알려지지 않은 Fusarium oxysporum f.sp.의 인종을 결정하는 데 사용되는 세 가지 접종 기술의 대조. 니벳 격리

수박의 Fusarium wilt를 관리하려면 존재하는 병원균 종족에 대한 지식이 필요합니다. 여기에서, 우리는 병원성 균류 Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon)의 인종 타이핑에서 그들의 효능을 입증하기 위해 뿌리 딥, 감염된 커널 시딩, 및 변형된 트레이-딥 접종 방법을 설명한다.

Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon)에 의해 유발 된 수박의 Fusarium wilt (Citrullus lanatus)는 미국 남동부, 특히 플로리다에서 주요 생산 제약으로 다시 부상했습니다. 인종별 내성 품종과 같은 통합 해충 관리 전략을 수립하려면 재배자의 분야에서 병원균의 다양성과 인구 밀도에 대한 정보가 필요합니다. 병원체 분리물을 확인하기 위한 분자 진단 도구 개발의 일부 진전에도 불구하고, 인종 결정은 종종 생물분석 접근법을 필요로 한다.

레이스 타이핑은 뿌리딥 접종, 감염된 커널 시딩 방법, 및 네 개의 수박 차동 각각을 사용한 변형된 트레이-딥 방법(블랙 다이아몬드, 찰스턴 그레이, 칼훈 그레이, 식물 소개 296341-FR)에 의해 수행되었다. 격리는 접종 후 다섯 주 후에 질병 발생률의 계산에 의해 인종 지정을 할당됩니다. 특정 재배자에 대한 식물의 33 % 미만이 증상이 있으면 내성으로 분류되었습니다. 발병률이 33 % 이상인 품종은 감수성이있는 것으로 간주되었습니다. 이 논문은 인종, 뿌리 딥, 감염된 커널 및 변형 된 트레이 딥 접종을 확인하기위한 세 가지 접종 방법을 설명하며, 실험 설계에 따라 응용 프로그램이 다릅니다.

Fusarium oxysporum 종 복합체 (FOSC)를 구성하는 토양 매개 곰팡이는 다양한 범위의 작물에서 심각한 질병과 수확량 손실을 일으킬 수있는 영향력있는 반생물 영양 식물 병원균입니다¹. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon)에 의해 야기 된 수박의 Fusarium wilt는 지난 수십 년 동안 전 세계적으로 범위, 발생률 및 심각도가 증가하고 있습니다 ^2,3. 묘목에서 Fusarium wilt의 증상은 종종 댐핑 오프와 유사합니다. 오래된 식물에서는 단풍이 회색, 엽록색 및 괴사가됩니다. 결국, 식물의 시들음은 완전한 식물 붕괴와 죽음으로 진행된다⁴. 직접적인 수확량 손실은 증상 및 식물 사멸로 인해 발생하는 반면, 간접 수확량 손실은 엽면 캐노피의 제거로 인한 태양 손상으로 인해 발생할 수 있습니다⁵. 성적 재생산 및 관련 생식 구조는 F. oxysporum 에서 관찰 된 적이 없습니다. 그러나 병원균은 두 가지 유형의 무성 포자, 마이크로 및 마크로 코니디아뿐만 아니라 수년 동안 토양에서 생존 할 수있는 클라미도스 포자 (chlamydospores)라고 불리는 더 크고 장기적인 생존 구조를 생산합니다⁶.

FOSC는 관찰 된 숙주 범위에 따라 포르마 스페셜로 분류되며, 일반적으로 하나 또는 몇 개의 숙주 종¹로 제한됩니다. 최근의 연구에 따르면이 종 복합체는 15 종의 복합체 일 수 있지만 수박을 감염시키는 특정 종은 현재 알려지지 않았습니다⁷. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon)은 시트룰루스 라나투스 또는 길들여진 수박 ^8,9를 독점적으로 감염시키는 균주 그룹의 이름입니다. F. 대부분의 병원성 포르마 특산물 내의 옥시스포럼 균주는 그들의 유전 성분 및 숙주 종에 대한 독성과 관련하여 특정 수준의 다양성을 나타낸다. 예를 들어, 한 균주는 숙주의 모든 품종을 감염시킬 수 있지만 다른 균주는 더 취약한 품종 만 감염시킬 수 있습니다. 그러한 변이를 설명하기 위해, 이들 집단들은 진화적 관계들 또는 공통된 표현형 특성들에 기초하여 비공식적으로 종족들로 분류된다. 폰 내에서 네 종족 (0, 1, 2 및 3)은 선택된 수박 품종 세트에 대한 병원성을 기반으로 특성화되었으며, 최근¹⁰ 번 종족 3이 발견되었습니다.

이러한 명백한 다양성에도 불구하고, 포자 또는 균사의 형태학은 폰 종족의 종족들 사이에서 구별될 수 없으며, 이는 분리물의 독특한 인종⁽¹¹)을 확인하기 위해 분자 또는 표현형 분석이 필요하다는 것을 의미한다. 분자 연구는 몇 가지 유전 적 차이를 확인했습니다. 예를 들어, 자일렘에서 분비된 (SIX) 이펙터의 역할은 F. 옥시스포럼에서 수년간 연구되어 왔으며, 이들 이펙터 중 일부는 수평 유전자 전달¹² 동안 교환된 염색체 상에 위치되어 있다. 예를 들어, SIX6은 Fon 레이스 0과 1에서는 발견되지만 레이스 2¹³에서는 발견되지 않습니다. SIX 이펙터는 F. oxysporum f. sp. lycopersici 및 F. oxysporum f. sp. cubense의 병원성에 연루되어 토마토와 바나나에 Fusarium wilt를 각각^14,15,16,17로 일으킨다. 시금치의 Fusarium wilt 병원균 인 F. oxysporum f. sp. spiniciae의 균주 중 SIX 이펙터 프로파일을 분석함으로써 유전 적 및 표현형 다양성을 정확하게 반영하는 분류가 가능해졌습니다¹⁸. 그러나, 폰 종족의 독성 기작 사이의 차이는 현재 완전히 이해되지 않았으며, 그들의 사용에 따라 개발 된 분자 분석은 일관되지 않고 부정확 한 결과를 보여주었습니다¹⁹. 따라서, 감염 분석으로부터의 표현형 결과는 현재 단리물을 분류하는 가장 좋은 방법이다.

F. oxysporarum은 처음에는 자일렘²⁰을 올라가기 전에 뿌리를 통해 숙주를 감염시킵니다. 이것은 주어진 숙주 재배자의 뿌리를 직접 접종하여 인종 타이핑을 수행하는 효과적인 방법이되며 뿌리 딥 및 트레이 딥 접종 방법⁽²¹)의 기초가됩니다. 숙주를 감염시키지 않을 때, F. oxysporum은 토양에 거주하며 수년간 휴면 상태를 유지할 수 있습니다. 관심있는 분야에서 토양에서 감수성이있는 수박 품종을 재배하는 것은 Fon의 존재를 테스트하는 한 가지 방법입니다. 이 방법을 의도적으로 Fon에 감염된 토양에 다른 알려진 수준의 내성을 가진 품종을 포함하도록 확장하는 것도 인종 타이핑을 수행하는 좋은 방법이며 (표 1) 감염된 커널 파종 방법의 기초입니다. 변형된 트레이-딥 방법은 원래의 트레이-딥 방법의 변형으로, 많은 식물 및 현장 분리물을 신속하게 조사할 수 있는 고처리량 레이스 타이핑을 허용한다⁽²²). 신속하고 성공적인 인종 타이핑 생물 분석의 중요한 요인으로는 다양한 병원체 종족에 대한 내성의 차이를 문서화 한 품종 사용, 접종물이 감염 중에 생물학적으로 활성이고 풍부하다는 것을 보장, 병원체와 숙주에 도움이되는 환경 유지, 질병의 중증도 또는 발병률에 대한 일관된 평가 시스템 사용 등이 있습니다. 이 논문에서는 위에서 설명한 원칙에 따라 루트-딥 23,24, 감염된 커널 시드 25,26^, 및 표현형 레이스 타이핑을 위한 트레이-딥⁽²²) 방법을 수정한 것에 대해 설명한다.

1. 루트 딥 방법 (RDM)에 의한 레이스 결정

1. 실험 환경의 준비
   1. 증상 표현은 환경 조건에 크게 의존하기 때문에 통제 된 지역에 식물을 유지하십시오. 상대 습도, 온도, 광주기 및 광도를 모니터링합니다(그림 1).
      1. 온도를 26-28 °C, 상대 습도를 50-75 %로 설정하고 적절한 식물 성장과 건강을 보장하기 위해 16 시간 광주기를 설정하십시오.
         참고 : 저산소증, 묘목 시들음 및 / 또는 종자 부패를 방지하려면 물을 과도하게 섭취하거나 묘목 주위에 서있는 물을 허용하지 마십시오.
      2. 광합성 성장을 지원하기 위해 두 개의 형광 튜브 조명을 사용하는데, 각각 최소 1850루멘의 빛과 2,800K의 색온도를 가진 조명입니다.
      3. 지역을 깨끗하게 유지하고 해충 피해 및 부수적 인 감염을 방지하기 위해 폐기물 토양 및 식물 파편 제거를 포함한 위생 관행을 사용하십시오.
   2. 심기 조건
      1. 심기 배지로 시작 평지 8 x 16셀(폭 25cm x 길이 50cm)을 채우고 아래로 탭하여 토양을 약간 압축합니다(그림 2).
      2. 블랙 다이아몬드 / 슈가 베이비, 찰스턴 그레이 / 올스위트 / 딕시 엘리, 칼훈 그레이 및 PI-296341-FR의 네 가지 차동 품종의 씨앗을 얻으십시오.
      3. 그들의 정점 (뾰족한 끝)이 길이와 같은 깊이를 위쪽으로 향하게하는 씨앗을 뿌리십시오. 씨앗을 뿌린 후, 묻힌 씨앗을 포함하는 배지를 100 % 풀러 지구 또는 0.3175-0.635 cm의 깊이로 대체 된 다른 벤토나이트 점토로 덮으십시오.
      4. 평지를 안개로 만들어 서 있거나 물을 모으는 대신 매체를 감쇠시킵니다. 그 후, 180 분마다 20 초 동안 미스팅하거나 약 5 일 동안 종자가 발아 할 때까지 하루에 한 번 손으로 물을 주어 미디어를 촉촉하게 유지하십시오. 발아 후, 하루에 한 번, 그리고 묘목의 성장을 지원하기 위해 필요에 따라 물을주십시오.
   3. 미디어 준비
      참고 : 두 매체 모두 표면을 긁어서 포자 수확을 가능하게하기 위해 여분의 과립 화 된 한천으로 단단하게 만들어집니다.
      1. 명확한 V8 주스 배지 (V8)
         1. 500 mL의 정화된 V8 주스 배지(V8)^27을 1% CaCO3와 함께 1%_CaCO3 와 함께 정제된 V8 오리지널 100% 야채 주스 100 mL를 증류수 400 mL에 첨가하여 준비한다.
         2. 과립 한천 7.5g을 넣으십시오.
         3. 재료를 잘 섞고, 오토클레이브하고, 멸균된 페트리 접시에 붓기 전에 50°C까지 식히십시오.
      2. 쿼터 강도 감자 덱스트로스 한천 배지 (qPDA)
         1. 증류수 500 mL에 과립화 한천 4.5 g을 첨가하고, 감자 덱스트로스 한천 3.8 g을 첨가하여 qPDA 배지를 제조하였다.
         2. 재료를 잘 섞고, 오토클레이브하고, 멸균된 페트리 접시에 12-15 mL를 붓기 전에 50°C까지 식히십시오.
2. 실험적 치료법의 제조
   1. 접종물을 준비하십시오.
      1. 5일 후 심기(dpp), 바람직한 F. 옥시스포럼 을 함유하는 침윤된 종이 디스크(직경 1-1.25 cm)를 1개의 V8 및 1개의 qPDA 플레이트 상에 위치시키고, 이를^{8일 동안} 인큐베이터(∼28°C)에 보관한다(도 3A).
      2. 곰팡이 성장의 여덟 번째 날과 접종 전날 (섹션 1.3.2 참조), V8 및 qPDA 플레이트를 인큐베이터에서 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다.
      3. 각각의 분리물에 대해, 멸균된 탈이온수 6 mL를 각 V8 및 qPDA 배양 플레이트 상에 분배한다.
      4. 배지 표면을 가로질러 멸균된 세포 스프레더를 긁어내어 코니디아를 제거한다(그림 3B). 액체 침엽수 현탁액을 풀링하고 이를 멸균된 50 mL 배양 튜브로 옮긴다(도 3C).
      5. 50 mL 배양 튜브 내의 총 액체 침엽수 현탁액 부피가 대략 12 mL가 될 때까지 이 과정을 반복한다.
      6. 다른 분리물로 진행하기 전에, 작업 영역 및 세포 살포기를 알코올로 표면 멸균하십시오. 세포 스프레더를 ≥70% 에탄올에 담근 후 분젠 버너를 통과시켜 멸균한다.
      7. 일단 액체 침엽수 현탁액이 모든 단리물에 대해 배양 튜브로 옮겨지면, 포자 수를 정량화한다. 먼저, 개별 50 mL 배양 튜브를 와류하고, 10 μL를 혈소세포계의 각 챔버에 분배한다. 이어서, 앞서 기술한 바와 같이 혈구측정기 내의 포자의 수를 계산한다^{(도 29}).
      8. 계산된 부피 10⁶ + 10%를 다른 멸균 배양 튜브로 옮기고 멸균 탈이온수를 첨가하여 총 부피를 30 mL로 가져와 최종 접종액을 준비한다.
      9. 이들 배양 튜브를 8± 1°C에서 하룻밤 동안 보관한다.
         참고: 이 작업은 게시되지 않은 데이터로 표시된 대로 침엽수 생존 가능성의 손실 없이 수행할 수 있습니다.
3. 접종
   1. 예방 접종을 준비하십시오.
      1. 접종 당일 이전에, 열세 살짜리 묘목에 토양 운반 능력에 튼튼하게 물을 공급하십시오.
      2. 스테이크에 검사할 격리물, 수박 품종 및 접종 날짜를 포함한 관련 정보로 미리 라벨을 붙입니다.
      3. 6 x 12 세포 (폭 20cm x 길이 40cm) 스티로폼 플랫을 놓고 이전에 10 % 표백제로 소독하고 잘 헹구어 접종 된 식물을 접종받습니다.
      4. 필요한 모든 재료를 전치하십시오 ( 재료 표 참조).
   2. 식물 뿌리를 접종하십시오.
      1. 접종을 시작하기 몇 시간 전에 식물에 견고하게 물을줍니다. 물을 뿌린 후 적어도 2 시간 후에 8 x 16 셀 스티로폼 플랫에서 플랜틀릿을 제거하고 뿌리를 헹구어 부착 심기 재료 미립자를 제거하십시오.
      2. 헹군 식물을 사용할 때까지 수돗물로 깨끗한 용기에 임시로 보관하여 품종을 서로 분리시킵니다 (그림 4A). 묘목을 여섯 명으로 구성된 그룹으로 분리하고 묘목 그룹을 실험실 트레이에 젖은 종이 타월로 싸서 건조를 방지하십시오.
      3. 6 x 12 어레이 스티로폼 트레이의 각 셀의 바닥에 25-30cm3의 토양을 놓고 스쿼트 병을 사용하여 토양이 눈에 띄게 축축해질 때까지 적시십시오.
      4. 블랙 다이아몬드, 찰스턴 그레이, 칼훈 그레이 및 PI 296341 01 FR이 왼쪽에서 오른쪽으로 심어지도록 품종에 따라 식물을 접종하고 재배 재배에 따라 재배하십시오.
      5. 건강한 대조군으로 시작하여 동일한 재배자의 손상되지 않은 여섯 묘목 그룹을 접종물이 들어있는 50 mL 튜브에 넣으십시오. 건강한 대조군의 경우, 포자 현탁액 대신 수돗물을 사용하십시오. 마지막으로 양성 대조군(Fon race 3)으로 식물을 접종한다.
      6. 튜브 내부에 들어가면 식물 뿌리가 도달하여 접종물 (수돗물)에 노출되도록하십시오.
      7. 30초 동안 잠긴 식물렛 뿌리가 있는 튜브를 소용돌이치십시오(그림 4B). 볼텍싱 후, 6 x 12 스티로폼 플랫에 셀 당 하나의 플랜틀릿을 놓습니다. 같은 재배자의 식물을 트레이의 동일한 기둥에 놓습니다.
      8. 배치 후, 장갑을 낀 손을 0.7 % 사용 가능한 염소 용액의 양동이에 30 초 동안 담아 소독 한 다음 수돗물을 1 분 동안 헹구십시오.
      9. 그 후, 배치 된 플랜틀릿을 심는 매체로 덮고 부드럽게 설정하십시오. 주사기 또는 피펫을 사용하여 플래틀릿 당 20mL로 조심스럽게 식이통에 물을 주면서 튀는 것을 피하십시오.
      10. 다음 식물 세트로 진행하기 전에 염소 용액과 수돗물 헹굼을 사용하여 장갑을 낀 손을 다시 소독하십시오.
      11. 모든 식잇을 재배 한 후, 접종 유출을 방지하기 위해 최소한으로 다시 물을 공급하십시오.
      12. 평균 온도가 27°C인 밀폐된 어두운 환경에서 농장주를 하룻밤 동안 잡으십시오. 다음날 식물을 온실로 옮겨 평균 온도를 27 ° C로 유지하십시오.
4. 접종 된 식물의 유지 보수 및 관리
   1. 잉여 물의 범람을 방지하려면 식물이 안정 될 때까지 4-5 일 동안 하루에 세 번 가볍게 평지에 물을주십시오.
   2. 트레이를 매일 2-3 번 적어도 3 일 동안 점검하여 적절하고 균일 한 급수 범위를 확인하십시오.
   3. 햇빛이나 음영으로 인한 건조를 피하려면 플랫을 회전하거나 필요에 따라 추가 음영 / 급수를 제공하십시오.
   4. 3 dpp에서 물 리터 당 3-6 mL의 속도로 20-20-20 퀵 릴리스 비료 (10 g / 3.78 L)로 식물을 비옥하게하십시오.
   5. 매주 3-4 주 동안 비옥하게하십시오.
   6. 이 단계 전체에서 동일한 조명 및 환경 조건을 유지합니다.

2. 감염된 커널 방법 (IKM)에 의한 인종 결정

1. 커널의 침입
   1. 접종물을 준비하십시오.
      1. 저장된 또는 새로 수집된 샘플로부터, 그의 성장이 플레이트의 절반을 덮을 때까지 qPDA의 플레이트 상에서 관심있는 F. oxysporum f. sp. niveum 균주를 단리하고 배양한다.
         참고 : 이것은 그것이 활동적이고 실행 가능하다는 것을 보여 주며, 이는 이후 단계에서 곡물의 실질적인 침입에 필요합니다.
   2. 커널을 준비합니다.
      1. 규모에 따라 충분히 큰 용기에 호밀 (Secale spp.) 열매 (또는 Maxie var. 밀 (Triticum spp.) 커널) 200g을 측정하여 하나 이상의 1L 유리 삼각 플라스크에 부어 넣으십시오. 플라스크에 멸균 수돗물을 첨가하여 곡물을 최소 5cm까지 완전히 덮습니다(그림 5A).
      2. 커널을 실온 (~ 24 ° C)에서 2 시간 동안 담그십시오. 플라스크에서 물을 배수하십시오. 치즈 천으로 싸인 면봉 롤 조각으로 개구부를 꽂으십시오. 개구부를 알루미늄 호일 랩으로 덮습니다(그림 5B).
   3. 커널의 오염을 제거합니다. 곡물에 물이 흡수되면 접종 전에 다른 원치 않는 미생물을 죽이기 위해 두 가지 방법으로 두 번 오토클레이브하십시오.
      1. 첫 번째 시간 동안, 5 분 건조 시간으로 1 시간 동안 중력 사이클 (121.2 ° C, 1.06 kg /^cm2)에서 준비된 플라스크에서 곡물을 오토클레이브하십시오. 플라스크를 실온으로 식히십시오.
      2. 두 번째로 오토클레이빙하기 전에, 곡물을 0.5 μm 필터가 있는 작은 버섯 재배 백으로 옮기십시오. 가방에서 공기를 제거한 다음 여분의 플라스틱을 가방 주위에 접으십시오.
      3. 가방을 플라스틱 오토클레이브 안전 쓰레기통에 넣으십시오. 빈을 알루미늄 호일 랩으로 덮습니다(그림 5C).
         참고: 가방에 있는 알갱이를 오토클레이빙할 때는 가방이 녹을 수 있으므로 금속 통을 사용하지 마십시오.
      4. 이전과 동일한 사이클의 건조 시간 5 분으로 1 시간 동안 중력주기에서 빈을 오토클레이브하십시오.
         참고: 가방을 두 번 오토클레이브하면 필터와 포트가 손상될 수 있으므로 첫 번째 가방이 아닌 두 번째 경우에만 가방을 오토클레이브하십시오. 젖은 경우 성장 백 필터가 손상되기 때문에 오토클레이브에서 가방을 제거하기 전에 가방을 천천히 완전히 식혀 필터의 결로를 방지하십시오.
   4. 커널을 접종하십시오.
      1. 생물 안전 캐비닛에서 배양 플레이트와 가방을 사용하여 멸균 된 # 4 크기의 코르크 보어로 배양 접시의 활성 성장 영역에서 직경 6mm의 한천 디스크를 자릅니다. 가방을 펼칩니다. 엄격한 멸균 기술을 사용하여 가방에 5 개의 한천 디스크를 넣으십시오. 멸균 50mL 눈금 실린더를 사용하여 멸균 수돗물 35mL를 측정하고 가방에 넣으십시오.
      2. 가방의 개구부를 약간 굴린 다음 70 % 에탄올로 외부에 스프레이하여 표면을 살균하십시오.
         참고: 습기가 손상될 수 있으므로 필터를 스프레이하지 마십시오.
      3. 모서리를 가운데쪽으로 접은 다음 필터 위에서 두 번 이상 접어서 가방을 닫습니다. 가방 클램프와 제조업체가 제공 한 투명 비닐 튜브로 가방을 고정하십시오.
         주: 클램프는 재사용할 수 있습니다.
      4. 생물 안전 캐비닛에서 가방을 꺼냅니다.
   5. 성장을 위해 병원균을 보관하십시오.
      1. 가방을 똑바로 보관하십시오. 최대 가스 교환이 가능하도록 필터를 가방의 반대쪽에서 떼어내십시오(그림 5D).
      2. 물질을 실온에서 대략 삼 주 동안 인큐베이션한다. 병원균의 성장을 보장하기 위해 곡물을 정기적으로 재분배하십시오.
         참고: 가방은 재사용할 수 없습니다.
2. 수박 묘목에 감염된 곡물 감염
   1. 앞서 설명한 바와 같은 수박 씨앗 공급원.
   2. 실험 그룹을 결정하십시오.
      참고 : 필요한 병원균의 유일한 균주는 인종 식별을 위해 테스트되는 분리 물입니다. 그러나 음성 및 양성 대조군은 감염이 없거나 특정 수준의 감염이있는 식물과 비교하는 데 도움이됩니다.
      1. 음성 대조군을 준비하려면 앞서 언급 한 방법에 따라 멸균 된 밀 커널을 사용하지만 접종하지 마십시오.
      2. 양성 대조군을 준비하려면 미지의 단리물과의 비교를 위해 이미 분류된 균주가 접종된 밀 커널을 사용하십시오.
   3. 토양과 곡물을 결합하십시오.
      1. 감염된 커널 14알을 큰 비닐 봉지에 넣습니다(그림 5E). 플라스틱 냄비 (직경 15cm x 높이 10cm)를 포팅 믹스로 채워 필요한 혼합량을 측정하십시오. 믹스를 가방에 비우십시오. 가방에 에어 쿠션을 만들고 닫은 부분을 비틀거나 밀봉하십시오.
      2. 가방을 여러 번 뒤집어서 커널과 토양을 섞으십시오. 네거티브 컨트롤의 경우 깨끗한 커널이있는 다른 백에서 동일한 프로세스를 수행하십시오. 양성 대조군의 경우, 비교 균주에 감염된 커널이있는 다른 가방에서 동일한 과정을 수행하십시오.
      3. 네 개의 표면 살균 된 냄비를 감염된 토양 혼합물로 채 웁니다. 음성 대조군의 경우, 폰으로 오염 된 토양을 다루기 전에 혼합 된 냄비.
   4. 수박 씨앗을 뿌리십시오.
      1. 각 냄비에 여섯 개의 씨앗을 뿌린다. 각 냄비에 한 품종의 씨앗 만 들어 있는지 확인하십시오. 씨앗의 정점 끝이 위를 향하도록 씨앗을 올려 놓으면 출현 중에 적절한 성장이 가능합니다 (그림 6A).
      2. 스프레이 병을 사용하여 0.3-0.6cm의 토양 상부를 물로 적시십시오. 투명한 플라스틱 접시(직경 15cm)를 각 냄비 아래 및 위에 놓아 종자 발아를 위한 습한 환경을 조성합니다(그림 6B).
   5. 성장 조건을 수립하십시오.
      1. 씨앗이 발아 할 때까지 (약 5 일) 유출없이 turgidity를 유지하기 위해 스프레이 병으로 하루에 세 번 냄비에 물을 뿌리십시오.
         참고 : 사용되는 물의 양은 식물 크기와 냄비 크기에 따라 증가합니다.
      2. 씨앗이 발아하면 상단 접시를 냄비 아래쪽으로 옮깁니다.
      3. 최적의 식물 성장을 위해 필요에 따라 매일 식물에 물을 공급하십시오. 식물을 앞서 기술된 것과 유사한 조명 조건 및 27°C(± 1°C)의 온도 하에서 16시간 광주기로 노출시킨다.

3. 수정 된 트레이 딥 방법 (MTDM)에 의한 레이스 결정

1. 접종을 위한 물질의 제조
   1. 심기 조건을 수립하십시오.
      1. 48 셀 (폭 3.68cm x 길이 5.98cm x 깊이 4.69cm)을 증기 저온 살균 모래 : 이탄 : 질석 (4 : 1 : 1)으로 채우고 아래로 두드려 토양을 약간 압축하십시오. 삽입물을 플라스틱 트레이(폭 27.9cm x 길이 53.3cm x 깊이 5.1cm)에 넣습니다.
      2. 그들의 정점 (근위 끝)이 길이와 같은 깊이로 위쪽을 가리키는 씨앗을 뿌린다.
      3. 앞서 설명한 대로 씨앗을 소싱합니다.
      4. 그 후, 180 분마다 20 초 동안 미스팅하거나 하루에 한 번 손으로 물을 주어 미디어를 촉촉하게 유지하십시오.
      5. 발아 후 (약 5 일), 하루에 한 번 그리고 필요에 따라 묘목의 성장을 지원하기 위해 물.
   2. 미디어를 준비합니다.
      1. 증류수 500 mL에 과립화 한천 5.625 g을 첨가하여 qPDA 배지를 제조하는 단계; 감자 덱스트로스 한천 4.875g을 첨가하십시오. 재료를 잘 섞고, 오토클레이브하고, 멸균된 페트리 접시에 붓기 전에 50°C로 식히십시오. 페트리 접시를 파라필름으로 밀봉하고 접시를 사용할 때까지 냉장고(4°C)에 보관하십시오.
      2. 국물 배지를 준비하려면 무게를 측정하고 감자 덱스트로스 24g을 1L 병에 넣으십시오. 병에 증류수를 첨가하여 혼합물을 1000 mL로 가져 와서 병을 핫 플레이트에 놓고 용해 될 때까지 저어줍니다. 국물 100mL를 250mL 삼각플라스크에 분배한다. 치즈 천을 사용하여 플라스크와 오토클레이브를 밀봉하십시오.
   3. 접종물을 준비하십시오.
      1. 심기 7일 전에, 다섯 개의 qPDA 플레이트를 침윤된 종이⁽²⁸ )로 접종하고, 14h/10 h 암주기(²²)에서 8일 동안 배양된 영역에 보관한다.
      2. 일곱째 날, 1cm 2 한천 플러그^{2개를 100mL} 감자 덱스트로스가 들어있는 각 250mL 삼각 플라스크에 옮깁니다. Erlenmeyer 플라스크를 벤치탑 쉐이커에 200rpm으로 7일 동안 14시간/10시간 밝은/어두운 주기로 놓습니다.
      3. 접종 당일 (파종 후 14 일)에 멸균 된 치즈 천의 네 층을 통해 접종물을 여과하여 포자를 수확하십시오.
      4. 앞서 기술한 바와 같이 혈구세포계를 사용하여 플라스크 내의 미세원추형 농도를 결정한다. 플라스틱 욕조 (폭 40.6 cm x 길이 67.3 cm x 깊이 16.8 cm)에 7 L 접종물 현탁액을 준비하여 정확한 부피의 포자 현탁액을 멸균수로 옮겨 최종 포자 농도 1 ×^{6 mL-1} (그림 7A)를 준비하십시오 (그림 7A).
2. 접종
   1. 파종 후 14 일 (적어도 첫 번째 진정한 잎 단계), 묘목이있는 세포 삽입물을 웹베드 트레이 (폭 26.9cm x 길이 53.7cm x 깊이 6.28cm)로 옮깁니다. 묘목이 있는 웹베드 트레이를 7L 접종 현탁액이 들어있는 플라스틱 욕조에 부드럽게 넣습니다. 각 트레이를 한 번에 하나씩 접종한다(그림 7B).
   2. 묘목이 15 분 동안 방해받지 않고 접종물에 남아 있도록하십시오. 15분 후, 접종된 묘목을 포함하는 세포 삽입물을 구멍이 없는 트레이(폭 27.9cm x 길이 53.3cm x 깊이 5.1cm)로 부드럽게 옮깁니다. 각 트레이에 대해 이 과정을 반복합니다.
   3. 필요에 따라 구멍이없는 트레이를 온실 벤치와 물에 놓습니다. 뿌리딥 생물분석법에 대해 기재된 바와 동일한 조명 및 환경 조건을 유지한다.

4. 질병 등급

1. 등급에 대한 시간 간격을 선택합니다.
   1. 뿌리 딥 및 수정 된 트레이 딥 방법의 경우, 플랜틀릿이 접종 된 후 일주일 후에 등급을 매기고 네 주 더 매주 계속하십시오.
      참고: 결합된 데이터 세트에는 이 기간 동안 다섯 개의 관측치 집합이 포함됩니다.
   2. 커널 방법을 사용하는 동안, 묘목이 출현 한 후에 만 등급을 시작하고 매주 총 여섯 가지 등급을 계속합니다.
2. 발생률을 관찰하고 계산하십시오.
   1. 각 등급 중에 디지털 이미지를 촬영하여 질병 진행 상황을 문서화하십시오.
   2. 시들음과 식물 사망의 발생률을보고하십시오. 건강한 대조군과 비교하여 증상이있는 식물의 합과 죽은 식물의 수를 해당 품종의 총 식물 수의 비율로 취하여 발생률을 계산하십시오.
3. 결과를 분석합니다. 대조군이 사용 된 경우 품종 간 및 실험 그룹 간의 감염 패턴을 비교하십시오.

이러한 실험은 일반적으로 재배되는 품종의 상대적 저항을 정의하는 데 도움이됩니다 (표 1). 그런 다음 이 정보를 사용하여 지역 Fon 인구를 기반으로 관리 권장 사항을 안내할 수 있습니다. 즉, 인종 0 또는 1이 상업 분야에 존재하는 것으로 알려져 있다면, 농부는 칼훈 그레이, 선슈가 또는 이와 동등한 것과 같은 "내성적인"품종을 재배하는 경향이 있습니다. 모든 방법을 사용한 생물 분석의 결과는 묘목이 Race 1 분리 물에 감염되었을 때 Black Diamond와 Charleston Grey 품종이 사망하거나 심각한 증상을 보인 반면, Calhoun Grey 및 PI 품종은 내성을 보였다 (표 2 및 그림 8A).

모든 방법은 묘목이 Race 3 격리물에 감염되었을 때 모든 품종의 거의 모든 식물이 사망하거나 심각한 증상을 보였다는 것을 보여주었습니다 (그림 8B). 이 결과는 두 가지 접종 방법을 사용하는 생물 분석법이 Fon의 인종을 성공적으로 구별하는 방법을 보여줍니다. 병든 식물의 출현은 모든 방법에 대해 동일해야합니다. 유일한 차이점은 품종이 공간적으로 그룹화되는 방식입니다. 뿌리 딥 및 수정 된 드레이 딥 방법의 경우, 품종은 트레이의 기둥으로 구성되지만 커널 방법에서는 품종을 자체 냄비에 그룹화합니다.

그림 1: RDM에 대한 실험 영역. 상대 습도, 온도, 광주기, 광도 및 광도와 같은 환경 조건에 크게 의존하는 증상 변동성으로 인해 규제 된 실험 영역을 유지하는 것이 중요합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: RDM용 시작 아파트 준비 심기 배지로 평지를 시작하는 8 x 16 셀 (너비 25cm x 길이 50cm)을 채우고 아래로 두드려 토양을 약간 압축하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3: RDM용 원추형 현탁액의 제조. (A) 분리 및 배양. 저장된 또는 새로 수집된 샘플로부터, 그의 성장이 플레이트의 절반을 덮을 때까지 qPDA의 플레이트 상에서 관심있는 F. oxysporum f. sp. niveum 균주를 단리하고 배양한다. 이것은 그것이 활동적이고 실행 가능하다는 것을 보여 주며, 이는 나중 단계에서 곡물의 실질적인 침입에 필요합니다. (B) 코니디아 해산. 배지 표면을 가로 질러 멸균 된 세포 스프레더를 긁어 코니디아를 제거합니다. (C) 서스펜션 증착. 액체 코니디아 현탁액을 풀링하고 멸균된 50 mL 배양 튜브로 옮긴다. 약어 : qPDA = 일분기 강도 감자 덱스트로스 한천 배지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4 : RDM을위한 묘목의 조직 및 볼텍싱. (A) 품종의 분리. 헹굼 된 식물을 사용할 때까지 수돗물로 깨끗한 용기에 일시적으로 보관하여 품종을 분리하십시오. (B) 묘목의 소용돌이. 6 x 12 스티로폼 플랫에 셀 당 하나의 플랜틀릿을 심기 위해 30 초 동안 잠겨있는 플랜틀릿 뿌리가있는 튜브를 소용돌이치십시오. 동일한 재배자의 식물은 트레이의 동일한 기둥에 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5 : IKM에 대한 커널의 준비 및 감염. (A) 호밀 열매의 흡수. 규모에 따라 충분히 큰 용기에 호밀 (Secale spp.) 열매 (또는 Maxie var. 밀 (Triticum spp.) 커널) 200g을 측정하여 하나 이상의 1L 유리 삼각 플라스크에 부어 넣으십시오. 플라스크에 멸균 수돗물을 넣어 곡물을 최소 5cm까지 완전히 덮으십시오. (B) 플라스크를 배수하십시오. 플라스크에서 물을 빼내고, 치즈 천으로 싸인 면봉 롤 조각으로 개구부를 막고, 개구부를 알루미늄 호일 랩으로 덮으십시오. (C) 오토클레이브 설정. 가방을 플라스틱 오토클레이브 안전 쓰레기통에 넣으십시오. 가방의 곡물을 오토 클레이빙 할 때 가방이 녹을 수 있으므로 금속 통을 사용하지 마십시오. 빈을 알루미늄 호일 랩으로 덮으십시오. (D) 가방의 보관. 가방을 똑바로 보관하십시오. 최대한의 가스 교환이 가능하도록 필터를 가방의 반대쪽에서 떼어 내십시오. (E) 감염된 커널 14 알갱이를 큰 비닐 봉지에 넣는다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6 : 수박 씨앗의 파종 및 발아. (A) 화분에 재배 씨앗을 파종한다. 각 냄비에 여섯 개의 씨앗을 뿌린다. 각 냄비에 한 품종의 씨앗 만 들어 있는지 확인하십시오. 씨앗의 정점 끝이 위를 향하도록 씨앗을 배치하여 출현 중에 적절한 성장을 허용하십시오. (B) 종자 발아. 스프레이 병을 사용하여 0.3-0.6cm의 토양 상부를 물로 적시십시오. 각 냄비 아래 및 위에 투명한 플라스틱 접시 (직경 15cm)를 놓아 종자 발아를위한 습한 환경을 조성하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 7: MTDM에 대한 접종 준비 및 묘목 접종. (A) 접종물의 제조. 앞서 기술한 바와 같이 혈구세포계를 사용하여 플라스크 내의 미세원추형 농도를 결정한다. 플라스틱 욕조 (폭 40.6 cm × 길이 67.3 cm × 깊이 16.8 cm)에서 7 L 접종물 현탁액을 준비하여 정확한 부피의 포자 현탁액을 멸균수로 옮겨 최종 포자 농도 1 ×^{6 mL-1}을 제조하였다. (B) 묘목을 접종하는 것. 파종 후 14 일 (적어도 첫 번째 진정한 잎 단계) 묘목이있는 세포 삽입물을 웹베드 트레이 (폭 26.9cm × 길이 53.7cm × 깊이 6.28cm)로 옮깁니다. 묘목이 있는 웹베드 트레이를 7L 접종 현탁액이 들어있는 플라스틱 욕조에 부드럽게 넣습니다. 각 트레이를 한 번에 하나씩 접종하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: 인종 식별 방법의 표현형 결과. (A) 레이스 1 결과. (A) 모든 방법을 사용한 생물 검정의 결과는 묘목이 Race 1 분리 물에 감염되었을 때 Black Diamond와 Charleston Grey 품종이 사망하거나 심각한 증상을 보인 반면, Calhoun Grey 및 PI 품종은 내성을 보였다는 것을 보여줍니다. (B) 레이스 3 결과. 모든 방법은 묘목이 Race 3 격리 물에 감염되었을 때 모든 품종의 거의 모든 식물이 사망하거나 심각한 증상을 보였다는 것을 보여주었습니다. (병든 식물의 출현은 모든 방법에 대해 동일해야합니다. 화살표로 표시된 심기 순서 (왼쪽에서 오른쪽으로) : 블랙 다이아몬드 (파란색 화살표), 찰스턴 그레이 (자주색 화살표), 칼훈 그레이 (갈색 화살표), 식물 소개 296341-FR (녹색 화살표). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: Fusarium oxysporum f. sp. 니벳. Fusarium oxysporum f. sp. niveum의 인종은 일련의 수박 차동에 대한 민감하거나 내성 반응에 의해 결정됩니다. 각 행에 열거 된 품종은 고립 된 인종의 평가 중에 각 수준의 저항을 나타내는 데 가장 많이 사용됩니다. 이 테이블은 ⁴에서 수정되었습니다. 약어: S = 감수성; R = 내성.

표 2: 인종의 식별. 이 표에 사용 된 값은 건강한 대조군과 비교하여 증상이있는 식물의 발생률 또는 수를 반영하고, 죽은 식물의 수를 해당 품종의 총 식물 수의 비율로 반영합니다. 각 세포의 숫자는 관찰 기간이 끝날 때보고 된 발생률을 반영합니다. 재배자는 해당 재배자의 식물의 적어도 1/^{3 또는} 33 %가 증상이 있거나 죽었을 때 감수성이있는 것으로 간주됩니다. 병원균의 인종은 어떤 품종이 감수성이있는 것으로 간주되었는지에 따라 결정됩니다. 다른 말로하면, 병원균이 저항력이 증가하는 품종에 대해 어떻게 수행되는지가 격리 된 품종의 인종을 결정합니다. 이러한 결과는 실제 시험에서 나온 것이 아니며 오히려 이러한 방법의 결과에서 인종이 어떻게 식별되는지를 전달하는 것으로 나타났습니다. 약어: MTD = 변형된 트레이-드립 방법; BD = 블랙 다이아몬드; CH. G = 찰스턴 그레이; 칼 G. = 칼훈 그레이; PI = 식물 소개 296341-FR; S = 증상; AS = 무증상.

레이스 타이핑의 세 가지 방법이 제시되었습니다. 이러한 각 방법은 특정 질문 및 실험 조건에 가장 적합합니다. 감염된 커널 접종 방법 (토양 침입)은 아마도 더 간단하고 간단하여 병원성³⁰의 평가에 특히 유용합니다. 간단한 레이스 타이핑을 위해이 방법을 사용하는 것이 매우 효과적입니다. 그러나 특정 품종의 저항력을 결정하는 방법을 적용하는 것은 각 식물이 동일한 정도의 감염 또는 노출에 직면하지 않을 수 있으며 관심있는 품종의 저항력을 테스트하기 위해 똑같이 높은 수준의 질병이 필요할 수 있다는 점을 감안할 때 어려울 수 있습니다. 이는 이러한 방식으로 생산된 접종물이 잘 정량화되지 않기 때문에, 생존 가능한 프로파귤류의 비율, 또는 뿌리 영역에 도달하는 감염성 프로파귤류의 수가 잘 조절되지 않기 때문이다⁽³¹). 또한이 방법은 심은 커널과 루트 영역의 근접성의 불일치로 인해 제한됩니다. 너무 멀리 떨어져 있으면 포자가 발아하지 않거나 균사가 뿌리에 도달할만큼 충분히 발달하지 못할 수 있습니다.

루트-딥 방법(^32,33)은 더 힘들고 시간이 많이 걸린다. 그러나, 식물과 상호작용하는 실행 가능한 프로파귤류의 양이 보다 정확하게 측정되기 때문에, 숙주 저항은 더 정확하게 설명될 수 있고, 저항 스크리닝을 용이하게 할 수 있다. 또한, 동일한 인종 내에서 독성의 차이를보다 쉽게 발견 할 수 있습니다. 이 방법은 일반적으로 식물이 커널 방법보다 더 일찍 그리고 더 표현적으로 증상이 나타난다는 추가적인 이점을 가지고 있습니다. 코니디아 대신 접종 현탁액에서 클라미도포자를 사용하는 뿌리딥 방법의 한 변형은 이러한 이점이 부족할 수 있다⁶. 유사하게, 변형된 트레이-딥 방법(²²)은 노동 집약적이지만, 많은 단리물 및 묘목이 스크리닝될 필요가 있을 때 높은 처리량의 표현형을 허용한다.

세 가지 방법에 대한 공유 요소에는 재배자 선택, 성장 조건 및 위생 요구 사항이 포함됩니다. 상업적으로 이용 가능한 것에 따라, 특정 품종은^21,34로 대체 될 수 있습니다. 슈가 베이비와 블랙 다이아몬드는 모두 레이스 0 격리물을 결정하는 데 사용할 수 있으며, 찰스턴 그레이, 올스위트, 딕실레는 레이스 0에 내성이 있지만 레이스 1에 취약하다고 묘사되어 있습니다. 칼훈 그레이와 선슈가는 0과 1 레이스에 강하고 레이스 2와 3에 취약합니다. 폰병 발병은 온도에 크게 의존한다. 실험 조건이이 변수에 대해 제어되도록주의해야합니다. 심는 매체를 선택할 때, 이탄 이끼 및 / 또는 석고를 포함하고 좋은 폭기를 허용하는 일반적인 상업적 혼합은 만족 스러워야합니다. 두 가지 방법 모두, 특히 소스 백에서 심기 매체의 교차 오염을 방지하기 위해 예방 조치를 취해야합니다.

기술된 방법 중 하나를 사용한 후, 질병은 정확하고 일관되게 평가되어야 한다. 이전의 연구자들은 일반적으로 식물이 민감하거나 내성이 강한^35,36으로 분류되는 임계 값을 결정했습니다. 예를 들어, 특정 재배자의 식물의 33 % 미만이 증상이있는 경우, 그 재배자는 재배자의 감수성 프로파일과 관련하여 정의 된 격리물에 내성이있는 것으로 분류 될 것입니다. 임계 값 세트는 연구자와 그들이 다루고자하는 질문에 의해 정의됩니다. 평가자와 식물 사이의 동일한 평가자에 의한 사이의 가변성은 널리 보고되었다^37,38. 사용된 종자의 질, 토양 품질, 접종 밀도, 격리물의 저장 연령 및 평가자 편향^39,40과 같은 요인들은 모두 이러한 가변성에 기여한다⁸. 접종 및 PI 재배 반응의 이러한 가변성으로 인해 여러 실험 복제가 필요합니다. 이상적으로는 적어도 세 개이지만 다섯 개의 복제가 권장되며, 복제당 다양한 복제당 6개의 플랜트가 있습니다.

Fon 단리물 41,42,43을 검출하기 위해 분자 분석법이 개발되었지만, F. oxysporum의 폴리필 레틱 특성과 복합체 ^44,45,46종의 지리적 및 게놈 가변성으로 인해 결과가 일치하지 않았다. 또한, 선행 연구가 완전한 독성에서 자일렘 분비 (SIX) 이펙터의 중요성을 확립했지만, 폰 분리 물의 인종 구조를 정의하는 이펙터의 정확한 보완은 아직 결정되지 않았다¹³. 인종에 대한 분자 진단은 여전히 개발되고 있으며, 이러한 표현형 기술은 Fon 레이스 타이핑^19,47에서 정확성과 유용성을 평가하는 데 중요합니다.

저자들은 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

우리는 알리 박사와 식물 분자 진단 연구소뿐만 아니라 조지아 대학의 Pingsheng Ji 박사를 인정하고 싶습니다.이 박사의 리더십과 지원은 Fon 프로그램을 수립하는 데 도움이되었습니다.