Dissecando as propriedades mecanoenzimáticas de miosinas processivas com espectroscopia de força-braçadeira ultrarrápida

Apresenta-se aqui um protocolo abrangente para a realização de experimentos ultrarrápidos de pinça de força em motores processivos de miosina-5, que poderia ser facilmente estendido para o estudo de outras classes de motores processivos. O protocolo detalha todas as etapas necessárias, desde a instalação do aparato experimental até a preparação da amostra, aquisição e análise dos dados.

A espectroscopia ultrarrápida de pinça de força (UFFCS) é uma técnica de molécula única baseada em pinças a laser que permite a investigação da quimiomecânica de miosinas convencionais e não convencionais sob carga com resolução de tempo sem precedentes. Em particular, a possibilidade de sondar motores de miosina sob força constante logo após a formação da ligação actina-miosina, juntamente com a alta taxa de feedback de força (200 kHz), mostrou que a UFFCS é uma ferramenta valiosa para estudar a dependência de carga de dinâmicas rápidas, como o acidente vascular cerebral de trabalho da miosina. Além disso, a UFFCS permite o estudo de como as interações miosina-actina processivas e não processivas são influenciadas pela intensidade e direção da força aplicada.

Seguindo este protocolo, será possível realizar experimentos ultrarrápidos de pinça de força em motores de miosina-5 processiva e em uma variedade de miosinas não convencionais. Por alguns ajustes, o protocolo também poderia ser facilmente estendido para o estudo de outras classes de motores processivos, como cinesinas e dineínas. O protocolo inclui todas as etapas necessárias, desde a instalação do aparelho experimental até a preparação da amostra, procedimentos de calibração, aquisição e análise de dados.

Nas últimas décadas, as pinças ópticas têm sido uma ferramenta valiosa para elucidar a mecanoquímica das interações proteicas no nível de molécula única, devido à impressionante possibilidade de manipulação e mensuração simultâneas de alterações conformacionais e cinética enzimática ^1,2. Em particular, a capacidade de aplicar e medir forças na faixa daquelas exercidas por motores moleculares na célula, juntamente com a capacidade de medir mudanças conformacionais subnanométricas, tornou as pinças ópticas uma ferramenta única de molécula única para desvendar as propriedades quimiomecânicas das proteínas motoras e sua regulação mecânica.

A espectroscopia de pinça de força ultrarrápida (UFFCS) é uma técnica de espectroscopia de força de molécula única baseada em pinças ópticas, desenvolvida para estudar a cinética rápida de motores moleculares sob carga em uma geometria de três esferas (Figura 1a)^3,4. A UFFCS reduz o intervalo de tempo para aplicação de força à proteína motora ao limite físico das pinças ópticas, ou seja, o tempo de relaxamento mecânico do sistema, permitindo assim a aplicação da força rapidamente após o início de uma corrida de miosina (poucas dezenas de microssegundos)³. Essa capacidade tem sido explorada para investigar os primeiros eventos mecânicos na miosina do músculo esquelético rápido ³ e cardíaco⁵ para revelar a dependência de carga do powerstroke, os estados de ligação fraca e forte, bem como a ordem dos eventos bioquímicos (Pi) e mecânicos (powerstroke).

A geometria de três esferas é geralmente empregada para estudar motores não processivos, uma geometria de um único grânulo com um grampo de força tem sido comumente usada para investigar miosinas processivas não convencionais, como a miosina Va⁶. No entanto, existem várias razões para preferir um ensaio UFFCS de três contas também para miosinas processivas. Em primeiro lugar, a rápida aplicação da carga logo após a ligação actina-miosina permite a medição dos eventos iniciais no desenvolvimento da força, como em motores não processivos. Além disso, no caso de motores processivos, também permite uma medição precisa dos comprimentos de funcionamento e durações de funcionamento do motor sob força constante durante toda a sua progressão (Figura 1b). Além disso, devido à alta taxa de feedback de força, o sistema pode manter a força constante durante mudanças rápidas de posição, como o curso de trabalho da miosina, garantindo assim uma carga constante durante o passo motor. A alta resolução temporal do sistema permite a detecção de interações sub-ms, abrindo a possibilidade de investigar a fraca ligação da miosina à actina. Finalmente, a geometria do ensaio garante que a força seja aplicada ao longo do filamento de actina, com componentes transversais e verticais insignificantes da força. Este ponto é de particular relevância, uma vez que o componente de força vertical demonstrou influenciar significativamente a dependência de carga da cinética do motor ^7,8. Utilizando essa técnica, pudemos aplicar uma gama de cargas assistivas e resistivas à miosina-5B processiva e medir diretamente a dependência de carga de sua processividade para uma ampla gama de forças⁴.

Como mostrado na Figura 1a, neste sistema um único filamento de actina é suspenso entre duas esferas de poliestireno presas no foco de pinças ópticas duplas (o "haltere"). Uma força líquida desequilibrada F= F_{1-F 2} é imposta ao filamento, através de um sistema de feedback rápido, que faz com que o filamento se mova a uma velocidade constante em uma direção até atingir um ponto de inversão definido pelo usuário, onde a força líquida é revertida na direção oposta. Quando a proteína motora não está interagindo com o filamento, o haltere está livre para se mover para frente e para trás em uma forma de onda triangular (Figura 1b, painel inferior) abrangendo o grânulo do pedestal no qual uma única proteína motora está ligada. Uma vez que a interação é estabelecida, a força transportada pelo haltere é muito rapidamente transferida para a proteína motora e o motor começa a deslocar o filamento, pisando sob a intensidade e direção da força que foi aplicada pelo sistema de feedback no momento da interação, até que a miosina se desprenda da actina. Sendo o deslocamento produzido pelo passo do motor dependente da polaridade do filamento de actina preso, de acordo com a direção da força aplicada a carga pode ser tanto assistiva, ou seja, empurrando na mesma direção do deslocamento do motor (empurrar no painel superior da Figura 1b), ou resistiva, ou seja, puxando na direção oposta em relação ao deslocamento do motor (puxar na Figura 1b painel superior) possibilitando estudar a regulação quimiomecânica da processividade motora tanto pela intensidade quanto pela direcionalidade da carga aplicada.

Nas próximas seções, todas as etapas para medir as interações actina-miosina-5B sob diferentes cargas com uma configuração ultrarrápida de espectroscopia força-pinça são totalmente descritas, incluindo 1) a configuração da configuração óptica, alinhamento de armadilhas ópticas e procedimentos de calibração, 2) as preparações de todos os componentes e sua montagem na câmara de amostra, 3) o procedimento de medição, 4) dados representativos e análise de dados para extrair parâmetros físicos importantes, como o comprimento da corrida, o tamanho do passo e a velocidade da proteína motora.

1. Configuração óptica

NOTA: A configuração experimental é composta por pinças ópticas duplas com estabilidade de apontamento nanométrico e < flutuações de intensidade de laser de 1%. Nessas condições, a estabilidade do haltere no nível nanométrico é garantida sob rigidez típica do purgador (0,1 pN / nm) e tensão (1 pN - algumas dezenas de pN). A Figura 2 mostra um esquema detalhado da configuração óptica.

1. Projeto e construção de pinças ópticas 9,10,11.
   1. Coloque todos os componentes da configuração em uma tabela óptica de acordo com o esquema da Figura 2. Observe que a tabela óptica inclui isoladores ativos para minimizar as vibrações mecânicas. Além disso, a estrutura do microscópio é montada em isoladores elastoméricos para absorver o ruído acústico e as ressonâncias mecânicas.
   2. Insira um isolador óptico próximo à fonte de laser ("OI" na Figura 2), para evitar flutuações aleatórias de amplitude devido ao feedback óptico.
   3. Sele todo o caminho em uma caixa fechada para reduzir a corrente de ar e as turbulências que podem afetar a estabilidade do apontamento a laser.
   4. Crie as pinças ópticas duplas dividindo a fonte principal do laser (laser Nd:YAG, comprimento de onda de 1.064 nm na Figura 2) em dois ramos com polarizações ortogonais pelo uso de divisores de feixe polarizador (PBS). As armadilhas compartilhadas no tempo devem ser evitadas, pois induzem a oscilação do haltere sob tensão¹².
   5. Use dois defletores acousto-ópticos (AODs na Figura 2) acionados por Sintetizadores Digitais Diretos (DDSs) para permitir movimentos finos e rápidos das duas armadilhas e regulação precisa da tensão da actina, conduzindo diretamente os DDSs através das saídas digitais da placa FPGA de matriz de porta programável em campo (consulte a Figura 2).
      NOTA: O tempo de resposta geral de feedback deve ser de <10 μs para corrigir rapidamente e manter a força constante em ambas as armadilhas durante as medições, incluindo o estado não ligado, a interação com a miosina e o movimento. Para este fim, os detectores de posição devem ter uma largura de banda >= 100 kHz e os dados devem ser adquiridos a >= taxa de amostragem de 200 kHz. Para cada ponto de dados adquirido (tempo de aquisição de 5 μs), as correções proporcionais para as duas armadilhas são calculadas pelo FPGA e enviadas para os dois DDS que conduzem os AODs. O tempo de resposta AOD deve ser inferior a 5 μs para satisfazer o tempo de resposta de feedback necessário.
   6. Para a detecção nm da posição dos grânulos presos, coloque dois Detectores de Fotodiodos de Quadrante (QPDs na Figura 2) no plano focal traseiro do condensador. O alinhamento preciso dos QPDs em um plano conjugado ao plano focal posterior do condensador, bem como os AODs em um plano conjugado ao plano focal posterior do objetivo, garantirá que os sinais dos QPDs sejam independentes da frequência dos AODs.
   7. Monte o AOD em um tradutor linear com acionamento de micrômetro e desloque-o até que a borda do cristal se aproxime do feixe de laser. Em seguida, substitua a objetiva por uma íris, centrada na caixa da objetiva rosqueada, e regule sua abertura para se ajustar ao tamanho da abertura traseira da objetiva.
   8. Mova o tradutor em direção ao feixe de laser até que a parte do feixe bloqueada pelo cristal piezo seja visível após a íris, gire o tradutor ligeiramente para trás para obter o feixe para preencher completamente a abertura da íris novamente.
   9. Repita as etapas 1.1.7-1.1.8 para o segundo AOD. Verifique o tempo de resposta do loop de feedback medindo o intervalo de tempo dos QPDs enquanto move rapidamente um feixe em um talão preso na superfície do deslizamento de cobertura¹³.
      NOTA: As três etapas acima (1.1.7-1-1-9) levam ao alinhamento cuidadoso dos cristais AOD. Essas etapas são importantes para otimizar a resposta temporal tanto da deflexão do feixe quanto do feedback¹³.
2. Por meio de um fotodiodo, meça as flutuações de intensidade do laser de aprisionamento na entrada do microscópio, que devem ser inferiores a 1%. Observe que a largura de banda do fotodiodo deve ser maior que a taxa de imagem.
3. Verifique a estabilidade de apontamento de ambas as armadilhas.
   1. Preparar grânulos de sílica em tampão fosfato (PB) diluindo 20 μL de grânulos de sílica (1,2 μm, 10% de sólidos) em 1 mL de acetona, sonicate por 30 s, vórtice brevemente e centrífuga por 2 min a 19.000 x g.
   2. Retire o sobrenadante, ressuscite em 1 mL de acetona e repita a lavagem. Ressuspeite em 1 mL de 50 mM PB, lave 2 vezes. Finalmente, ressuspeite em 100 μL de 50 mM PB.
   3. Realize a calibração de pinças ópticas com contas de sílica colando uma tampa em uma lâmina de microscópio com uma fita dupla face (cerca de 60 μm de espessura) para construir uma câmara de fluxo. Encha a câmara com uma BSA (proteína de albumina sérica bovina) de 1 mg/mL e aguarde 3 min.
   4. Vazar uma diluição de 1:1000 de contas de sílica em PB para a câmara. Use uma seringa cheia de graxa de silício para selar cuidadosamente a câmara. Fixe um único talão em cada purgador e aplique o método do espectro de potência¹⁴ para calibrá-los.
   5. Prepare contas de sílica em acetato de pentila (à temperatura ambiente) dissolvendo 20 μL de contas de sílica (1,2 μm de diâmetro, 10% de sólido) em 1-1,5 mL de acetona, vórtice e sonicato por 30 s.
   6. Centrífuga a 18.500 x g por 2 min. Descarte o sobrenadante e ressuscite em 1 mL de acetona e, em seguida, repita a lavagem. Ressuspender em 1 mL de acetato de pentila e repetir a lavagem (centrífuga e ressuspensão) em acetato de pentila 2 vezes. Ressuspender o pellet em 100 μL de nitrocelulose a 1% e acetato de pentila a 900 μL. Conservar a 4 °C durante 2 meses.
   7. Pegue uma tampa de vidro de 24 x 24 mm e limpe-a cuidadosamente com papel embebido em etanol puro. Em seguida, enquanto o segura com uma pinça limpa, enxágue uma segunda vez lavando diretamente com etanol puro. Deixe secar sob um fluxo suave de nitrogênio. Se necessário, repita esta operação para remover todos os resíduos visíveis na superfície do vidro.
   8. Pegue o estoque de contas de sílica, vortex-o e sonice-o brevemente por ~ 30 s.
   9. Depois de limpar uma segunda tampa (24 x 60 mm), use-a para espalhar 2 μL de solução de esferas de sílica em uma superfície da tampa e espere secar.
   10. Limpe cuidadosamente uma lâmina de microscópio (26 x 76 mm) que será usada para criar a câmara de fluxo.
   11. Corte duas linhas de fita adesiva dupla (~3 mm de tamanho, 60-100 μm de espessura) e prenda-as em um lado da lâmina do microscópio, como mostra a Figura 3.
   12. Utilizando uma pinça limpa, feche a câmara (cerca de 20 μL de volume final) colocando a tampa revestida (1.3.9) em contacto com as linhas de fita adesiva, com a camada de nitrocelulose + grânulos virada para o interior da câmara, como mostra a figura 3a. Encha a câmara de fluxo com tampão fosfato de 50 mM e sele-a com graxa de silício.
   13. Fotografe um único grânulo de sílica em microscopia de campo brilhante com ampliação de >200x usando um dispositivo de carga acoplada (CCD) ou uma câmera complementar de metal-óxido-semicondutor (CMOS) com >1,4 megapixels. Use um software de feedback para mover o estágio piezo (com precisão nanométrica ou melhor) para compensar as derivas térmicas¹⁰.
   14. Sobreponha o centro da armadilha esquerda com o centro do talão (os níveis de sinal x-y do QPD devem corresponder aos da calibração). Em seguida, meça o ruído de posição e o desvio padrão dos sinais de posição para essa armadilha.
   15. Repita a etapa anterior para a armadilha correta¹⁵.
4. Calibração da posição do purgador: MHz a nm
   1. Preparar uma câmara de fluxo com grânulos de sílica fixados na superfície da tampa (1.3.5-1.3.12) e esferas flutuantes de poliestireno (utilizar grânulos conjugados α-actinina preparados como no ponto 2.1 seguinte).
   2. Foque um grânulo de sílica na superfície da tampa ligeiramente descentrada (~5 μm) do centro do campo de visão (FOV) e adquira uma imagem do FOV. Mova o talão em 10 μm em direção ao centro FOV usando o estágio piezo e adquira uma segunda imagem. Calcule o centro do grânulo nas duas imagens usando um algoritmo centroide ou similar e calcule a distância em pixel entre os dois grânulos para obter a calibração de nm/pixel da câmera de campo brilhante.
   3. Prender uma única partícula flutuante em uma armadilha. Em seguida, mova o purgador usando AOD em pequenos passos (0,2 MHz) e adquira uma imagem da partícula e da frequência correspondente do AOD para cada passo. Calcule a posição da partícula no FOV usando o algoritmo centroide como antes e converta-a em nm usando a calibração de nm/pixel obtida na etapa anterior.
   4. Execute um ajuste linear aos dados de posição de frequência e calcule a constante de calibração em nm/MHz.
   5. Repetir a calibração para o segundo purgador
5. Calibração de potência e rigidez do purgador (MHz vs W), QPD (MHz vs pN/nm)
   1. Preparar uma câmara de fluxo com grânulos de sílica fixados na superfície do deslizamento da tampa (1.3.5-1.3.12) e esferas flutuantes de poliestireno (utilizar grânulos conjugados α-actinina preparados como no ponto 2.1 seguinte) e imobilizar uma única partícula num reservatório. Em seguida, desloque ambas as armadilhas através de AODs em pequenos passos (0,2 MHz) e registre um movimento browniano da partícula em ambas as armadilhas com QPD e a frequência correspondente dos AODs.
   2. Calcular uma potência média nos detectores em cada posição e obter rigidez do purgador e beta constante de calibração da QPD ajustando uma função lorentziana a um espectro de potência do movimento browniano registrado¹³.

2. Preparação da amostra

1. Preparar grânulos fluorescentes conjugados com α-actinina
   1. Realizar conjugação¹⁶: Pegue grânulos de poliestireno aminofuncionalizados (1 μm de diâmetro, 2,5% de sólidos), lave-os duas vezes em água destilada de 500 μL e ressussuspenda em 500 μL de PBS (pH 7,0). Adicionar 1 mM de éster succinimidílico O₂ ligante HaloTag e incubar à temperatura ambiente durante 1 h. Lavar três vezes com 500 μL de PBS e ressuspenso com HaloTag 100-200 μM α-actinina. Incubar durante 1 h a 37 °C e lavar três vezes em 500 μL de PBS (utilizar grânulos no prazo de 1,5 semanas ou congelados em azoto líquido e armazenar a -80 °C).
   2. Rotulagem: Incubar 200 μL de solução de esferas com Rhodamine-BSA na concentração final de 5 μg/mL por 10 min. Lavar com 50 mM PB três vezes e ressuspender em 500 μL de PB 50 mM. Este pode ser armazenado em alíquotas a - 80 °C durante meses).
2. Expressar e purificar a miosina-5B biotinilada conforme descrito anteriormente ^4,17.
3. Polimerizar e rotular a F-actina¹³:
   1. Polimerização de f-actina: Misture 69 μL de água ultrapura, 10 μL de tampão de polimerização de actina 10x (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl₂, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM de carbonato de guanidina pH 7,5), 20 μL de G-actina 10 mg/mL e 1 μL de DL-Dithiothreitol (DTT) 1 M. Deixe no gelo por mais de 1 h.
   2. Marcação de F-actina com rodamina (Ex/Em: 546/575 nm): Tomar 25 μL de F-actina polimerizada e adicionar 19,5 μL de água ultrapura, 2,5 μL de tampão de polimerização de actina 10x (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl 2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM de carbonato de guanidina pH 7,5), 1 μL de 1 M DTT e₂ μL de 250 μM de faloidina rodamina. Deixe-o no gelo durante a noite. Para experiências de armadilhagem a rodamina F-actina pode ser armazenada no gelo e usada dentro de uma semana.
4. Montagem da amostra
   1. Tomar a câmara de fluxo (1.3.5-1.3.12) e incubar 1 mg/ml de BSA biotinilada durante 5 minutos. Após lavagem com tampão AB (25 mM MOPS, 25 mM KCl, 4mM MgCl 2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, pH_7,2) incubar 1 mg/ml de estreptavidina durante 5 min e lavar novamente com tampão AB. Incubar miosina-5B biotinilada meromiosina pesada na concentração de 3 nM em tampão M5B (10 mM MOPS pH 7,3, 0,5 M NaCl, 0,1 mM EGTA, 3 mM NaN₃) com 2 μM de Calmodulina (CaM) por 5 min. Lavar com três volumes de 1 mg/mL de BSA biotinilada suplementada com 2 μM de CaM em AB e incubar por 3 min.
   2. Durante a incubação preparar a Mistura de Reação (RM): 0,005% α-actinina funcionalizada contas (seção 2.1), 1 nM de rodamina F-Actina (seção 2.3) em tampão de imagem (IB: tampão AB com 1,2 μM de glicose-oxidase, 0,2 μM de catalase, 17 mM de glicose, 20 mM de DTT, 2 μM CaM e ATP na concentração necessária para o experimento).
   3. Lave com RM e sele a câmara com graxa de silicone. A amostra está agora pronta para ser observada ao microscópio.

3. Medição

1. Monte o haltere.
   1. Procure as contas flutuantes de α-actinina movendo a amostra usando tradutores de longo alcance, ligue uma armadilha e prenda uma conta.
   2. Uma vez que a primeira armadilha esteja ocupada, mova o tradutor para posicionar o talão preso perto da superfície da tampa para evitar a captura de várias contas e prenda outro talão na segunda armadilha.
   3. Ajuste as duas armadilhas para rigidezes iguais, ajustando a potência das ondas acústicas dos AODs. As rigidezes são geralmente definidas entre 0,03 e 0,14 pN/nm. Quanto menor a rigidez, menor o ruído de força, em particular em forças baixas.
   4. Em seguida, vire o espelho motorizado M (Figura 2) para alternar para microscopia de fluorescência e procure um filamento de actina flutuando em solução, deslocando a amostra por meio de tradutores de longo alcance¹³. Prefira filamentos longos (>5 μm), uma vez que a miosina processiva irá deslocá-lo e movê-lo por alguns mícrons antes de se desprender.
   5. Mova a amostra para deixar uma das contas presas se aproximar de uma extremidade do filamento até que se fixem umas às outras. Em seguida, ajuste a distância das contas para o comprimento aproximado do filamento e crie um fluxo na direção do segundo grânulo não ligado, movendo o palco em sua direção. O filamento será esticado pelo fluxo e acabará por se ligar a ele¹³. O complexo contas-actina-contas é chamado de "haltere".
2. Estabeleça contato actina-miosina.
   1. Separe suavemente as duas armadilhas distantes para pré-tensionar o filamento até cerca de 3 pN e sonde a rigidez do haltere, fazendo com que uma armadilha oscile em uma onda triangular, alterando a frequência de um dos dois AODs e verificando a consequente transmissão do movimento para o cordão de fuga através de seu sinal de posição.
   2. Mova o palco para colocar o haltere na proximidade de um grânulo de sílica de pedestal e permita o contato entre o filamento e a proteína anexada à superfície do talão, ajustando a altura dos centros do grânulo preso ligeiramente abaixo do diâmetro do talão de sílica. Em seguida, posicione o centro do grânulo de sílica entre as contas presas.
3. Feedback de estabilização de pinça de força e nm:
   1. Ligue a braçadeira de força ultrarrápida com força de 2-3 pN e oscilação de 200 nm e escaneie o grânulo do pedestal em passos discretos de cerca de 20-30 nm na direção perpendicular ao filamento de actina. Aguarde que as interações ocorram em cada posição (alguns segundos) e, em seguida, avance se nenhuma interação for observada. À medida que a interação proteína-filamento é estabelecida, procure a posição em que as interações são mais frequentes.
   2. Certifique-se de que, quando a miosina processiva se move em direção a uma extremidade do filamento de actina (geralmente a extremidade +), o grânulo preso preso à extremidade + se move em direção ao grânulo de sílica. Mova o palco em direção à extremidade do filamento de modo que o grânulo de sílica fique o mais próximo possível do grânulo preso preso à extremidade do filamento quando a miosina não estiver ligada e inicie o feedback de estabilização nanométrica. Ao fazer isso, a probabilidade de que o grânulo preso preso à extremidade do filamento colida com o grânulo de sílica é minimizada.
4. Registrar dados.

4. Análise dos dados⁴

NOTA: O método de análise descrito permite a detecção e medição de corridas processivas e eventos de passo rápido com base em mudanças na velocidade do haltere, como causado pelo passo da miosina. A análise de corridas processivas é realizada com base em um método de análise de dados para motores não processivos descrito nas referências ^3,4,13.

1. Defina um limite para alterações de velocidade para permitir a detecção de eventos de revisão. Uma vez que, neste caso, são esperados passos para a frente e para trás, a travessia do limiar é aceite em ambas as direcções.
2. Atribua cada etapa à execução correspondente: se o intervalo de tempo entre duas etapas consequentes for menor que 3 ms e a amplitude das etapas for < 90 nm, as etapas serão atribuídas à mesma execução, caso contrário, as etapas serão atribuídas a diferentes execuções⁴.
3. Comprimento de execução correto para as forças de assistência⁴.
   1. Corrija os comprimentos de corrida sob forças auxiliares calculando o valor real do comprimento de execução RL a partir do valor médio medido do comprimento de execução <RL_m> da seguinte equação, onde D é a faixa de oscilação:
      
      NOTA: Detalhes sobre a derivação desta equação podem ser encontrados na referência⁴.

Os dados representativos consistem em registros de posição ao longo do tempo, conforme mostrado na Figura 4. No registro de posição dois tipos de deslocamento são visíveis. Em primeiro lugar, quando o motor de miosina não está interagindo com o filamento de actina, as esferas presas estão se movendo a uma velocidade constante contra a força de arrasto viscosa da solução, mostrando um deslocamento linear oscilando dentro da faixa de oscilação definida pelo operador em uma onda triangular³ (não visível na Figura 4 devido à longa escala temporal). Em segundo lugar, uma vez que o motor da miosina interage com o filamento, a força transportada pelo filamento em movimento é muito rapidamente transferida para a proteína, a velocidade do sistema cai para zero (linhas vermelhas na Figura 4) e os eventos de pisada ocorrem sob força constante até o final da corrida. Como mostrado na Figura 5, a força é comutada da direção positiva para a negativa (e vice-versa) pelo sistema de feedback, que muda a direção da força quando o talão atinge a borda da faixa de oscilação definida pelo usuário. Em alguns casos, pode acontecer que, quando a miosina se liga e desloca o filamento para a direção positiva, ela empurra o talão em direção à borda (superior) da faixa de oscilação. Se isso acontecer sob força de assistência (ou seja, direcionada para deslocamento positivo, empurrar, na Figura 5), o curso da miosina será interrompido pela inversão da direção da força na borda de oscilação (setas na Figura 5), limitando assim o comprimento da corrida à amplitude da oscilação do haltere D. Isso requer uma correção do comprimento de execução em caso de força de assistência (4.3.1).

Figura 1: Esquema da UFFCS aplicado a um motor processivo de miosina-5B. (a) Uma única molécula de miosina-5B é anexada a um pedestal de contas de vidro através de uma ligação estreptavidina-biotina. Um único filamento de actina é preso suspendendo-o entre contas revestidas de α-actinina (a chamada geometria de "três contas"). As setas pretas representam a força presa à direita (F₁) e ao grânulo esquerdo (F₂), a seta vermelha representa a força líquida (F) no haltere. F é alternado para frente e para trás para manter o haltere dentro de uma faixa de oscilação limitada quando a miosina não está ligada à actina. (b) Exemplo de vestígio mostrando deslocamento e força durante as fases correspondentes de oscilação de halteres, fixação de miosina-5B e execuções processivas sob cargas assistivas (empurrar) e resistivas (puxar). Este valor foi modificado de⁴. Os dados brutos adquiridos a uma taxa de amostragem de 200 kHz são plotados. Std. Dev. de força é de cerca de 0,27 pN. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Esquema óptico da configuração experimental. O microscópio óptico consiste em: lâmpada halógena (H), condensador (C), amostra (S), tradutores piezo (x-y e z), objetiva (O), uma câmera de baixa ampliação (CCD 200X) e uma câmera de alta ampliação (CCD 2000X) usada para o feedback de estabilização do nm. Pinças ópticas duplas são inseridas e extraídas do eixo óptico do microscópio através de espelhos dicroicos (D2 e D3) e compreendem: laser Nd:YAG (1064 nm), isolador óptico (OI), placas de onda λ/2, cubos divisores de feixe polarizador (PBS), defletores acousto-ópticos (AOD), filtros interferenciais de 1064 nm (F1 e F2), fotodiodos detectores de quadrante (QDP). Os sinais dos QDPs foram elaborados com um FPGA, enviados para dois sintetizadores digitais diretos (DDS) personalizados que conduzem os AODs (force feedback). A excitação por fluorescência foi fornecida por um laser Nd:YAG duplicado (532 nm) e a imagem projetada em uma câmera multiplicada por elétrons (EMCCD). M é um espelho móvel, F3 um filtro de emissão. Este valor foi modificado de ³. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Montagem da câmara de fluxo . (a) Preparação da câmara. Uma tampa de vidro, manchada com contas de sílica, é anexada a uma lâmina de microscópio através de listras duplas de fita adesiva para formar uma célula de fluxo de cerca de 20 μL de volume. b) Vista superior da célula de fluxo. As soluções são voadas de um lado da câmara com uma pipeta e sugadas do outro lado através de um papel de filtro para criar um fluxo ao longo da direção da seta. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Registro da posição representativa. Registro de posição mostrando execuções processivas de miosina-5B e o algoritmo de detecção de passos e execuções. O início e o fim detectados de cada corrida são indicados por linhas verticais verdes e ciano, respectivamente. Linhas horizontais vermelhas indicam as etapas detectadas. Este valor foi modificado de⁴. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Inversão forçada durante as corridas de miosina. Quando a miosina se liga e move o filamento na direção positiva sob força assistiva (empurrar), pode acontecer que ele atinja a borda da faixa de oscilação onde a força é revertida (indicada pelas setas), de modo que a miosina executada sob força de assistência é interrompida. Pelo contrário, sob força resistiva (puxar), o passo processivo da miosina impede que o haltere atinja o ponto de inversão da força. Portanto, neste último caso, os comprimentos de corrida não são limitados pela faixa de oscilação para forças resistivas. Este valor foi modificado de⁴. Os dados brutos adquiridos a uma taxa de amostragem de 200 kHz são plotados. Std. Dev. de força é de cerca de 0,27 pN. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Embora as técnicas de molécula única, como o ensaio de três contas, sejam tecnicamente desafiadoras e de baixo rendimento, o UFFCS melhora a detecção de interações moleculares graças à alta relação sinal-ruído dos dados. A UFFCS permite o estudo da dependência de carga de proteínas motoras, com as principais vantagens de aplicar a força muito rapidamente após a ligação do motor ao filamento para sondar eventos precoces e muito rápidos na produção de força e estados de ligação fracos sob força controlada; mantendo a força constante durante toda a corrida e sondando a dependência do motor com controle total sobre a direcionalidade da força. Em relação ao último ponto, a geometria de três contas como usamos aqui é muito eficiente na aplicação e medição de forças ao longo da direção do filamento, minimizando as contribuições de componentes transversais ou verticais. No entanto, quando se espera que a proteína motora produza ativamente forças transversais ou verticais, ou mesmo torques, outras configurações, como a geometria do cordão único, são mais apropriadas 2,7,18. Além disso, graças à sua resolução espacial e temporal, a UFFCS representa uma ferramenta única para a compreensão dos fundamentos das interações moleculares que, de outra forma, seriam prejudicadas com as técnicas convencionais de molécula única. De fato, a UFFCS possibilitou investigar como as forças assistiva e resistiva regulam a resposta mecânica da miosina-5B, dando assim uma nova visão de seu comportamento coletivo dentro da malha de actina na célula⁴.

No entanto, o sucesso desses experimentos depende do cumprimento de alguns requisitos importantes que devem ser abordados com muito cuidado, seguindo todas as instruções encontradas neste protocolo: o alinhamento e isolamento precisos da configuração óptica é fundamental para alcançar uma resolução espacial ideal; é necessária uma calibração cuidadosa do sistema óptico para determinar os valores das forças aplicadas com alta precisão; a configuração de um sistema de feedback rápido é necessária para alcançar a alta resolução temporal; por fim, todos os componentes que são montados na câmara de amostra devem ser preparados em ambiente controlado, mantendo-os o mais estéreis possível, uma vez que qualquer impureza na câmara de amostra pode comprometer o experimento, e todas as indicações sobre seu ótimo armazenamento e manuseio devem ser rigorosamente respeitadas para o sucesso do protocolo experimental. É importante ressaltar que a análise de dados deve ser cuidadosamente adaptada aos diferentes tipos de interações motor-filamento para interpretar adequadamente os resultados e evitar artefatos.

Neste protocolo estão incluídas todas as etapas para a realização de experimentos ultrarrápidos de pinça de força em motores de miosina processiva-5, desde a instalação de aparelhos experimentais até a preparação da amostra, medição e análise de dados, que poderiam ser convenientemente adaptados para estudar uma variedade de miosinas não convencionais e outras classes de motores processivos, como cinesinas e dineínas.

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Este trabalho foi apoiado pelo programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo do Acordo de Subvenção n.º 871124 Laserlab-Europe, pelo Ministério da Universidade e Investigação italiano (FIRB "Futuro in Ricerca" 2013 Grant No. RBFR13V4M2) e por Ente Cassa di Risparmio di Firenze. A.V. Kashchuk foi apoiado pela Human Frontier Science Program Cross-Disciplinary Fellowship LT008/2020-C.

An erratum was issued for: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy. The title was updated.

The title was updated from:

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

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Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy