ניגוד בין שלוש טכניקות חיסון המשמשות לקביעת הגזע של פוסאריום אוקסיספורום לא ידוע f.sp. niveum מבודד

ניהול Fusarium wilt של אבטיח דורש ידע על גזעי הפתוגנים הקיימים. כאן נתאר את טבילת השורשים, זריעת הגרעינים שורצי השורשים ושיטות החיסון המתוקנות של טבילת מגשים כדי להדגים את יעילותן בהקלדת גזע של הפטרייה הפתוגנית Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

Fusarium wilt של אבטיח (Citrullus lanatus), הנגרם על ידי Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), התחדש כמגבלת ייצור מרכזית בדרום מזרח ארה"ב, במיוחד בפלורידה. פריסה של אסטרטגיות משולבות להדברת מזיקים, כגון זנים עמידים ספציפיים לגזע, דורשת מידע על המגוון וצפיפות האוכלוסייה של הפתוגן בשדות המגדלים. למרות התקדמות מסוימת בפיתוח כלי אבחון מולקולריים לזיהוי מבודדים של פתוגנים, קביעת גזע דורשת לעתים קרובות גישות של בדיקה ביולוגית.

הקלדת הגזעים נערכה על ידי חיסון טבילת שורשים, שיטת זריעת גרעינים שורצת, ושיטת טבילת המגש המתוקנת עם כל אחד מארבעת הפרשי האבטיחים (יהלום שחור, צ'רלסטון גריי, Calhoun Grey, מבוא לצמח 296341-FR). מבודדים מוקצים ייעוד גזע על ידי חישוב שכיחות המחלה חמישה שבועות לאחר החיסון. אם פחות מ-33% מהצמחים של זן מסוים היו סימפטומטיים, הם סווגו כעמידים. אותם זנים עם שכיחות של יותר מ-33% נחשבו רגישים. מאמר זה מתאר שלוש שיטות שונות של חיסון כדי לוודא גזע, טבילת שורשים, גרעין שורץ וחיסון טבילת מגשים שונה, שהיישומים שלהן משתנים בהתאם לתכנון הניסויי.

הפטריות הנישאות בקרקע המרכיבות את קומפלקס המינים Fusarium oxysporum (FOSC) הן פתוגנים צמחיים המיביוטרופיים בעלי השפעה שיכולים לגרום למחלות קשות ולאובדן יבולים במגוון רחב של גידולים¹. Fusarium wilt של אבטיח, הנגרם על ידי F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), גדל בהיקפו, בשכיחותו ובחומרתו ברחבי העולם בעשורים האחרונים ^2,3. בשתילים, הסימפטומים של Fusarium wilt לעתים קרובות דומים דעיכה- off. בצמחים מבוגרים יותר, העלווה הופכת לאפורה, כלורוטית ונמקית. בסופו של דבר, ההסתערות על הצמחים מתקדמת לקריסת צמחים מלאה ולמוות⁴. אובדן יבול ישיר מתרחש עקב הסימפטומים ומוות הצמח, בעוד שאובדן יבול עקיף יכול להתרחש עקב נזקי שמש הנגרמים על ידי חיסול חופת העלווה⁵. רבייה מינית ומבני רבייה נלווים מעולם לא נצפו ב- F. oxysporum. עם זאת, הפתוגן מייצר שני סוגים של נבגים א-מיניים, מיקרו ומקרוקונידיה, כמו גם מבני הישרדות גדולים יותר לטווח ארוך הנקראים כלמידוספורים, שיכולים לשרוד באדמה במשך שנים רבות⁶.

ה-FOSC מסווג ל-formae speciales בהתבסס על טווחי פונדקאים שנצפו, בדרך כלל מוגבלים לאחד או לכמה מינים מארחים¹. למרות שמחקרים אחרונים הצביעו על כך שקומפלקס מינים זה עשוי להיות מורכב של 15 מינים שונים, המינים המסוימים שמדביקים אבטיח אינם ידועים כיום⁷. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) הוא השם לקבוצות הזנים המדביקות באופן בלעדי את Citrullus lanatus או את האבטיח המבוית ^8,9. F. זני oxysporum בתוך רוב זני הפורמה הפתוגניים מציגים רמות מסוימות של מגוון ביחס למרכיבים הגנטיים שלהם ולאלימות שלהם כלפי מין פונדקאי. לדוגמה, זן אחד עשוי להדביק את כל המינים של הפונדקאי, בעוד שזן אחר עשוי להדביק רק את המינים הרגישים יותר. כדי להסביר שונות כזו, קבוצות אלה מסווגות באופן לא רשמי לגזעים המבוססים על יחסים אבולוציוניים או מאפיינים פנוטיפיים נפוצים. בתוך פון, ארבעה גזעים (0, 1, 2 ו-3) אופיינו על סמך הפתוגניות שלהם נגד קבוצה של זני אבטיחים נבחרים, כאשר הגילוי של גזע 3 התרחש לאחרונה¹⁰.

למרות המגוון לכאורה הזה, לא ניתן להבחין בין המורפולוגיות של הנבגים או ההיפרים בין הגזעים של גזעי פון, כלומר יש צורך בבדיקות מולקולריות או פנוטיפיות כדי לזהות את הגזע הייחודי של מבודד¹¹. המחקר המולקולרי זיהה כמה הבדלים גנטיים. לדוגמה, תפקידם של אפקטים מופרשים בקסילם (SIX) נחקר במשך שנים ב- F. oxysporum, וחלק מהאפקטים הללו אותרו על הכרומוזומים שהוחלפו במהלך העברת גנים אופקית¹². לדוגמה, SIX6 נמצא במירוצי Fon 0 ו-1 אך לא במרוץ 2¹³. שישה משפיעים היו מעורבים בפתוגניות של F. oxysporum f. sp. lycopersici ו- F. oxysporum f. sp. cubense, הגורמים Fusarium wilt על עגבנייה ובננה, בהתאמה 14,15,16,17. הניתוח של שישה פרופילי אפקטור בקרב זנים של F. oxysporum f. sp. spiniciae, הפתוגן Fusarium wilt על תרד, אפשר סיווג המשקף במדויק את המגוון הגנטי והפנוטיפי¹⁸. עם זאת, ההבדלים בין מנגנוני האלימות של גזעי פון אינם מובנים כיום לחלוטין, ובדיקות מולקולריות שפותחו עם השימוש בהם הראו תוצאות לא עקביות ולא מדויקות¹⁹. לכן, תוצאות פנוטיפיות מבדיקות זיהום הן כיום הדרך הטובה ביותר לסווג מבודדים.

F. oxysporum מדביק בתחילה פונדקאים דרך השורשים לפני שהוא עושה את דרכו במעלה ה-xylem²⁰. זה הופך את החיסון הישיר של השורשים של זן מארח נתון לדרך יעילה לבצע הקלדת גזע והוא הבסיס לשיטות חיסון השורשים-טבילה ומגש-טבילה²¹. כאשר לא מדביקים פונדקאי, F. oxysporum שוכן באדמה ויכול להישאר רדום במשך שנים. גידול זני אבטיח רגישים בקרקע משדה עניין הוא אחת הדרכים לבחון את נוכחותו של פון. הרחבת שיטה זו כך שתכלול תרבויות של רמות עמידות ידועות שונות בקרקע, השורצות במכוון בפון, היא גם דרך טובה לבצע הקלדת גזעים (טבלה 1) והיא הבסיס לשיטת זריעת הגרעינים שורצי הגלעין. שיטת טבילת המגש המתוקנת היא וריאציה של שיטת טבילת המגש המקורית המאפשרת הקלדת גזע בתפוקה גבוהה שבה ניתן לחקור במהירות²² צמחים רבים ומבודדי שדה. גורמים חשובים לבדיקה ביולוגית מהירה ומוצלחת של הקלדת גזע כוללים שימוש בתרבויות שתיעדו הבדלים בעמידות לגזעי הפתוגנים השונים, הבטחה שהאינוקולום פעיל ביולוגית ושופע במהלך ההדבקה, שמירה על סביבה שתורמת גם לפתוגן וגם לפונדקאי, ושימוש במערכת דירוג עקבית לחומרה או לשכיחות המחלה. מאמר זה מתאר את טבילת השורש ^23,24, זריעת גרעינים שורצי^25,26, ושיטות טבילת מגש²² מותאמות להקלדה פנוטיפית של גזע על בסיס העקרונות שתוארו לעיל.

1. קביעת גזע בשיטת טבילת שורשים (RDM)

1. הכנת הסביבה הניסויית
   1. מכיוון שביטוי הסימפטומים תלוי מאוד בתנאים סביבתיים, שמרו על צמחים באזור מבוקר. עקוב אחר הלחות היחסית, הטמפרטורה, הפוטופריוד ועוצמת האור (איור 1).
      1. קבעו את הטמפרטורה ל-26-28 מעלות צלזיוס, הלחות היחסית ל-50-75%, וקבעו פוטופריוד של 16 שעות כדי להבטיח צמיחה ובריאות נאותים של הצמחים.
         הערה: כדי למנוע היפוקסיה, שתילים מתפתלים ו/או ריקבון זרעים, אין להשקות יתר על המידה או לאפשר מים עומדים סביב השתילים.
      2. השתמש בשתי נורות צינור פלואורסצנטיות, שכל אחת מהן מכילה לפחות 1850 לומן של אור וטמפרטורת צבע של 2,800 K לכל בנק אורות כדי לתמוך בצמיחה פוטוסינתטית.
      3. שמרו על ניקיון האזור והשתמשו בשיטות היגייניות, כולל פינוי פסולת קרקע ופסולת צמחים, כדי למנוע נזקי מזיקים וזיהומים מקריים.
   2. תנאי השתילה
      1. מלאו 8 X 16 תאים (25 ס"מ רוחב x 50 ס"מ אורך) והתחילו שטוחים עם מדיום שתילה והקשו למטה כדי לדחוס מעט את הקרקע (איור 2).
      2. השג זרעים של ארבעת המינים הדיפרנציאליים: יהלום שחור/שוגר בייבי, צ'רלסטון גריי/Allsweet/Dixielee, קלהון גריי ו-PI-296341-FR.
      3. זורעים זרעים עם הפסגה שלהם (קצה מחודד) המצביעים כלפי מעלה לעומק השווה לאורכם. לאחר שהזרעים נזרעים, מכסים את המדיום המכיל את הזרעים הקבורים ב-100% כדור הארץ של פולר או חלופת חרסית בנטוניט אחרת לעומק של 0.3175-0.635 ס"מ.
      4. ערפלו את השטוחים כדי לרכך את המדיום מבלי ליצור מים עומדים או איגומים. לאחר מכן, שמרו על לחות התקשורת על ידי ערפול במשך 20 שניות כל 180 דקות, או השקיה ידנית פעם ביום עד לנביטת הזרעים במשך כ-5 ימים. לאחר הנביטה, מים פעם ביום ולפי הצורך כדי לתמוך בצמיחת השתילים.
   3. הכנת מדיה
      הערה: שתי המדיות מיוצרות היטב עם אגר מגורען נוסף כדי לאפשר קצירת נבגים על ידי גירוד פני השטח.
      1. מדיום מיץ V8 מזוקק (V8)
         1. הכן 500 מ"ל של מיץ V8 מזוקק בינוני (V8)²⁷ על ידי הוספת 100 מ"ל של V8 מקורי 100% מיץ ירקות עם 1% CaCO₃ עד 400 מ"ל של מים מזוקקים.
         2. הוסף 7.5 גרם של אגר מגורען.
         3. ערבבו היטב את המרכיבים, אוטוקלאב, והניחו להתקרר ל-50 מעלות צלזיוס לפני שהם נשפכים לתבשילי פטרי סטריליות.
      2. דקסטרוז אגר תפוחי אדמה רב-עוצמה (qPDA)
         1. הכינו את מדיום qPDA על ידי הוספת 4.5 גרם של אגר מגורען ל-500 מ"ל של מים מזוקקים, הוסיפו 3.8 גרם של אגר דקסטרוז תפוחי אדמה.
         2. ערבבו היטב את המרכיבים, אוטוקלאבים, והניחו להתקרר ל-50 מעלות צלזיוס לפני שאתם שופכים 12-15 מ"ל לתוך מנות פטרי סטריליות.
2. הכנת טיפולים ניסיוניים
   1. הכן את האינוקולום.
      1. חמישה ימים לאחר ההשתלה (dpp), הניחו דיסקי נייר חודרים (בקוטר 1-1.25 ס"מ) המכילים את ה-F. oxysporum המועדף לבודד על גבי צלחת V8 אחת ופלטת qPDA אחת ואחסנו אותם באינקובטור (כ-28 מעלות צלזיוס) למשך שמונה ימים²⁸ (איור 3A).
      2. ביום השמיני של גידול הפטריות וביום שלפני החיסון (ראו סעיף 1.3.2), העבירו את לוחות ה-V8 וה-qPDA מהאינקובטור לארון בטיחות ביולוגית.
      3. עבור כל מבודד, מחלקים 6 מ"ל של מים שעברו עיקור על כל צלחת תרבית V8 ו-qPDA.
      4. היפטרו מקונידיה על ידי גירוד מתפשט תאי סטרילי על פני המשטח הבינוני (איור 3B). אחסנו את ההשעיה החרוטית הנוזלית והעבירו אותה לצינור תרבית סטרילי של 50 מ"ל (איור 3C).
      5. חזור על תהליך זה עד שנפח ההשעיה החרוטית הנוזלית הכוללת בצינור תרבית 50 מ"ל הוא כ-12 מ"ל.
      6. לפני שתמשיכו לבידוד נוסף, עיקרו את אזור העבודה ואת מפזר התאים בעזרת אלכוהול. לעקר את מפזר התאים על ידי העברתו דרך מבער בונזן לאחר טבילתו ≥70% אתנול.
      7. לאחר שהמתלים החרוטיאליים הנוזליים הועברו לצינורות תרבית עבור כל המבודדים, כימתו את ספירות הנבגים. ראשית, מערבולת שפופרת תרבית בודדת של 50 מ"ל ומחלקים 10 μL לכל תא של המקיטומטר. לאחר מכן, חשב את מספר הנבגים בהמקיטומטר כפי שתואר קודם לכן²⁹.
      8. הכן את תמיסת האינוקולום הסופית על ידי העברת הנפח המחושב עבור 10⁶ + 10% לצינור תרבית סטרילי אחר והביא את הנפח הכולל ל -30 מ"ל על ידי הוספת מים סטריליים deionized.
      9. אחסנו את צינורות התרבות האלה למשך הלילה בטמפרטורה של 8 ± מעלות צלזיוס.
         הערה: ניתן לעשות זאת ללא אובדן הכדאיות החרוטית, כפי שצוין על ידי נתונים שלא פורסמו.
3. חיסון
   1. הכינו את החיסון.
      1. לפני יום החיסון, השקו בחוזקה שתילים בני שלושה עשר יום לכושר נשיאת הקרקע.
      2. תייג מראש את ההימור עם מידע רלוונטי, כולל הבידוד לבדיקה, זן האבטיח ותאריך החיסון.
      3. מניחים 6 X 12 תאים (20 ס"מ רוחב x 40 ס"מ אורך) קלקר שטוח, בעבר מחוטאים עם 10% אקונומיקה ושטופים היטב, כדי לקבל את הצמחים מחוסנים.
      4. מילת יחס של כל החומרים הדרושים (ראה טבלת החומרים).
   2. לחסן את שורשי הצמחים.
      1. השקו בחוזקה את הצמחים מספר שעות לפני תחילת החיסון. לפחות 2 שעות לאחר ההשקיה, מוציאים את הצמחים משטחי הקלקר של 8 על 16 תאים ושוטפים את שורשיהם כדי להסיר את חלקיקי חומר השתילה הדבקים.
      2. אחסנו באופן זמני את הצמחים השטופים במיכלים נקיים עם מי ברז עד לשימוש, תוך שמירה על הפרדה בין המינים זה לזה (איור 4A). מפרידים את הצמחים לקבוצות של שישה פרטים ושומרים את קבוצות השתילים עטופות במגבות נייר רטובות על מגש מעבדה כדי למנוע ייבוש.
      3. מניחים 25-30 ס"מ³ של אדמה בתחתית כל תא של מגש הקלקר 6 על 12 מערך והשתמשו בבקבוק השפריץ כדי להרטיב את האדמה עד שהיא לחה בעליל.
      4. לחסן את הצמחים ולשתול אותם מחדש לפי הסדר על פי הזן, כך שיהלום שחור, צ'רלסטון גריי, קלהון גריי, ולאחר מכן PI 296341 01 FR נשתלים משמאל לימין.
      5. החל מהשליטה הבריאה, מכניסים קבוצה של שישה שתילים לא פגומים של אותו זן לתוך צינורות 50 מ"ל המכילים את האינוקולום. במקרה של שליטה בריאה, יש להשתמש במי ברז במקום במתלה נבגים. לחסן את הצמחים עם השליטה החיובית (מרוץ פון 3) האחרון.
      6. ברגע שהם בתוך הצינור, יש לוודא ששורשי הצמח מגיעים ונחשפים לאינוקולום (מי ברז).
      7. מערבולת הצינורות עם שורשי הצמח שקועים במשך 30 שניות (איור 4B). לאחר המערבולת, יש להניח צמח יחיד לכל תא במישורי הקלקר בגודל 6 על 12. מקם את הצמחים של אותו זן באותו עמודה במגש.
      8. לאחר ההשמה, יש לחטא את הידיים עם הכפפות על ידי החזקתן בדליים של תמיסת כלור זמינה של 0.7% למשך 30 שניות, ולאחר מכן לשטוף במי ברז למשך דקה אחת.
      9. לאחר מכן, מכסים את הצמחים המונחים במדיום שתילה ומניחים בעדינות. באמצעות מזרק או פיפטה, השקו בזהירות את הצמחים עם 20 מ"ל לכל צמח תוך הימנעות מהתזות.
      10. לפני שתמשיכו לסט הצמחים הבא, יש לחטא שוב את הידיים עם הכפפות באמצעות תמיסת כלור ושטיפת מי ברז.
      11. לאחר שכל הצמחים נשתלו מחדש, השקו אותם שוב באופן מינימלי כדי למנוע נגר אינוקולום.
      12. החזיקו את העציצים למשך הלילה בסביבה סגורה וחשוכה עם טמפרטורה ממוצעת של 27 מעלות צלזיוס. למחרת, העבירו את הצמחים לחממה, תוך שמירה על הטמפרטורה הממוצעת של 27 מעלות צלזיוס.
4. תחזוקה וטיפול בצמחים מחוסנים
   1. כדי למנוע הצפה של עודפי מים, השקו את המישורים בקלילות שלוש פעמים ביום במשך 4-5 ימים עד שהצמחים יתייצבו.
   2. בדקו את המגשים 2-3 פעמים ביום במשך שלושה ימים לפחות כדי להבטיח כיסוי הולם ושווה של השקיה.
   3. יש להימנע מייבוש עקב אור שמש או הצללה על ידי סיבוב הדירות ו/או מתן הצללה/השקיה משלימים לפי הצורך.
   4. ב 3 dpp, לדשן את הצמחים עם דשן 20-20-20-20 שחרור מהיר (10 גרם / 3.78 L) בקצב של 3-6 מ"ל לליטר מים.
   5. דישון מדי שבוע במשך 3-4 שבועות.
   6. שמרו על אותה תאורה ותנאי סביבה לאורך כל שלב זה.

2. קביעת גזע בשיטת גרעין שורץ (IKM)

1. התפשטות הגרעינים
   1. הכן את האינוקולום.
      1. או מתוך דגימה מאוחסנת או חדשה שנאספה, לבודד ולתרבת זן F. oxysporum f. sp. niveum בעל עניין על צלחת של qPDA עד כדי כך שהצמיחה שלו מכסה מחצית מהצלחת.
         הערה: זה מדגים כי הוא פעיל ובר קיימא, אשר הכרחי עבור התפשטות משמעותית של התבואה בשלבים מאוחרים יותר.
   2. הכינו את הגרעינים.
      1. בסולם, מדוד 200 גרם של גרגרי שיפון (Secale spp.) (או גרעיני חיטה מקסי (Triticum spp.) בכל מיכל גדול מספיק ומזוג אותם לתוך צלוחית ארלנמאייר אחת או יותר מזכוכית 1 ליטר. הוסיפו מי ברז סטריליים לצלוחיות כדי לכסות לחלוטין את הגרגרים עד ל-5 ס"מ לפחות (איור 5A).
      2. השרו את הגרעינים בטמפרטורת החדר (כ-24 מעלות צלזיוס) למשך שעתיים. לנקז את המים מן הצלוחיות; לחבר את הפתח עם חתיכת גליל כותנה עטוף בבד גבינה; וכסו את הפתח בעטיפת רדיד אלומיניום (איור 5B).
   3. נטרל את הגרעינים. לאחר שהתבואה טבלה במים, ציידו אותה פעמיים בשתי דרכים שונות כדי להרוג מיקרובים לא רצויים אחרים לפני החיסון.
      1. בפעם הראשונה, יש למקם את הגרגר בבקבוקים המוכנים במחזור הכבידה (121.2 מעלות צלזיוס, 1.06 ק"ג/ס"מ²) למשך שעה אחת עם זמן ייבוש של 5 דקות. אפשרו לצלוחיות להתקרר לטמפרטורת החדר.
      2. לפני ההטלה האוטומטית בפעם השנייה, העבירו את הגרגרים לשקית קטנה לגידול פטריות עם מסנן של 0.5 מיקרומטר. מוציאים את האוויר מהשקית ואז מקפלים את עודפי הניילון סביב השקית.
      3. מניחים את השקית בפח פלסטיק, בטוח לאוטוקלאב. כסו את הפח בעטיפת רדיד אלומיניום (איור 5C).
         הערה: אין להשתמש בפח מתכת בעת שימוש אוטומטי בדגנים בשקיות, מכיוון שהדבר עלול לגרום להמסת השקיות.
      4. אוטוקלאציה של הפח במחזור הכבידה למשך שעה אחת עם 5 דקות של זמן ייבוש, אותו מחזור כמו קודם.
         הערה: רק autoclaveed את התיק בפעם השנייה, לא הראשון, כמו המסנן ואת היציאה עלול להיפגע אם התיקים הם autoclaved פעמיים. יש למנוע עיבוי על המסנן על ידי מתן אפשרות לשקיות להתקרר לאט ובאופן מלא לפני הסרתן מהאוטוקלאב מכיוון שמסנן שקית הגידול ייפגע אם הוא יירטב.
   4. לחסן את הגרעינים.
      1. עבודה עם צלחת התרבית והתיק בארון בטיחות ביולוגית, דיסקי אגר חתוכים, בקוטר 6 מ"מ, מאזור הצמיחה הפעילה על צלחת התרבית עם נשא פקק סטרילי בגודל 4# 4. פתחו את השקית. באמצעות טכניקה סטרילית קפדנית, מניחים 5 דיסקים אגר בתיק. השתמשו בצילינדר בוגר סטרילי של 50 מ"ל כדי למדוד 35 מ"ל של מי ברז סטריליים ולהוסיף אותם לשקית.
      2. מגלגלים מעט את פתח השקית ואז מרססים את החלק החיצוני ב-70% אתנול כדי לעקר את פני השטח.
         הערה: אין לרסס את המסנן מכיוון שגם לחות זו תפגע בו.
      3. סגור את השקית על ידי קיפול הפינות לכיוון המרכז ולאחר מכן מעל פעמיים מעל הפילטר. אבטחו את התיק עם מהדקי תיקים וצינורות ויניל שקופים המסופקים על ידי היצרן.
         הערה: המהדקים ניתנים לשימוש חוזר.
      4. מוציאים את השקית מארון הבטיחות הביולוגית.
   5. אחסן את הפתוגן לצמיחה.
      1. אחסנו את התיק זקוף. ודאו שהמסנן נשלף מהצד הנגדי של השקית כדי לאפשר החלפת גזים מרבית (איור 5D).
      2. דגירה של החומרים בטמפרטורת החדר למשך כשלושה שבועות. להפיץ מחדש את הדגנים באופן קבוע כדי להבטיח אפילו צמיחה של הפתוגן.
         הערה: השקיות אינן ניתנות לשימוש חוזר.
2. זיהום של שתילי אבטיח עם תבואה שורצת
   1. מקור זרעי אבטיח כפי שתואר קודם לכן.
   2. לקבוע את קבוצות הניסוי.
      הערה: הזנים היחידים של הפתוגן הנדרשים הם המבודדים הנבדקים לזיהוי גזע. עם זאת, בקרות שליליות וחיוביות יסייעו לבצע השוואות לצמחים ללא זיהום או לרמה מסוימת של זיהום.
      1. כדי להכין בקרה שלילית, השתמש בגרעיני חיטה מעוקרים על פי השיטה שהוזכרה לעיל אך ללא חיסון.
      2. כדי להכין בקרה חיובית, השתמשו בגרעיני חיטה מחוסנים בזן שכבר מסווג לצורך השוואה מול המבודד הלא ידוע.
   3. ערבבו אדמה ותבואה.
      1. מדדו 14 גרגרים של גרעינים שורצי שומן לתוך שקית ניילון גדולה (איור 5E). ממלאים סירי פלסטיק (קוטר 15 ס"מ על 10 ס"מ גובה) בתערובת עציצים כדי למדוד את כמות התערובת הדרושה. רוקנו את התערובת לתוך השקית. צרו כרית אוויר בשקית וסובבו או אטמו אותה סגורה.
      2. מערבבים את הגרעינים והאדמה על ידי היפוך השקית מספר פעמים. עבור שליטה שלילית, בצע את אותו תהליך בשקית שונה עם גרעינים נקיים. לקבלת בקרה חיובית, בצע את אותו התהליך בשקית אחרת עם גרעינים שורצי זן ההשוואה.
      3. ממלאים ארבעה עציצים מעוקרים על פני השטח בתערובת האדמה השורצת. להדברה שלילית, סיר את התערובת לפני הטיפול בכל קרקע מזוהמת של פון.
   4. לזרוע את זרעי האבטיח.
      1. זרעו שישה זרעים בכל סיר. יש לוודא שכל עציץ מכיל רק זרעים מזן אחד. מקם את הזרעים כשקצה ה-apex של הזרע פונה כלפי מעלה כדי לאפשר צמיחה נכונה במהלך הופעתם (איור 6A).
      2. באמצעות בקבוק תרסיס, להרטיב את 0.3-0.6 ס"מ העליונים של הקרקע עם מים. הניחו צלחת פלסטיק שקופה (בקוטר 15 ס"מ) מתחת לכל סיר ומעליו כדי ליצור סביבה לחה לנביטת זרעים (איור 6B).
   5. לקבוע תנאי גידול.
      1. השקו את הסירים שלוש פעמים ביום בבקבוק תרסיס כדי לשמור על טורגיות ללא נגר עד שהזרעים נבטו (כ-5 ימים).
         הערה: כמות המים המשמשת תגדל עם גודל הצמח וגודל העציץ.
      2. לאחר שהזרעים נבטו, העבירו את המנה העליונה לחלק התחתון של הסיר.
      3. השקו את הצמחים מדי יום לפי הצורך לצמיחה אופטימלית של הצמחים. חשוף את הצמחים לפוטופריוד של 16 שעות בתנאי תאורה דומים לאלה שתוארו קודם לכן ולטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס (± 1 מעלות צלזיוס).

3. קביעת גזע בשיטת טבילת מגשים שונה (MTDM)

1. הכנת החומרים לחיסונים
   1. לקבוע תנאי שתילה.
      1. מלאו 48 תאים (3.68 ס"מ רוחב x 5.98 ס"מ אורך x 4.69 ס"מ עומק) מכניסים בחול מפוסטר באדים: כבול: ורמיקוליט (4:1:1) והקש מטה כדי לדחוס מעט את הקרקע. מניחים את התוספות במגשי פלסטיק (רוחב 27.9 ס"מ × אורך 53.3 ס"מ × עומק 5.1 ס"מ).
      2. זורעים את הזרעים עם הקצה העליון שלהם (הקצה הפרוקסימלי) המצביע כלפי מעלה לעומק השווה לאורכם.
      3. מקור הזרעים כפי שתואר קודם לכן.
      4. לאחר מכן, שמרו על התקשורת לחה על ידי ערפול במשך 20 שניות כל 180 דקות או השקיה ידנית פעם ביום.
      5. לאחר נביטה (כ-5 ימים), מים פעם ביום ולפי הצורך כדי לתמוך בצמיחת השתילים.
   2. הכינו את התקשורת.
      1. הכן תווך qPDA על ידי הוספת 5.625 גרם של אגר מגורען ל 500 מ"ל של מים מזוקקים; להוסיף 4.875 גרם של אגר דקסטרוז תפוחי אדמה. ערבבו היטב את המרכיבים, הקפידו על אוטוקלאב והתקררו ל-50 מעלות צלזיוס לפני שאתם נשפכים לתבשילי פטרי סטריליים. אטמו את כלי הפטרי עם פרפילם ואחסנו את הצלחות במקרר (4 מעלות צלזיוס) עד לשימוש.
      2. כדי להכין מרק בינוני, שוקלים ומוסיפים 24 גרם של דקסטרוז תפוחי אדמה לבקבוק 1 ליטר. מביאים את התערובת ל-1000 מ"ל על ידי הוספת מים מזוקקים לבקבוק, מניחים את הבקבוק על צלחת חמה ומערבבים עד להמסה. מחלקים 100 מ"ל של המרק לתוך 250 מ"ל צלוחיות Erlenmeyer. השתמשו בבד גבינה כדי לאטום את הצלוחיות ואת האוטוקלב.
   3. הכן את האינוקולום.
      1. שבעה ימים לפני השתילה, חחסנו חמש צלחות qPDA עם נייר מסתנן²⁸ ואחסנו אותן באזור דגירה במשך שמונה ימים במחזור חשוך של 14 שעות/10 שעות²².
      2. ביום השביעי, העבר שני חיבורי אגר 1 ס"מ^{2 לכל} בקבוקון ארלנמאייר 250 מ"ל המכיל 100 מ"ל דקסטרוז תפוחי אדמה. הניחו את צלוחיות ארלנמאייר על ספסל שייקר ב-200 סל"ד למשך 7 ימים במחזור אור/חושך של 14 שעות/10 שעות.
      3. ביום החיסון (14 יום לאחר הזריעה), קציר את הנבגים על ידי סינון האינוקולום דרך ארבע שכבות של מטלית גבינה סטרילית.
      4. קבע את הריכוז המיקרו-קונידיאלי בצלוחיות באמצעות המוציטומטר כפי שתואר קודם לכן. הכינו מתלה אינוקולום של 7 ליטר באמבט פלסטיק (רוחב 40.6 ס"מ × אורך 67.3 ס"מ x עומק של 16.8 ס"מ) על ידי העברת הנפח הנכון של תרחיף נבגים למים סטריליים לריכוז נבגים סופי של 1 × 10⁶ מ"ל⁻¹ (איור 7A).
2. חיסון
   1. 14 יום לאחר הזריעה (לפחות שלב העלה האמיתי הראשון), מעבירים את תוספות התאים עם השתילים למגשי רשת (רוחב 26.9 ס"מ × אורך 53.7 ס"מ × עומק 6.28 ס"מ). הניחו בעדינות את מגשי הרשת עם השתילים לתוך גיגית פלסטיק המכילה את מתלה האינוקולום 7 ליטר. חסן כל מגש בזה אחר זה (איור 7B).
   2. אפשרו לשתילים להישאר באינוקולום ללא הפרעה במשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, העבירו בעדינות את תוספות התאים המכילות את השתילים המחוסנים למגשים נטולי חורים (רוחב 27.9 ס"מ × אורך 53.3 ס"מ × עומק 5.1 ס"מ). חזור על תהליך זה עבור כל מגש.
   3. הניחו את המגשים נטולי החורים על ספסל החממה והמים לפי הצורך. שמרו על אותם תנאי תאורה וסביבה כפי שתואר בבדיקת הביו-אסציה של טבילת השורשים.

4. דירוג המחלה

1. בחר מרווחי זמן לדירוג.
   1. עבור טבילת השורשים ושיטות טבילת המגש שהשתנו, התחילו את הדירוג שבוע לאחר החיסון של הצמחים והמשיכו מדי שבוע במשך ארבעה שבועות נוספים.
      הערה: מערך הנתונים המשולב יכלול חמש קבוצות של תצפיות במהלך תקופה זו.
   2. תוך כדי שימוש בשיטת הקרנל, התחילו את הדירוגים רק ברגע שהשתילים מופיעים והמשיכו מדי שבוע בסך הכל שישה דירוגים.
2. שימו לב וחשבו את השכיחות.
   1. במהלך כל דירוג, צלם תמונות דיגיטליות כדי לתעד את התקדמות המחלה.
   2. דווחו על שכיחות המוות של נבולים וצמחים. חשב את השכיחות על ידי לקיחת סכום הצמחים הסימפטומטיים בהשוואה לבקרה הבריאה ומספר הצמחים המתים כשיעור ממספר הצמחים הכולל באותו זן.
3. נתח את התוצאות. השווה את דפוסי ההדבקה בין המינים ובין קבוצות הניסוי אם נעשה שימוש בבקרות.

ניסויים אלה מסייעים להגדיר את ההתנגדות היחסית של זנים שגדלו בדרך כלל (טבלה 1). לאחר מכן ניתן להשתמש במידע זה כדי להנחות המלצות ניהול המבוססות על אוכלוסיות Fon מקומיות. במילים אחרות, אם ידוע כי גזע 0 או 1 קיים בשדה מסחרי, אזי החקלאי עשוי להיות נוטה לגדל זן "עמיד" כגון קלהון גריי, סאנסוגר או שווה ערך. התוצאות של הבדיקות הביולוגיות שהשתמשו בכל השיטות מראות שכאשר השתילים נדבקו בבידוד של גזע 1, התותחים השחורים של היהלום השחור וצ'רלסטון גריי מתו או הראו תסמינים חמורים, בעוד שהזני Calhoun Grey ו-PI הראו עמידות (טבלה 2 ואיור 8A).

כל השיטות הראו שכאשר השתילים נדבקו בבידוד של גזע 3, כמעט כל הצמחים מכל המינים מתו או הראו תסמינים חמורים (איור 8B). תוצאות אלה מדגימות כיצד בדיקות ביולוגיות המשתמשות בשתי שיטות החיסון מבדילות בהצלחה בין גזעים של פון. המראה של צמחים חולים צריך להיות זהה עבור כל השיטות. ההבדל היחיד הוא באופן שבו הגזעים מקובצים באופן מרחבי. עבור שיטות טבילת השורשים ושיטות דריי-טבילה שהשתנו, המינים יאורגנו לפי עמודים של המגש, בעוד שבשיטת הגרעין, המינים יקובצו בסירים משלהם.

איור 1: אזור ניסוי עבור RDM. בשל השתנות הסימפטומים, התלויה מאוד בתנאים סביבתיים כגון לחות יחסית, טמפרטורה, פוטופריוד ועוצמת אור, שמירה על אזור ניסוי מוסדר חשובה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: הכנת הדירות ההתחלתיות עבור RDM. מלאו 8 X 16 תאים (25 ס"מ רוחב x 50 ס"מ אורך) החל שטוחים עם בינוני שתילה והקש למטה כדי לדחוס מעט את הקרקע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: הכנת מתלים חרוטיים ל-RDM. (א) בידוד ותרבות. או מתוך דגימה מאוחסנת או חדשה שנאספה, לבודד ולתרבת זן F. oxysporum f. sp. niveum בעל עניין על צלחת של qPDA עד כדי כך שהצמיחה שלו מכסה מחצית מהצלחת. זה מדגים כי הוא פעיל ובר קיימא, אשר הכרחי עבור התפשטות משמעותית של התבואה בשלבים מאוחרים יותר. (ב) ניתוק קונידיה. נטרול קונידיה על ידי גירוד מתפשט תא סטרילי על פני המשטח הבינוני. (ג) תצהיר השעיה. אסוף את מתלה הקונידיה הנוזלי והעביר אותו לצינור תרבית סטרילי של 50 מ"ל. קיצור: qPDA = רבעון חוזק תפוח אדמה dextrose אגר מדיום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: ארגון ומערבולת של שתילים עבור RDM. (A) הפרדת זנים. יש לאחסן באופן זמני את הצמחים השטופים במיכלים נקיים עם מי ברז עד לשימוש, תוך שמירה על הפרדה בין המינים. (B) מערבולת של שתילים. מערבולת הצינורות עם שורשי הצמח שקועים במשך 30 שניות לשתילת צמח יחיד לכל תא במישורי הקלקר בגודל 6 x 12. צמחים מאותו זן ממוקמים באותו עמוד במגש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5: הכנה והתפשטות של גרעינים עבור IKM. (A) אימביציה של גרגרי שיפון. בסולם, מדוד 200 גרם של גרגרי שיפון (Secale spp.) (או גרעיני חיטה מקסי (Triticum spp.) בכל מיכל גדול מספיק ומזוג אותם לתוך צלוחית ארלנמאייר אחת או יותר מזכוכית 1 ליטר. הוסיפו מי ברז סטריליים לצלוחיות כדי לכסות לחלוטין את הגרגרים עד 5 ס"מ לפחות. מסננים את המים מהבקבוקונים, מחברים את הפתח בחתיכת גליל כותנה עטופה בבגד גבינה, ומכסים את הפתח בעטיפת רדיד אלומיניום. (C) הגדרת Autoclave. מניחים את השקית בפח פלסטיק, בטוח לאוטוקלאב. אין להשתמש בפח מתכת בעת סילוק הגורים בשקיות, שכן הדבר עלול לגרום להמסת השקיות. מכסים את הפח בעטיפת נייר אלומיניום. (ד) אחסון תיקים. אחסנו את התיק זקוף. ודא שהמסנן נשלף מהצד הנגדי של השקית כדי לאפשר החלפת גז מקסימלית. (E) למדוד 14 גרגרים של גרעינים שורצי שקית ניילון גדולה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 6: זריעה ונביטה של זרעי אבטיח. (A) זריעת זרעי זן בעציצים. זרעו שישה זרעים בכל סיר. יש לוודא שכל עציץ מכיל רק זרעים מזן אחד. מקם את הזרעים כאשר קצה ה-apex של הזרע פונה כלפי מעלה כדי לאפשר צמיחה נכונה במהלך הופעתה. (ב) נביטת זרעים. באמצעות בקבוק תרסיס, להרטיב את 0.3-0.6 ס"מ העליונים של הקרקע עם מים. מניחים צלחת פלסטיק שקופה (בקוטר 15 ס"מ) מתחת לכל סיר ומעליו כדי ליצור סביבה לחה לנביטת זרעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 7: הכנת אינוקולום וחיסון שתילים ל-MTDM. (א) הכנת אינוקולום. קבע את הריכוז המיקרו-קונידיאלי בצלוחיות באמצעות המוציטומטר כפי שתואר קודם לכן. הכינו מתלה אינוקולום של 7 ליטר באמבטיה מפלסטיק (רוחב 40.6 ס"מ × 67.3 ס"מ אורך × עומק של 16.8 ס"מ) על ידי העברת הנפח הנכון של מתלי הנבגים למים סטריליים לריכוז נבגים סופי של 1 × 10⁶ מ"ל⁻¹. (ב) חיסון השתילים. 14 יום לאחר הזריעה (לפחות שלב העלה האמיתי הראשון), העבירו את התוספות התאיות עם השתילים למגשי רשת (רוחב של 26.9 ס"מ × 53.7 ס"מ אורך × עומק של 6.28 ס"מ). הניחו בעדינות את מגשי הרשת עם השתילים לתוך גיגית פלסטיק המכילה את מתלה האינוקולום 7 ליטר. חסן כל מגש בזה אחר זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 8: תוצאות פנוטיפיות של שיטות זיהוי גזע. (א) תוצאות מרוץ 1. התוצאות של הביו-אסיסויים שהשתמשו ב-(A) בכל השיטות מראות שכאשר השתילים נדבקו בבידוד של גזע 1, התותחים השחורים של היהלום השחור וצ'רלסטון גריי מתו או הראו תסמינים חמורים, בעוד שזני Calhoun Grey ו-PI הראו עמידות. (ב) תוצאות מרוץ 3. כל השיטות הראו שכאשר השתילים נדבקו בבידוד של מרוץ 3, כמעט כל הצמחים מכל התרבויות מתו או הראו תסמינים חמורים. (המראה של צמחים חולים צריך להיות זהה עבור כל השיטות. סדר השתילה (משמאל לימין) המוצג על ידי חצים: יהלום שחור (חץ כחול), אפור צ'רלסטון (חץ סגול), אפור קלהון (חץ חום), מבוא לצמח 296341-FR (חץ ירוק). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: מרוץ פוסאריום אוקסיספורום f. sp. ניוום. הגזע של Fusarium oxysporum f. sp. niveum נקבע על ידי תגובות רגישות או עמידות לקבוצה של הפרשי אבטיחים. הזנים המפורטים בכל שורה הם המשמשים ביותר לייצוג כל רמת התנגדות במהלך הערכת גזעו של מבודד. טבלה זו שונתה מ- ⁴. קיצורים: S = רגיש; R = עמיד.

טבלה 2: זיהוי גזעים. הערכים המשמשים בטבלה זו משקפים את השכיחות או את מספר הצמחים הסימפטומטיים, בהשוואה לבקרה הבריאה, ואת מספר הצמחים המתים כשיעור ממספר הצמחים הכולל באותו זן. המספרים בכל תא משקפים את השכיחות שדווחה בסוף תקופת התצפית. זן נחשב רגיש כאשר לפחות 1/3^rd או 33% מהצמחים של אותו זן הם סימפטומטיים או מתים. הגזע של הפתוגן נקבע לאחר מכן על סמך אילו זנים נחשבו רגישים. במילים אחרות, האופן שבו הפתוגן מתפקד נגד זנים עם עמידות גוברת קובע את גזע המבודד. תוצאות אלה אינן מניסוי אמיתי, אלא מוצגות כמעבירות כיצד גזעים מזוהים מתוצאות השיטות הללו. קיצורים: MTD = שיטת טפטוף מגש שונה; BD = יהלום שחור; CH. G = צ'רלסטון גריי; Cal G. = קלהון גריי; PI = מבוא לצמח 296341-FR; S = סימפטומטי; AS = אסימפטומטי.

הוצגו שלוש שיטות של הקלדת גזעים. כל אחת מהשיטות הללו מתאימה ביותר לשאלות מסוימות ולתנאים ניסיוניים מסוימים. שיטת חיסון הגרעין שורץ (התפשטות הקרקע) היא אולי פשוטה ופשוטה יותר, מה שהופך אותה לשימושית במיוחד להערכת פתוגניות³⁰. שימוש בשיטה זו להקלדה פשוטה של גזעים הוא יעיל ביותר. עם זאת, יישום השיטה לקביעת העמידות של זן מסוים עשוי להיות מאתגר, בהתחשב בכך שכל צמח עשוי שלא להתמודד עם אותה מידה של זיהום או חשיפה, וייתכן שיהיה צורך ברמות גבוהות באותה מידה של מחלה כדי לבחון את העמידות של זני העניין. זה המקרה מכיוון שאינקולום המיוצר באופן זה אינו מכמת היטב, ושיעור ההתפשטות הקיימת, או מספר הפרוגולות הזיהומיות המגיעות לאזור השורש, אינו מווסת היטב³¹. בנוסף, שיטה זו מוגבלת על ידי חוסר עקביות בסמיכותם של הגרעינים הנטועים לאזור השורשים. אם הם רחוקים מדי, ייתכן שהנבגים לא ינבטו, או שהנבגים לא יתפתחו מספיק כדי להגיע לשורשים.

שיטת טבילת^{השורשים 32,33} היא מייגעת יותר וגוזלת זמן רב יותר; עם זאת, מאחר שכמות ההתפשטות בת-הקיימא המקיימת אינטראקציה עם הצמח נמדדת בצורה מדויקת יותר, ניתן לתאר בצורה מדויקת יותר את עמידות המארח, מה שמקל על סינון ההתנגדות. יתר על כן, הבדלים באלימות בתוך אותו גזע ניתן לזהות בקלות רבה יותר. לשיטה זו יש יתרון נוסף שבדרך כלל, צמחים הופכים לסימפטומטיים מוקדם יותר ובאופן אקספרסיבי יותר מאשר בשיטת הגרעין. גרסה אחת של שיטת טבילת השורשים המשתמשת בכלמידוספורים בתרחיף האינוקולום במקום בקונידיה עשויה להיעדר יתרון זה⁶. באופן דומה, שיטת טבילת המגש²² המתוקנת היא עתירת עבודה, אך מאפשרת פנוטיפ בתפוקה גבוהה כאשר יש צורך בסינון של מבודדים ושתילים רבים.

הגורמים המשותפים לשלוש השיטות כוללים את בחירת המינים, תנאי הגידול והדרישות להיגיינה. בהתאם למה שקיים באופן מסחרי, ניתן להחליף זנים מסוימים^21,34. שוגר בייבי ויהלום שחור יכולים לשמש שניהם לקביעת מבודדי גזע 0, בעוד שצ'רלסטון גריי, Allsweet ודיקסיילי תוארו כעמידים בפני גזע 0 אך רגישים למירוץ 1. קלהון גריי וסאנסוגר עמידים בפני גזעים 0 ו-1 ורגישים למירוצים 2 ו-3. התפתחות מחלת פון תלויה מאוד בטמפרטורה. יש להקפיד על כך שתנאי הניסוי ישלטו במשתנה זה. בעת בחירת מדיום שתילה, תערובות מסחריות כלליות הכוללות טחב כבול ו/או גבס ומאפשרות אוורור טוב צריכות להיות משביעות רצון. יש לנקוט אמצעי זהירות כדי למנוע זיהום צולב של אמצעי השתילה בשתי השיטות, במיוחד משקית המקור.

לאחר השימוש באחת השיטות המתוארות, יש להעריך את המחלה באופן מדויק ועקבי. חוקרים קודמים החליטו בדרך כלל על סף שבו צמחים מסווגים כרגישים או עמידים^ל-35,36. לדוגמה, אם פחות מ-33% מהצמחים של זן מסוים היו סימפטומטיים, אזי אותו זן יסווג כעמיד עם הבידוד המוגדר ביחס לפרופיל הרגיש של הזן. מערכת הסף מוגדרת על ידי החוקר והשאלה שהוא רוצה להתייחס אליה. ההשתנות בין המדרגים לבין אותו מדרג בין הצמחים דווחה באופן נרחב^{על 37,38}. גורמים כגון איכות הזרעים בהם נעשה שימוש, איכות הקרקע, צפיפות האינוקולום, גיל האחסון של מבודדים והטיית הקצב^39,40 תורמים כולם לשונות זו⁸. בשל שונות זו בתגובות חיסון ו-PI, יש צורך בשכפולים ניסיוניים מרובים; באופן אידיאלי, לפחות שלושה אך חמישה שכפולים מומלצים, עם 6 צמחים לכל שכפול לכל זן.

בעוד שמבחנים מולקולריים פותחו כדי לזהות Fon מבודד 41,42,43, התוצאות לא היו עקביות בשל האופי הפוליפילטי של F. oxysporum והשונות הגיאוגרפית והגנומית של קומפלקס המינים 44,45,46. יתר על כן, אף על פי שמחקרים קודמים ביססו את חשיבותם של משפיעי ה-Secreted in Xylem (SIX) באלימות מלאה, המשלים המדויק של אפקטורים המגדירים את המבנה הגזעי של מבודדי פון טרם נקבע¹³. אבחון מולקולרי לגזע עדיין מפותח, שעבורו טכניקות פנוטיפיות אלה הן קריטיות להערכת הדיוק והתועלת שלהן בהקלדת גזע Fon^19,47.

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

אנו רוצים להודות לד"ר עלי ולמעבדה לאבחון מולקולרי של צמחים, כמו גם לד"ר פינגשנג ג'י באוניברסיטת ג'ורג'יה, שמנהיגותו ותמיכתו סייעו לבסס את תוכנית פון שלנו.