Medindo atividade antifúngica volátil e não volátil de produtos de biocontrole

Descrevemos um método modificado à base de ágar projetado para quantificar os efeitos antifúngicos de produtos derivados de plantas. Tanto contribuições voláteis quanto não voláteis para a atividade antifúngica podem ser avaliadas através deste protocolo. Além disso, a eficácia contra fungos pode ser medida em estágios-chave de desenvolvimento em uma única configuração experimental.

O protocolo descrito baseia-se em uma técnica de transferência de plug-plug que permite a determinação precisa das quantidades de microrganismos e seus estágios de desenvolvimento. Um número especificado de esporos estão espalhados em uma placa de ágar. Esta placa de ágar é incubada por um período definido para permitir que os fungos atinjam o estágio de desenvolvimento esperado, exceto para esporos onde a incubação não é necessária. Os plugues ágar cobertos por esporos, hifas ou micélio são retirados e transferidos para a mídia ágar contendo o composto antifúngico a ser testado a uma distância dos fungos ou em contato. Este método é aplicável para testar tanto extratos líquidos quanto amostras sólidas (pós). É particularmente adequado para quantificar as contribuições relativas de agentes voláteis e não voláteis em misturas bioativas e para determinar seus efeitos, especificamente sobre esporos, higiais precoces e micélio.

O método é altamente relevante para a caracterização da atividade antifúngica de produtos de biocontrole, notadamente produtos derivados de plantas. De fato, para o tratamento da estação, os resultados podem ser usados para orientar a escolha do modo de aplicação e estabelecer os limiares de gatilho.

As perdas globais de frutas e hortaliças podem atingir até 50% da produção¹ e resultar principalmente da decadência alimentar causada pela deterioração de fungos no campo ou durante o armazenamento pós-colheita^2,3, apesar do amplo emprego de fungicidas sintéticas desde meados do século^{XX 4}. O uso dessas substâncias está sendo reconsiderado, pois representa sérios riscos ambientais e à saúde. Como as consequências nocivas de seu uso estão aparecendo em todos os ecossistemas e evidências de potenciais impactos à saúde acumularam^5,6, novas alternativas às velhas estratégias profiláticas estão sendo desenvolvidas para tratamentos pré e pós-colheita^7,8,9. Por isso, o desafio que enfrentamos é duplo. Novas estratégias fungicidas devem, em primeiro lugar, manter os níveis de eficácia da proteção alimentar contra fitopatógenos e, em segundo lugar, contribuir para reduzir drasticamente a pegada ambiental das práticas agrícolas. Para cumprir esse objetivo ambicioso, estratégias inspiradas nas defesas naturais evoluídas nas plantas estão sendo propostas, pois mais de 1000 espécies de plantas foram destacadas por suas propriedades antimicrobianas⁸. Por exemplo, plantas que desenvolveram fungicidas naturais para combater fitopatógenos são um novo recurso na exploração do desenvolvimento de novos produtos de biocontrole². Óleos essenciais são moléculas emblemáticas desse tipo. Por exemplo, o óleo essencial origanum protege as plantas de tomate contra o molde cinza nas estufas ¹⁰ e solidago canadensis L. e óleos essenciais cássia têm sido mostrados para preservar morangos pós-colhidos de danos de moldes cinzentos^11,12. Esses exemplos ilustram que o biocontrole e, notadamente, os produtos derivados das plantas representam uma solução que combina eficácia biológica e sustentabilidade ambiental.

Assim, as plantas são um importante recurso de moléculas de potencial interesse para a indústria de proteção de culturas. No entanto, apenas um punhado de produtos vegetais foram propostos para serem usados como produtos de biocontrole, embora sejam geralmente reconhecidos como seguros, não fitóxicos e ecológicos². Algumas dificuldades na transposição do laboratório para o campo têm sido observadas, como a eficácia diminuindo uma vez aplicada in vivo^2,9. Assim, torna-se importante melhorar a capacidade dos testes de laboratório para melhor prever a eficácia do campo. Neste contexto, métodos de teste antifúngicos para produtos derivados de plantas são necessários tanto para avaliar sua eficácia antifúngica quanto para definir suas condições ideais de uso. Especificamente, os produtos de biocontrole são geralmente menos eficientes do que fungicidas químicos, por isso uma melhor compreensão de seu modo de ação é importante para propor formulações adequadas, identificar o modo de aplicação nos campos e definir qual estágio de desenvolvimento do patógeno é vulnerável ao bioproduto candidato.

As abordagens atuais que abordam atividades antibacterianas e antifúngicas incluem métodos de difusão, como difusão de disco de ágar, diluição, bioautografia e citometria de fluxo¹³. A maioria dessas técnicas, e mais especificamente, os testes padrão de suscetibilidade antifúngicos - ensaios de difusão e diluição de ágar-disco - são bem adaptados para avaliar a atividade antimicrobiana de compostos solúveis em esporos bacterianos e fúngicos em suspensões líquidas¹⁴. No entanto, esses métodos geralmente não são adequados para testar compostos sólidos, como pó vegetal seco ou para quantificar a atividade antifúngica durante o crescimento do micélio, pois requerem diluição de esporos ou esporos espalhados em placas de ágar e/ou diluição de compostos antifúngicos¹³. No método envenenado por alimentos, as placas de ágar contendo o agente antifúngico são inoculadas com um disco de 5-7 mm de diâmetro amostrado de uma cultura de fungos de 7 dias de idade sem considerar a quantidade precisa de micélio inicial. Após a incubação, a atividade antifúngica é determinada como um por cento da inibição do crescimento radial^17,18,19. Com essa abordagem podemos avaliar a atividade antifúngica no crescimento micelial. Em contraste, o método de diluição de ágar é realizado para determinar a atividade antifúngica em esporos diretamente inoculados na superfície da placa de ágar contendo os compostos antifúngicos^13,20,21. Essas duas abordagens dão resultados complementares sobre a atividade antifúngica. No entanto, estas são duas técnicas independentes usadas em paralelo que não fornecem comparação lado a lado precisa da eficácia relativa dos compostos antifúngicos em esporos e micélio^17,20,22 como a quantidade de material fúngico inicial difere nas duas abordagens. Além disso, a atividade antifúngica de um produto derivado de plantas muitas vezes resulta da combinação de moléculas antifúngicas sintetizadas pelas plantas para enfrentar patógenos. Essas moléculas abrangem proteínas, peptídeos^23,24, e metabólitos com ampla diversidade química e pertencentes a diferentes classes de moléculas como polifenóis, terpenos, alcaloïds²⁵, glucosinolas⁸, e compostos organosulfur²⁶. Algumas dessas moléculas são voláteis ou se tornam voláteis durante o ataque de patógenos²⁷. Esses agentes são, na maioria das vezes, compostos solúveis em água e alta pressão de vapor que devem ser recuperados através da destilação da água como óleos essenciais, alguns dos quais atividades antimicrobianas foram bem estabelecidas²⁸. Ensaios de suscetibilidade mediados em fase de vapor foram desenvolvidos para medir a atividade antimicrobiana de compostos voláteis após a evaporação e migração através da fase de vapor²⁹. Esses métodos baseiam-se na introdução de compostos antifúngicos à distância da cultura microbiana^{29,30,31,32,33}. No ensaio ágar comumente usado em fase de vapor, óleos essenciais são depositados em um disco de papel e colocados no centro da tampa da placa de Petri à distância da suspensão de esporos bacterianos ou fúngicos, que é espalhada no meio ágar. O diâmetro da zona de inibição do crescimento é então medido da mesma forma que para o método de difusão do disco de ágar^20,24. Outras abordagens foram desenvolvidas para fornecer a medição quantitativa da suscetibilidade antifúngica da fase vapor de óleos essenciais, derivadas do método de diluição do caldo do qual foi calculada uma atividade antimicrobiana mediada por vapor inibitório³², ou derivado de ensaios de difusão de ágar-disco³¹. Esses métodos são geralmente específicos para estudos de atividade em fase de vapor e não são apropriados para ensaios de inibição de contato. Isso exclui a determinação da contribuição relativa de agentes voláteis e não voláteis para a atividade antifúngica de uma complexa mistura bioativa.

O método quantitativo que desenvolvemos visa medir o efeito antifúngico do pó de plantas secas em quantidades controladas de esporos e micélio cultivado depositado na superfície de um meio de ágar para reproduzir o crescimento aéreo de fitopatógenos durante a infecção das plantas^15, bem como uma rede mycelial interconectada¹⁶. A abordagem é uma configuração experimental modificada baseada nos métodos de diluição de ágar e alimentos envenenados que também permite, na mesma configuração experimental, quantificação lado a lado da contribuição de metabólitos antifúngicos voláteis e não voláteis. Neste estudo, o método foi avaliado em relação à atividade de três preparações antifúngicas bem caracterizadas.

1. Preparação de inócula

1. Antes do experimento, estava 5 μL de Trichoderma spp. Os esporos SBT10-2018 armazenados a 4 °C no natural de ágar médio (PDA) e incubam por 4 dias a 30°C com exposição regular à luz para promover a formação conidia⁴² (Figura 1, painel A).
   NOTA: Trichoderma spp. O SBT10-2018 foi isolado da madeira e é usado como modelo neste estudo para seu rápido crescimento e facilidade de recuperação de esporos. Esta cepa é preservada pelo nosso laboratório.
2. Recuperar conidia (Figura 1, painel A)
   1. Coloque 3 mL de 0,05% Tween-20 no mycelium Trichoderma.
   2. Use um ancinho para liberar conidia de conidioforos; evite pressionar o micélio para evitar que a hifa seja arrancada.
   3. Recupere a solução rapidamente com uma micropipette para evitar que ela seja absorvida pelo meio ágar e transfira para um tubo de 15 mL.
   4. Conte o número total de esporos usando um hemócito e prepare uma solução contendo 3 x 10⁶ esporos/mL.
      NOTA: Esta etapa deve ser realizada cuidadosamente para evitar que a hifa seja extraída. A preparação do esporo é então verificada sob microscópio. Eventualmente, para cepas que apresentam micélio altamente aéreo e fofo, um passo de filtração usando filtro de coador de 40 μM pode ser adicionado para eliminar fragmento de micélio residual.

2. Preparação de placas fúngicas(Figura 1, painel B)

1. Deposite 100 μL de 3 x 10⁶ esporos/mL com uma micropipette em uma placa de Petri de 9 cm de diâmetro contendo meio PDA para obter 4.800 esporos/cm² correspondentes a 925 esporos/5 mm de diâmetro-ágar plug.
2. Adicione 10 g de contas de vidro de 2 mm de diâmetro com uma espátula estéril e realize movimentos para frente e para trás paralelos e perpendiculares ao braço do operador para distribuir uniformemente os esporos na superfície do ágar.
3. Gire a placa em 90° e repita os movimentos rotativos (como na seção 2.2); repita estes passos até que a placa tenha sido girada completamente.
4. Use a placa imediatamente para configurar experimentos que requerem esporos ou incubar as placas a 30 °C por 17 h ou 24 h quando forem necessários hyphae cedo ou micélio, respectivamente.
   NOTA: Para comparar a atividade antifúngica medida após a transferência de plug-de-púlio e a transferência de disco de micélio, use pinças estéreis e coloquem discos de celulose estéreis de 5 mm aleatoriamente na superfície da placa de ágar após a propagação do esporo.

3. Preparação de compostos antifúngicos

1. Preparação do produto derivado da planta: preparação em pó de alho
   1. Descasque os cravos de alho fresco e corte os cravos em fatias de 2-3 mm de largura usando uma lâmina de bisturi.
   2. Seque as fatias por 2 dias a 40 °C.
   3. Triture as fatias por 3 x 15 segundos usando um moinho de faca para obter um pó fino.
   4. Armazene o pó de alho a 4 °C em tubos de 50 mL antes de usar.
      NOTA: Como o alho não é autoclaved (para evitar a degradação de compostos antifúngicos sensíveis à temperatura) limpe o moedor, o bisturi e o secador de ar com 70% de etanol antes de usar.
2. Preparação de óleo essencial
   1. Prepare 0,5%, 1%, 2,5%, 5% e 20% Thymus vulgaris soluções de óleo essencial em 0,5% Tween-80.
   2. Misture bem para formar uma emulsão antes de adicioná-la ao meio PDA (ver seção 4.2).
3. Preparação de carbendazim
   1. Pesar carbendazim para preparar uma solução de etanol de 200 mg/L (carbendazim é mal solúvel em água).
   2. Armazene a solução à temperatura ambiente antes de adicioná-la ao meio PDA (ver seção 4.2).
      ATENÇÃO: O carbendazim apresenta um risco à saúde e ao meio ambiente. Use luvas e máscara ao manusear este produto. Guarde-o em um espaço ventilado.

4. Ensaio de inibição de contato

1. Preparação de pratos de ágar contendo pó de alho
   1. Prepare e autoclave meio PDA.
   2. Pesar a quantidade desejada de pó de alho em um tubo de 50 mL usando uma espátula estéril, para obter concentrações geralmente variando de 0,25 mg/mL a 16 mg/mL.
   3. Adicione 10 mL de PDA depois de ter verificado a temperatura do meio no interior do pulso. A temperatura deve ser o mais baixa possível para evitar a degradação de moléculas sensíveis. O ideal é que esta temperatura seja de 45 °C.
   4. Homogeneize cuidadosamente girando o tubo de cabeça para baixo para distribuir uniformemente o pó no meio PDA. Despeje rapidamente 10 mL em uma placa de Petri de 5 cm de diâmetro(Figura 1, painel C).
   5. Com a placa de Petri colocada em temperatura ambiente, espere até o ágar se solidificar.
2. Preparação de placas de ágar contendo óleo essencial ou carbendazim
   1. Introduza 10 mL de PDA em um tubo de 50 mL. Verifique a temperatura quanto à seção 4.1.3.
   2. Adicionar 100 μL das diferentes soluções de Thymus vulgaris óleo essencial no PDA para obter 0,005%, 0,01%, 0,025%, 0,05% e 0,2% soluções (ver seção 3,2,1).
   3. Adicione o volume necessário de carbendazim da solução de 200 mg/L para obter soluções que variam de 0,0625-2 mg/L (ver seção 3.3.1).
   4. Homogeneize cuidadosamente girando o tubo de cabeça para baixo, despeje rapidamente 10 mL em uma placa de Petri de 5 cm de diâmetro(Figura 1, painel C).
   5. Com a placa de Petri colocada em temperatura ambiente, espere até o ágar se solidificar.
3. Ensaio de inibição de contato(Figura 1)
   1. Com um tubo de aço inoxidável estéril de 5 mm de diâmetro, trace um círculo no centro de placas de Petri contendo PDA ou PDA, incluindo compostos antifúngicos. Descarte o cilindro de ágar usando um palito estéril (painel C).
   2. Com um tubo de aço inoxidável estéril de 5 mm de diâmetro, o enredo gira aleatoriamente nas placas fúngicas da seção 2. Plote entre 15-20 círculos por placa (painel B).
   3. Retire cuidadosamente os cilindros de ágar cobertos por esporos, hipófas precoces ou micélio com um palito estéril e coloque os plugues no espaço vazio das placas de Petri contendo PDA ou PDA, incluindo compostos antifúngicos (painel C).
   4. Incubar as placas contendo esporos por 48h a 30 °C, 31 h para as placas contendo higfia precoce e, 24h para as placas cobertas com micélio (painel C).
   5. Meça o diâmetro do crescimento radial e calcule a porcentagem da inibição de crescimento fúngico sobre o controle usando a fórmula (painel D)
      % inibição do crescimento fúngico = (C - A/C)* 100
      onde C é o diâmetro do crescimento radial em médio PDA e A o diâmetro do crescimento radial no meio PDA contendo os compostos antifúngicos.
      NOTA: Para comparar a atividade antifúngica medida após a transferência de plug-de-púlio e a transferência de disco de micélio, usando pinças estéreis, transfira um disco de 5 mm de diâmetro previamente depositado na superfície das placas fúngicas (nota da seção 2) no centro das placas de Petri contendo PDA ou PDA contendo compostos antifúngicos e proceda exatamente quanto à transferência de ágar-plug

5. Ensaio de inibição de fase de vapor

1. Preparação de pratos de ágar contendo pó de alho
   1. Prossiga como na seção 3.1.
2. Preparação de placa de ágar contendo óleo essencial ou carbendazim
   1. Prossiga como nos trechos 3.2 e 3.3.
3. Preparação de placas fúngicas
   1. Prossiga como na seção 2.
4. Ensaio de inibição antifúngica da fase vapor(Figura 1)
   1. Despeje 10 mL de meio PDA na tampa das placas petri de 5 cm de diâmetro contendo 10 mL de meio PDA ou 10 mL de meio PDA contendo compostos antifúngicos no fundo dos pratos. Aguarde até a solidificação completa do ágar à temperatura ambiente (painel C).
   2. Use um tubo centrífugo de 50 mL como ferramenta de calibração para obter um círculo de PDA no centro da tampa; remova o PDA ao redor do círculo com uma espátula estéril (painel C).
   3. Trace um círculo no centro do meio PDA colocado na tampa com um tubo de aço inoxidável estéril de 5 mm de diâmetro. Descarte o ágar-cilindro com um palito estéril (painel C).
   4. Formar plugues com um tubo de aço inoxidável estéril de 5 mm de diâmetro aleatoriamente nas placas fúngicas como na seção 4.3.2 (painel B).
   5. Usando um palito estéril, transfira cuidadosamente os plugues cobertos com esporos, higifize precoce ou micélio de placas fúngicas para as tampas das placas de ensaio (painel C).
   6. Incubar a 30 °C como na seção 4.3.4 (painel C).
   7. Meça o diâmetro do crescimento radial e calcule o percentual de inibição do crescimento fúngico usando a fórmula na seção 4.3.5 (painel D).

Para avaliar a capacidade do método quantitativo de discriminar o modo de ação de diferentes tipos de compostos antifúngicos, comparamos a eficácia de três agentes antifúngicos conhecidos. Carbendazim é um fungicida sintético não volátil que tem sido amplamente utilizado para controlar uma ampla gama de doenças fúngicas nas plantas^39,40. O óleo essencial de timo vulgar foi descrito em grande parte por sua atividade antibacteriana e antifúngica e é usado como agente conservante de alimentos naturais⁴¹. O pó de alho foi escolhido como modelo de um bioproduto derivado de plantas. Tem sido tradicionalmente usado como um remédio natural com atividades antimicrobianas que têm sido em grande parte atribuídas à presença de compostos organosulfur voláteis, mas também à presença de saponinas não voláteis e compostos fenólicos^26,dando a este modelo uma complexidade relevante neste estudo.

Este método quantitativo baseia-se na transferência de plugues de ágar contendo quantidades controladas de fungos em diferentes estágios de desenvolvimento, desde esporos até micélio, enquanto no método envenenado por alimentos, o micélio de 5 dias a 7 dias é transferido dos discos de^{celulose 13}. No ensaio, esporos, hifas precoces (incubação de 17 h) e micélio (incubação de 24 h) foram utilizados como material fúngico inicial. O uso da transferência de disco pode não ser relevante, pois conidia ou higifize residual permanecem pelo menos parcialmente no meio ágar após a transferência de disco, levando posteriormente a uma medição imprecisa da inibição do crescimento como ilustrado na Figura 2. Diferentes diâmetros do crescimento fúngico-radial foram observados após a transferência de áreas de ágar localizadas sob discos de celulose seguidos de incubação de 24 h(Figura 2,painéis A, B e C) destacando a presença de hifas fúngicas residuais no ágar após a transferência do disco. A quantificação da hifa residual foi confirmada pela medição do crescimento que leva a variabilidade de até 22% de diâmetro(Figura 2, painel D). O efeito sobre a inibição do crescimento foi avaliado em seguida usando o óleo essencial thymus vulgaris como composto antifúngico e comparado com a inibição obtida após a transferência do ágar-plug(Figura 2, painel E). A inibição do crescimento após a transferência do disco foi maior do que após a transferência de ágar-plug para baixas concentrações de óleo de Timo, levando a uma superestimação do efeito inibidor, que pode ser devido à transferência incompleta de material fúngico e apoiar a abordagem com base na transferência de plugue de ágar.

Trichoderma Spp. A inibição de crescimento do SBT10-2018 desencadeada pelos três compostos antifúngicos foi avaliada em seguida utilizando os ensaios de inibição de contato e fase de vapor para cada estágio fúngico(Figura 3). Esporos foram cuidadosamente espalhados em placas de ágar para obter 4.800 esporos/cm². Eles foram diretamente transferidos para placas de ágar contendo compostos antifúngicos através da extração de ágar-plug usando um tubo de aço inoxidável estéril de 5 mm, permitindo que o experimento começasse a partir dos esporos. Para as duas outras etapas de desenvolvimento, as placas de ágar cobertas com esporos foram incubadas primeiro por 17 h ou 24 h a 30°C antes de transferir o plugue de ágar para permitir a germinação e o desenvolvimento precoce da hifa (17 h) e formação de micélio (24 h)(Figura 3, painel A). Para quantificar a contribuição de moléculas voláteis ativas para a atividade antifúngica global, o ensaio de inibição de contato foi adaptado e esporos, hipófas precoces e micélio foram colocados a uma distância dos compostos antifúngicos derramados no meio PDA quanto ao ensaio de inibição de contato. O crescimento trichoderma-radial foi medido ao longo de 48 horas e o percentual de inibição foi determinado em comparação com as condições de controle. A concentração mínima-inibitória (MIC) foi definida como a menor concentração de compostos antifúngicos impedindo o crescimento visível após 48h de incubação a 30°C.

A Figura 3(painel B) mostra maior sensibilidade ao carleto ao carbendazim em comparação com as redes de hipófa e micélio precoce com 50%, 22% e 30% de inibição de crescimento, respectivamente, a 0,25 μg/mL carbendazim quando os compostos trichoderma e antifúngico estavam em contato. Concomitantemente, um valor MIC de 0,5 μg/mL foi estimado na germinação de esporos, enquanto um aumento para 0,75 μg/mL foi obtido no alongamento da hifa precoce e no micélio. Em contrapartida, o carbendazim não teve efeito antifúngico no Trichoderma quando o fungo foi colocado à distância do fungicida de acordo com a baixa volatilidade desta substância. Os resultados obtidos utilizando o óleo essencial thymus vulgaris (TEO) como composto antifúngico(Figura 3, painel C) mostraram maior sensibilidade esporo ao TEO em comparação com o hífa e micélio precoce com 65% e aproximadamente 50% de inibição de crescimento a 0,01% teo, respectivamente. Os valores MIC obtidos foram semelhantes para germinação de esporos e alongamento de higifize precoce (0,025% TEO) e maior para o crescimento do micúlio (0,05% TEO). Como esperado, o óleo essencial thymus vulgaris apresentou atividade antifúngica idêntica, independentemente da distância entre o fungo e o óleo. Valores mic semelhantes (0,025% TEO) foram obtidos na germinação de esporos e alongamento de higifizes precoces para ensaios de contato e fase de vapor, embora na menor porcentagem tenha sido observada maior sensibilidade quando os esporos TEO e Trichoderma estavam em contato (inibição de crescimento de 60% em contato versus 45% de inibição de crescimento à distância). Surpreendentemente, os valores mic obtidos no micúlio foram diferentes nos ensaios de inibição de contato e fase de vapor (0,05% versus 0,1%) sugerindo que alguma parte das moléculas voláteis não está ativa contra um micélio bem desenvolvido. Finalmente, ao usar pó de alho como composto antifúngico(Figura 3, painel D), observou-se maior eficácia contra a germinação de esporos (inibição de crescimento de 50% a 0,25 mg/mL de alho em pó e valor MIC de 0,5 mg/mL) e alongamento da hifa precoce (0,25 mg/mL de alho em pó e valor MIC de 0,5 mg/mL) e alongamento da hifa precoce (0,25 mg/mL de alho Inibição de crescimento de 59% a 0,25 mg/mL e valor MIC de 0,5 mg/mL) do que para o crescimento do micúlio (inibição de crescimento de 29% a 0,5 mg/mL de alho em pó e valor MIC de 0,75 mg/mL). Quando os ensaios de contato e fase de vapor foram comparados, os resultados mostraram uma diminuição significativa da atividade antifúngica à distância, independentemente do estágio de desenvolvimento do fungo. Os valores MIC passaram de 0,5 mg/mL para 1 mg/mL para germinação de esporos, de 0,5 mg/mL para 2 mg/mL para alongamento de higianião precoce, e de 0,75 mg/mL para 4 mg/mL para crescimento de micélio(Figura 3, painel D e Figura 4 para imagens representativas). Assim, esses resultados sugerem que o pó de alho contém uma mistura de compostos voláteis e não voláteis com propriedades antifúngicas.

Ao todo, esses resultados mostram que a contribuição relativa de agentes voláteis e não voláteis contidos em produtos derivados de plantas pode ser determinada em diferentes estágios de crescimento fúngico, uma vez que as condições experimentais são comparáveis. Esta abordagem é então particularmente adequada para misturas complexas de compostos antifúngicos. O óleo essencial de timo vulgar é uma mistura de compostos voláteis e mostra uma atividade semelhante à distância e em contato para germinação de esporos e alongamento de higifize precoce, apoiando a comparação deste ensaio de fase de vapor e inibição de contato e destacando que a migração para a fase de vapor não é prejudicada por derramar no meio ágar. Os resultados também sublinham que o pó de alho usado como modelo neste estudo contém componentes ativos não voláteis que têm uma contribuição significativa na atividade antifúngica global e que foram negligenciados em favor de tiosulfinatas voláteis derivados de allium^27,28.

Figura 1: Esquema sinóptico do protocolo para ensaios de contato e fase de vapor Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imprecisão associada à transferência fúngica do disco de celulose. A. Esquema que representa transferência de disco para placas de ágar cobertas por esporos e transferência de disco para a superfície em placas de ágar contendo compostos antifúngicos B. Esquema representando transferência de ágar de áreas sob discos de celulose seguido de incubação e medição de crescimento residual. C. Imagem representativa do crescimento radial do micélio residual após a transferência de áreas sob discos de celulose. D. Medição de crescimento radial de micélio residual. E. Efeito de Timo vulgaris óleo essencial sobre o crescimento de micélio transferido do disco de celulose ou plugue de ágar (N=2, média ± SD) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Comparação das atividades antifúngicas utilizando os ensaios de inibição de vapor e inibição de contato em esporos, higifize precoce e micélio. A. Fotos representativas dos esporos de Trichoderma, hifas precoces (crescimento de 17h) e micélio (crescimento de 24h). Inibição do crescimento de trichoderma por carbendazim(B), timo vulgaris óleo essencial(C) e alho em pó(D). (N=2, média ± SD) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Imagens representativas da atividade antifúngica do alho em placas de ágar em ensaios de inibição de contato - (A) ou fase de vapor (B) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A abordagem aqui apresentada permite a avaliação de propriedades antifúngicas de produtos minimamente processados derivados de plantas. Neste protocolo, a distribuição homogênea dos esporos na superfície do ágar é alcançada utilizando contas de vidro de 2 mm. Esta etapa requer habilidades de manuseio para distribuir corretamente as contas e obter resultados reprodutíveis, permitindo, em última análise, a comparação de efeitos antifúngicos em diferentes estágios de crescimento fúngico. Descobrimos que contas de vidro de 5 mm ou rotação excessiva durante a homogeneização durante a propagação podem causar diâmetro de crescimento variável. Por isso, recomendamos treinamento para dominar a distribuição de esporos antes da experimentação. Além disso, quando os pós vegetais devem ser testados, deve-se prestar atenção à dispersão homogênea do produto no meio do ágar. Para evitar que o pó se instale na parte inferior da placa, o produto deve ser misturado em meio de ágar quando a temperatura do meio derretido atingir 45 °C (quando a temperatura ambiente é de 24 °C). Esta temperatura deve ser ajustada de acordo com a temperatura ambiente local para evitar sedimentação.

Embora o método que descrevemos aqui possa fornecer insights valiosos, algumas desvantagens devem ser consideradas. Este método permite comparações precisas e lado a lado em uma única configuração experimental em detrimento de uma quantidade significativa de tempo de preparação, pois o número de placas de ágar a serem preparadas pode ser considerável dependendo das perguntas que devem ser respondidas. Além disso, este ensaio é um ensaio de média escala projetado para placas de Petri de 5 cm. Portanto, a quantidade de substâncias ativas necessárias para testar todos os aspectos pode ser substancial. Isso significa que substâncias raras podem não ser candidatos a teste adequados para este protocolo. Uma redução do ensaio pode ser considerada usando placas menores de Petri e reduzindo o tamanho dos plugues. Isso poderia ser testado usando o protocolo de benchmarking descrito aqui com especial atenção à extração de agar-plug, o que pode ser difícil. A precisão das medidas de crescimento radial pode ser reduzida a essa escala menor.

Os métodos atuais são apropriados para medir a atividade antifúngica dos compostos em solução e menos aplicáveis ao estudo dos pós¹³. A abordagem que estabelecemos é bem adaptada para compostos líquidos e sólidos, o que permite a avaliação das propriedades antifúngicas de produtos minimamente processados derivados de plantas. Isso reduz o tempo necessário para testar extratos e reduz as armadilhas relacionadas a substâncias ativas que apresentam má solubilidade. Como alguns produtos derivados de plantas contêm moléculas ativas sensíveis à alta temperatura^43,isso oferece a vantagem de limitar o risco de perda de atividade desses compostos. Esta abordagem foi adaptada do método de difusão de ágar e do método envenenado por alimentos^{15,16,17,18,19} para permitir adicionalmente a comparação direta de atividades antifúngicas em diferentes estágios de crescimento fúngico usando configurações experimentais semelhantes. A transferência de plugue de ágar permite um controle preciso das quantidades de microrganismos dentro do ensaio. Esta é uma vantagem sobre a transferência de disco, o que leva à superestimação de efeitos antifúngicos associados à transferência incompleta de esporos ou hifas. Finalmente, considerando que os ensaios da fase vapor geralmente não são aplicados aos ensaios de inibição de contato^{27,28,29,30,31}, o método que propomos aborda as contribuições relativas de agentes voláteis e não voláteis contidos em misturas complexas, como pós de plantas ou extratos e, em última instância, permite a avaliação de atividades antifúngicas em diferentes estágios de crescimento fúngico.

A abordagem que descrevemos aqui pode ser particularmente relevante para apoiar a necessidade de métodos que avaliam propriedades antifúngicas em produtos derivados de plantas para o biocontrole. O método quantitativo proposto permite que os operadores determinem as respectivas contribuições de compostos voláteis e não voláteis à atividade antifúngica de uma mistura bioativa complexa. Isso fornece informações valiosas que podem orientar a escolha dos modos de aplicação para o tratamento e a relevância da realização da extração líquida. Aplicações que podem ser consideradas à distância do fitopatógeno-alvo (por exemplo, inclusão do produto de biocontrole em uma embalagem) ou podem precisar de contato direto para otimizar a eficácia do produto de biocontrole (nebulização nas plantas ou mergulhar frutas em uma solução de produto de biocontrole). Também permite a comparação da eficácia antifúngica em diferentes estágios de crescimento fúngico, desde a germinação de esporos até o crescimento do micélio em estágio posterior, o que leva à definição de recomendações para estabelecer limites de controle necessários para aplicar produtos de biocontrole às culturas. De fato, definir a eficácia das substâncias em diferentes estágios fúngicos pode ajudar a categorizar se as substâncias podem ser utilizadas como tratamentos preventivos ou curativos e planejar o cronograma de tratamentos vegetais com produtos de biocontrole. Isso é essencial para alavancar a eficácia dos produtos quando utilizados em campo ou pós-colheita.

nenhum

Somos muito gratos a Frank Yates por seu precioso conselho. Este trabalho foi apoiado pela Sup'Biotech.