasare quella miscela prima di maneggiare qualsiasi terreno contaminato da Fon.
   4. Semina i semi di anguria.
      1. Semina sei semi in ogni vaso. Assicurarsi che ogni vaso contenga solo semi di una cultivar. Posizionare i semi con l'estremità apicale del seme rivolta verso l'alto per consentire una corretta crescita durante l'emergenza (Figura 6A).
      2. Usando un flacone spray, bagnare la parte superiore 0,3-0,6 cm di terreno con acqua. Posizionare un piatto di plastica trasparente (diametro 15 cm) sotto e sopra ogni vaso per creare un ambiente umido per la germinazione dei semi (Figura 6B).
   5. Stabilire condizioni di crescita.
      1. Innaffia i vasi tre volte al giorno con un flacone spray per mantenere il turgore senza deflusso fino a quando i semi non sono germogliati (circa 5 giorni).
         NOTA: la quantità di acqua utilizzata aumenterà con le dimensioni della pianta e le dimensioni del vaso.
      2. Una volta che i semi sono germogliati, sposta il piatto superiore nella parte inferiore della pentola.
      3. Innaffia le piante ogni giorno secondo necessità per una crescita ottimale delle piante. Esporre le piante a un fotoperiodo di 16 ore in condizioni di illuminazione simili a quelle precedentemente descritte e ad una temperatura di 27 °C (± 1 °C).

3. Determinazione della razza mediante il metodo MTDM (Modified tray-dip)

1. Preparazione dei materiali per le vaccinazioni
   1. Stabilire le condizioni di impianto.
      1. Riempire gli inserti a 48 celle (3,68 cm di larghezza x 5,98 cm di lunghezza x 4,69 cm di profondità) con sabbia pastorizzata a vapore: torba: vermiculite (4:1:1) e picchiettare verso il basso per comprimere leggermente il terreno. Posizionare gli inserti in vassoi di plastica (27,9 cm di larghezza x 53,3 cm di lunghezza x 5,1 cm di profondità).
      2. Semina i semi con il loro apice (estremità prossimale) rivolto verso l'alto ad una profondità pari alla loro lunghezza.
      3. Procurati i semi come descritto in precedenza.
      4. Successivamente, mantenere il supporto umido nebulizzando per 20 s ogni 180 minuti o annaffiando a mano una volta al giorno.
      5. Dopo la germinazione (circa 5 giorni), innaffia una volta al giorno e secondo necessità per sostenere la crescita delle piantine.
   2. Preparare i media.
      1. Preparare qPDA medium aggiungendo 5,625 g di agar granulato a 500 ml di acqua distillata; aggiungere 4.875 g di agar destrosio di patate. Mescolare bene gli ingredienti, in autoclave, e raffreddare a 50 °C prima di versare in piastre di Petri sterili. Sigillare le piastre di Petri con parafilm e conservare le piastre in frigorifero (4 °C) fino all'uso.
      2. Per preparare il brodo medio, pesare e aggiungere 24 g di destrosio di patate in una bottiglia da 1 L. Portare la miscela a 1000 ml aggiungendo acqua distillata alla bottiglia e posizionare la bottiglia su una piastra calda e mescolare fino a quando non si scioglie. Erogare 100 ml di brodo in 250 ml di fiaschi Erlenmeyer. Utilizzare una garza per sigillare le fiasche e l'autoclave.
   3. Preparare l'inoculo.
      1. Sette giorni prima della semina, inoculare cinque piastre qPDA con carta infiltrata²⁸ e conservarle in un'area incubata per otto giorni su un ciclo buio di 14 ore / 10 ore²².
      2. Il settimo giorno, trasferire due tappi di agar da 1 cm² in ogni matraccio Erlenmeyer da 250 mL contenente 100 mL di destrosio di patate. Posizionare i palloni Erlenmeyer su uno shaker da banco a 200 giri/min per 7 giorni su un ciclo luce/buio di 14 ore/10 ore.
      3. Il giorno dell'inoculazione (14 giorni dopo la semina), raccogliere le spore filtrando l'inoculo attraverso quattro strati di garza sterile.
      4. Determinare la concentrazione microconidiale nei palloni utilizzando un emocitometro come descritto in precedenza. Preparare una sospensione di inoculo da 7 L in una vasca di plastica (40,6 cm di larghezza x 67,3 cm di lunghezza x 16,8 cm di profondità) trasferendo il volume corretto di sospensione di spore in acqua sterile per una concentrazione finale di spore di 1 × 10⁶ mL⁻¹ (Figura 7A).
2. Inoculazione
   1. Quattordici giorni dopo la semina (almeno il primo vero stadio fogliare), trasferire gli inserti cellulari con le piantine in vassoi palmati (26,9 cm di larghezza x 53,7 cm di lunghezza x 6,28 cm di profondità). Posizionare delicatamente i vassoi palmati con le piantine in una vasca di plastica contenente la sospensione di inoculo da 7 L. Inoculare ogni vassoio uno alla volta (Figura 7B).
   2. Lasciare che le piantine rimangano indisturbate nell'inoculo per 15 minuti. Dopo 15 minuti, trasferire delicatamente gli inserti cellulari contenenti le piantine inoculate in vassoi senza fori (larghezza 27,9 cm x 53,3 cm di lunghezza x 5,1 cm di profondità). Ripetere questo processo per ogni vassoio.
   3. Posizionare i vassoi senza fori sul banco della serra e annaffiare se necessario. Mantenere le stesse condizioni di illuminazione e ambientali descritte per il saggio biologico root-dip.

4. Valutazione della malattia

1. Selezionare gli intervalli di tempo per la valutazione.
   1. Per i metodi root-dip e tray-dip modificati, iniziare a valutare una settimana dopo che le piantine sono state inoculate e continuare settimanalmente per altre quattro settimane.
      NOTA: il set di dati combinato includerà cinque serie di osservazioni durante questo periodo.
   2. Durante l'utilizzo del metodo kernel, iniziare le valutazioni solo una volta che le piantine emergono e continuare settimanalmente per un totale di sei valutazioni.
2. Osservare e calcolare l'incidenza.
   1. Durante ogni valutazione, scatta immagini digitali per documentare il progresso della malattia.
   2. Segnala l'incidenza dell'appassimento e della morte delle piante. Calcola l'incidenza prendendo la somma delle piante sintomatiche rispetto al controllo sano e il numero di piante morte in proporzione al numero totale di piante in quella cultivar.
3. Analizza i risultati. Confronta i modelli di infezione tra le cultivar e tra i gruppi di esperimenti se sono stati utilizzati i controlli.

Questi esperimenti aiutano a definire la resistenza relativa delle cultivar comunemente coltivate (Tabella 1). Queste informazioni possono quindi essere utilizzate per guidare le raccomandazioni di gestione basate sulle popolazioni Fon locali. In altre parole, se la razza 0 o 1 è nota per essere presente in un campo commerciale, allora l'agricoltore può essere incline a coltivare una varietà "resistente" come Calhoun Gray, Sunsugar o equivalente. I risultati dei biosaggi che utilizzano tutti i metodi mostrano che quando le piantine sono state infettate da un isolato di Razza 1, le cultivar Black Diamond e Charleston Grey sono morte o hanno mostrato sintomi gravi, mentre le cultivar Calhoun Grey e PI hanno mostrato resistenza (Tabella 2 e Figura 8A).

Tutti i metodi hanno mostrato che quando le piantine sono state infettate da un isolato di Razza 3, quasi tutte le piante di tutte le cultivar sono morte o hanno mostrato sintomi gravi (Figura 8B). Questi risultati dimostrano come i biotest che utilizzano entrambi i metodi di inoculazione distinguono con successo tra le razze di Fon. L'aspetto delle piante malate dovrebbe essere lo stesso per tutti i metodi. L'unica differenza è nel modo in cui le cultivar sono raggruppate spazialmente. Per i metodi root-dip e dray-dip modificati, le cultivar saranno organizzate per colonne del vassoio, mentre nel metodo kernel, le cultivar saranno raggruppate nei propri vasi.

Figura 1: Area sperimentale per RDM. A causa della variabilità dei sintomi, che dipende fortemente dalle condizioni ambientali come umidità relativa, temperatura, fotoperiodo e intensità luminosa, è importante mantenere un'area sperimentale regolamentata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Preparazione degli appartamenti di partenza per RDM. Riempire 8 x 16 celle (25 cm di larghezza x 50 cm di lunghezza) partendo da appartamenti con terreno di semina e picchiettare verso il basso per comprimere leggermente il terreno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Preparazione della sospensione conidiale per RDM. (A) Isolamento e coltivazione. Da un campione immagazzinato o appena raccolto, isolare e coltivare un ceppo di interesse F. oxysporum f. sp. niveum su una piastra di qPDA al punto che la sua crescita copre metà della piastra. Ciò dimostra che è attivo e vitale, il che è necessario per una sostanziale infestazione del grano nelle fasi successive. (B) Spostamento dei conidi. Rimuovere i conidi raschiando uno spandicellulare sterile sulla superficie del mezzo. C) Deposizione per sospensione. Raggruppare la sospensione liquida di conidi e trasferirla in un tubo di coltura sterile da 50 ml. Abbreviazione: qPDA = un quarto di forza patata destrosio agar medium. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Organizzazione e vortice di piantine per RDM. (A) Separazione delle cultivar. Conservare temporaneamente le piante risciacquate in contenitori puliti con acqua di rubinetto fino all'uso, mantenendo separate le cultivar. (B) Vortice di piantine. Vortex i tubi con radici di plantlet sommerse per 30 s per piantare una singola piantina per cellula nelle 6 x 12 piana di polistirolo. Le piante della stessa cultivar sono poste nella stessa colonna nel vassoio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Preparazione e infestazione di chicchi per IKM. (A) Imbibizione di bacche di segale. Su una scala, misurare 200 g di bacche di segale (Secale spp.) (o noccioli di grano Maxie var. (Triticum spp.) in qualsiasi contenitore sufficientemente grande e versarli in uno o più palloni di vetro Erlenmeyer da 1 L. Aggiungere acqua sterile del rubinetto nei palloni per coprire completamente i chicchi fino ad almeno 5 cm. (B) Scolare i palloni. Scolare l'acqua dai palloni, tappare l'apertura con un pezzo di rotolo di cotone avvolto in una garza e coprire l'apertura con un involucro di alluminio. (C) Configurazione dell'autoclave. Metti il sacchetto in un bidone di plastica sicuro per l'autoclave. Non utilizzare un bidone metallico durante l'autoclave dei grani nei sacchetti, in quanto ciò potrebbe causare la fusione dei sacchetti. Coprire il cestino con un involucro di alluminio. D) Deposito dei sacchi. Conservare la borsa in posizione verticale. Assicurarsi che il filtro sia tirato lontano dal lato opposto del sacchetto per consentire il massimo scambio di gas. (E) Misurare 14 grani di chicchi infestati in un grande sacchetto di plastica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Semina e germinazione dei semi di anguria. (A) Semina semi di cultivar in vaso. Semina sei semi in ogni vaso. Assicurarsi che ogni vaso contenga solo semi di una cultivar. Posizionare i semi con l'estremità apice del seme rivolta verso l'alto per consentire una corretta crescita durante l'emergenza. B) Germinazione delle sementi. Usando un flacone spray, bagnare la parte superiore 0,3-0,6 cm di terreno con acqua. Posizionare un piatto di plastica trasparente (diametro 15 cm) sotto e sopra ogni vaso per creare un ambiente umido per la germinazione dei semi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Preparazione dell'inoculo e inoculazione della piantina per MTDM. (A) Preparazione dell'inoculo. Determinare la concentrazione microconidiale nei palloni utilizzando un emocitometro come descritto in precedenza. Preparare una sospensione di inoculo da 7 L in una vasca di plastica (larghezza 40,6 cm × lunghezza 67,3 cm × profondità 16,8 cm) trasferendo il volume corretto di sospensione di spore in acqua sterile per una concentrazione finale di spore di 1 × 10^{6 ml-1}. (B) Inoculazione delle piantine. Quattordici giorni dopo la semina (almeno il primo vero stadio fogliare), trasferire gli inserti cellulari con le piantine in vassoi palmati (larghezza 26,9 cm × lunghezza 53,7 cm × profondità 6,28 cm). Posizionare delicatamente i vassoi palmati con le piantine in una vasca di plastica contenente la sospensione di inoculo da 7 L. Inoculare ogni vassoio uno alla volta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Risultati fenotipici dei metodi di identificazione della razza. (A) Risultati gara 1. I risultati dei biosaggi che utilizzano (A) tutti i metodi mostrano che quando le piantine sono state infettate da un isolato di Razza 1, le cultivar Black Diamond e Charleston Grey sono morte o hanno mostrato sintomi gravi, mentre le cultivar Calhoun Grey e PI hanno mostrato resistenza. (B) Risultati gara 3. Tutti i metodi hanno dimostrato che quando le piantine sono state infettate da un isolato di Razza 3, quasi tutte le piante di tutte le cultivar sono morte o hanno mostrato sintomi gravi. (L'aspetto delle piante malate dovrebbe essere lo stesso per tutti i metodi. Ordine di semina (da sinistra a destra) mostrato dalle frecce: Black Diamond (freccia blu), Charleston Grey (freccia viola), Calhoun Grey (freccia marrone), Plant Introduction 296341-FR (freccia verde). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Razza di Fusarium oxysporum f. sp. Niveum. La razza di Fusarium oxysporum f. sp. niveum è determinata da reazioni sensibili o resistenti a un insieme di differenziali di anguria. Le cultivar elencate in ogni riga sono le più utilizzate per rappresentare ogni livello di resistenza durante la valutazione della razza di un isolato. Questa tabella è stata modificata da ⁴. Abbreviazioni: S = suscettibile; R = resistente.

Tabella 2: Identificazione delle razze. I valori utilizzati in questa tabella riflettono l'incidenza o il numero di piante sintomatiche, rispetto al controllo sano, e il numero di piante morte in proporzione al numero totale di piante in quella cultivar. I numeri in ogni cella riflettono l'incidenza riportata alla fine del periodo di osservazione. Una cultivar è considerata suscettibile quando almeno 1^{/3 o} il 33% delle piante di quella cultivar sono sintomatiche o morte. La razza dell'agente patogeno viene quindi determinata in base a quali cultivar sono state ritenute sensibili. In altre parole, il modo in cui l'agente patogeno si comporta contro le cultivar con una resistenza crescente determina la razza dell'isolato. Questi risultati non provengono da una prova reale e sono piuttosto mostrati per trasmettere come le razze sono identificate dai risultati di questi metodi. Abbreviazioni: MTD = metodo a goccia del vassoio modificato; BD = Diamante Nero; CH. G = Grigio Charleston; Cal G. = Calhoun Grigio; PI = Introduzione all'impianto 296341-FR; S = sintomatico; AS = asintomatico.

Sono stati presentati tre metodi di tipizzazione della razza. Ognuno di questi metodi è più adatto a particolari domande e condizioni sperimentali. Il metodo di inoculazione del kernel infestato (infestazione del suolo) è forse più semplice e diretto, rendendolo particolarmente utile per la valutazione della patogenicità³⁰. L'uso di questo metodo per la semplice digitazione della razza è altamente efficace. Tuttavia, applicare il metodo per determinare la resistenza di una cultivar specifica potrebbe essere difficile, dato che ogni pianta potrebbe non affrontare lo stesso grado di infezione o esposizione, e potrebbero essere necessari livelli altrettanto elevati di malattia per testare la resistenza delle cultivar di interesse. Questo è il caso perché l'inoculo prodotto in questo modo non è ben quantificato e la proporzione di propaguli vitali, o il numero di propaguli infettivi che raggiungono la zona della radice, non è ben regolata³¹. Inoltre, questo metodo è limitato da incongruenze nella vicinanza dei chicchi piantati alla zona della radice. Se troppo distanti, le spore potrebbero non germinare, o le ife potrebbero non svilupparsi abbastanza per raggiungere le radici.

Il metodo root-dip ^32,33 è più laborioso e richiede tempo; tuttavia, poiché la quantità di propaguli vitali che interagiscono con la pianta viene misurata in modo più accurato, la resistenza dell'ospite può essere descritta in modo più accurato, facilitando lo screening della resistenza. Inoltre, le differenze di virulenza all'interno della stessa razza possono essere rilevate più facilmente. Questo metodo ha l'ulteriore vantaggio che generalmente le piante diventano sintomatiche prima e in modo più espressivo rispetto al metodo del kernel. Una variante del metodo root-dip che utilizza le clamidospore nella sospensione dell'inoculo invece dei conidi può mancare di questo beneficio⁶. Allo stesso modo, il metodo di immersione del vassoio modificato²² è laborioso ma consente una fenotipizzazione ad alto rendimento quando molti isolati e piantine devono essere sottoposti a screening.

I fattori condivisi per i tre metodi includono la selezione delle cultivar, le condizioni di crescita e i requisiti di igiene. A seconda di ciò che è disponibile in commercio, alcune cultivar possono essere sostituite^21,34. Sugar Baby e Black Diamond possono entrambi essere usati per determinare gli isolati di razza 0, mentre Charleston Gray, Allsweet e Dixielee sono stati descritti come resistenti alla razza 0 ma suscettibili alla gara 1. Calhoun Gray e Sunsugar sono resistenti alle razze 0 e 1 e suscettibili alle razze 2 e 3. Lo sviluppo della malattia di Fon dipende fortemente dalla temperatura. Si dovrebbe fare attenzione a garantire che le condizioni sperimentali controllino questa variabile. Quando si sceglie un mezzo di semina, le miscele commerciali generali che includono muschio di torba e / o gesso e consentono una buona aerazione dovrebbero essere soddisfacenti. Devono essere prese precauzioni per prevenire la contaminazione incrociata dei mezzi di impianto in entrambi i metodi, in particolare dal sacchetto di origine.

Dopo aver utilizzato uno dei metodi descritti, la malattia deve essere valutata in modo accurato e coerente. I ricercatori precedenti hanno in genere deciso una soglia alla quale le piante sono classificate come suscettibili o resistenti^35,36. Ad esempio, se meno del 33% delle piante di una cultivar specifica fosse sintomatico, allora quella cultivar sarebbe classificata come resistente con l'isolato definito in relazione al profilo suscettibile della cultivar. La soglia impostata è definita dal ricercatore e dalla domanda che desidera affrontare. La variabilità tra i valutatori e dallo stesso valutatore tra le piante è stata ampiamente riportata^37,38. Fattori come la qualità del seme utilizzato, la qualità del suolo, la densità dell'inoculo, l'età di conservazione degli isolati e la polarizzazione del valutatore^39,40 contribuiscono tutti a questa variabilità⁸. A causa di questa variabilità nell'inoculazione e nelle risposte delle cultivar PI, sono necessarie più repliche sperimentali; idealmente, sono raccomandate almeno tre ma cinque repliche, con 6 piante per replicazione per varietà.

Mentre sono stati sviluppati saggi molecolari per rilevare gli isolati di Fon 41,42,43, ⁱ risultati non sono stati coerenti a causa della natura polifiletica di F. oxysporum e della variabilità geografica e genomica del complesso di specie 44,45,46. Inoltre, sebbene ricerche precedenti abbiano stabilito l'importanza degli effettori Secreted in Xylem (SIX) in piena virulenza, l'esatto complemento di effettori che definiscono la struttura razziale degli isolati di Fon deve ancora essere^{determinato 13}. La diagnostica molecolare per la razza è ancora in fase di sviluppo, per la quale queste tecniche fenotipiche sono fondamentali per valutarne l'accuratezza e l'utilità nella tipizzazione della razza Fon^19,47.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Vorremmo ringraziare il Dr. Ali e il Plant Molecular Diagnostic Laboratory, nonché il Dr. Pingsheng Ji dell'Università della Georgia, la cui leadership e supporto hanno contribuito a stabilire il nostro programma Fon.