Misurazione dell'attività antifungina volatile e non volatile dei prodotti biocontrollo

Descriviamo un metodo modificato a base di agar progettato per quantificare gli effetti antifungini dei prodotti di origine vegetale. Sia i contributi volatili che i contributi non volatili all'attività antimicotica possono essere valutati attraverso questo protocollo. Inoltre, l'efficacia contro i funghi può essere misurata in fasi chiave di sviluppo in un'unica configurazione sperimentale.

Il protocollo descritto si basa su una tecnica di trasferimento della spina che consente una determinazione accurata delle quantità di microrganismi e delle loro fasi di sviluppo. Un numero specificato di spore viene distribuito su una piastra di agar. Questa piastra di agar viene incubata per un periodo definito per consentire ai funghi di raggiungere lo stadio di sviluppo previsto, ad eccezione delle spore in cui non è richiesta l'incubazione. Le spine di agar coperte da spore, ife o micelio vengono successivamente ritirate e trasferite su supporti di agar contenenti il composto antimicotico da testare sia posizionate a distanza dai funghi che a contatto. Questo metodo è applicabile per testare sia estratti liquidi che campioni solidi (polveri). È particolarmente adatto per quantificare i contributi relativi degli agenti volatili e non volatili nelle miscele bioattive e per determinarne gli effetti, in particolare sulle spore, sull'iphae precoce e sul micelio.

Il metodo è molto rilevante per la caratterizzazione dell'attività antimicotica dei prodotti di biocontrollo, in particolare dei prodotti di origine vegetale. Infatti, per il trattamento dell'impianto, i risultati possono essere utilizzati per guidare la scelta delle modalità di applicazione e stabilire le soglie di innesco.

Le perdite globali di frutta e verdura possono raggiungere fino al 50% della^{produzione 1} e derivare principalmente dal decadimento alimentare causato dal deterioramento dei funghi sul campo o durante lo stoccaggio post-raccolta^2,3,nonostante l'ampia occupazione di fungicidi sintetici dalla metà del XX secolo⁴. L'uso di queste sostanze viene riconsiderato in quanto rappresenta gravi rischi per l'ambiente e la salute. Poiché le conseguenze dannose del loro uso si stanno mostrando in tutti gli ecosistemi e le prove di potenziali impatti sulla salute si^{sono accumulate 5,6}, si stanno sviluppando nuove alternative alle vecchie strategie profilattiche per i trattamenti pre e post-raccolta^7,8,9. Quindi la sfida che dobbiamo affrontare è duplice. Le nuove strategie fungicide devono, in primo luogo, mantenere i livelli di efficacia della protezione alimentare contro i fitopatogeni e, in secondo luogo, contribuire in secondo luogo a ridurre drasticamente l'impronta ambientale delle pratiche agricole. Per raggiungere questo ambizioso obiettivo, vengono proposte strategie ispirate alle difese naturali evolute nelle piante poiché sono state evidenziate più di 1000 specie di piante per le loro proprietà antimicrobiche⁸. Ad esempio, le piante che hanno sviluppato fungicidi naturali per combattere i fitopatogeni sono una nuova risorsa per esplorare lo sviluppo di nuovi prodotti di biocontrollo². Gli oli essenziali sono molecole di punta di questo tipo. Ad esempio, l'olio essenziale di Origanum protegge le piante di pomodoro dalla muffa grigia nelle serre ¹⁰ e gli oli essenziali Solidago canadensis L. e cassia hanno dimostrato di preservare le fragole post-raccolte dai danni della muffa^{grigia 11,12}. Questi esempi dimostrano che il biocontrollo e in particolare i prodotti di origine vegetale rappresentano una soluzione che combina efficacia biologica e sostenibilità ambientale.

Pertanto, le piante sono un'importante risorsa di molecole di potenziale interesse per l'industria della protezione delle colture. Tuttavia, solo una manciata di prodotti vegetali è stata proposta per essere utilizzata come prodotti di biocontrollo, anche se sono generalmente riconosciuti come sicuri, non fitotossici ed^{eco-compatibili 2}. Sono state osservate alcune difficoltà nella trasposizione dal laboratorio al campo, come l'efficacia che diminuisce una volta applicata in vivo^2,9. Pertanto, diventa importante migliorare la capacità dei test di laboratorio di prevedere meglio l'efficacia sul campo. In questo contesto, i metodi di prova antimicotici per i prodotti di origine vegetale sono necessari sia per valutarne l'efficacia antimicotico sia per definire le loro condizioni ottimali per l'uso. In particolare, i prodotti di biocontrollo sono generalmente meno efficienti dei fungicidi chimici, quindi una migliore comprensione del loro modo di agire è importante per proporre formulazioni adeguate, identificare le modalità di applicazione nei campi e definire quale stadio di sviluppo dell'agente patogeno è vulnerabile al bioproduttore candidato.

Gli attuali approcci che affrontano le attività antibatteriche e antifungine includono metodi di diffusione come la diffusione del disco di agar, la diluizione, la bioautografia e la citometria del flusso¹³. La maggior parte di queste tecniche, e più specificamente, i test standard di suscettibilità antifungina - test di diffusione e diluizione agar-disk - sono ben adattati per valutare l'attività antimicrobica dei composti solubili sulle spore batteriche e fungine nelle sospensioni liquide¹⁴. Tuttavia, questi metodi non sono generalmente adatti per testare composti solidi come la polvere vegetale essiccata o per quantificare l'attività antifungina durante la crescita del micelio in quanto richiedono la diluizione delle spore o la diffusione di spore su piastre di agar e / o diluizione di composti antifungini¹³. Nel metodo avvelenato dal cibo, le piastre di agar contenenti l'agente antimicotico vengono inoculate con un disco di 5-7 mm di diametro campionato da una coltura di funghi vecchia di 7 giorni senza considerare la quantità precisa di micelio iniziale. Dopo l'incubazione, l'attività antimicotica è determinata come percentuale di inibizione della crescita radiale^17,18,19. Con questo approccio possiamo valutare l'attività antimicotica sulla crescita miceliale. Al contrario, il metodo di diluizione dell'agar viene eseguito per determinare l'attività antimicotica sulle spore direttamente inoculate sulla superficie della piastra di agar contenente i composti antifungini^13,20,21. Questi due approcci danno risultati complementari sull'attività antimicotica. Tuttavia queste sono due tecniche indipendenti utilizzate in parallelo che non forniscono un confronto accurato fianco a fianco dell'efficacia relativa dei composti antifungini su spore e micelio^17,20,22 poiché la quantità di materiale fungino iniziale differisce nei due approcci. Inoltre, l'attività antimicotica di un prodotto di origine vegetale è spesso il risultato della combinazione di molecole antifungine sintetizzati dalle piante per affrontare agenti patogeni. Queste molecole comprendono proteine, peptidi^23,24, e metaboliti con un'ampia diversità chimica e appartenenti a diverse classi di molecole come polifenoli, terpeni, alcaloidi²⁵, glucosinolati⁸, e composti organosolfuri²⁶. Alcune di queste molecole sono volatili o diventano volatili durante l'attacco patogeno²⁷. Questi agenti sono spesso scarsamente solubili in acqua e composti ad alta pressione di vapore che devono essere recuperati attraverso la distillazione dell'acqua come oli essenziali, alcune delle cui attività antimicrobiche sono state ben consolidate²⁸. Sono stati sviluppati saggi di suscettibilità mediati in fase di vapore per misurare l'attività antimicrobica dei composti volatili dopo l'evaporazione e la migrazione attraverso la fase di vapore²⁹. Questi metodi si basano sull'introduzione di composti antifungini a distanza dalla coltura microbica^{29,30,31,32,33}. Nel saggio di agar in fase di vapore comunemente usato, gli oli essenziali vengono depositati su un disco di carta e posizionati al centro della copertura della piastra di Petri a distanza dalla sospensione batterica o fungina della spora, che viene diffusa su un mezzo agar. Il diametro della zona di inibizione della crescita viene quindi misurato allo stesso modo del metodo di diffusione agar-disco^20,24. Altri approcci sono stati sviluppati per fornire una misurazione quantitativa della suscettibilità antifungina in fase di vapore degli oli essenziali, derivata dal metodo di diluizione del brodo da cui è stata calcolata un'attività antimicrobica mediata in fase di vapore inibitoria³², o derivati da saggi di diffusione agar-disk³¹. Questi metodi sono generalmente specifici per gli studi di attività in fase di vapore e non appropriati ai saggi di inibizione del contatto. Ciò impedisce la determinazione del contributo relativo degli agenti volatili e non volatili all'attività antimicotica di una miscela bioattiva complessa.

Il metodo quantitativo che abbiamo sviluppato mira a misurare l'effetto antimicotico della polvere vegetale essiccata su quantità controllate di spore e micelio coltivato depositato sulla superficie di un mezzo agar per riprodurre la crescita aerea dei fitopatogeni durante l'infezione^{delle piante 15 e} una rete miceliale interconnessa¹⁶. L'approccio è una configurazione sperimentale modificata basata sui metodi di diluizione dell'agar e avvelenati dagli alimenti che consente anche, nella stessa configurazione sperimentale, la quantificazione affiancata del contributo di metaboliti antifungini volatili e non volatili. In questo studio, il metodo è stato confrontato con l'attività di tre preparati antifungini ben caratterizzati.

1. Preparazione dell'inocula

1. Prima dell'esperimento, posare 5 μL di Trichoderma spp. Le spore SBT10-2018 conservate a 4 °C su mezzo agar destrosio di patate (PDA) e incubano per 4 giorni a 30°C con esposizione regolare alla luce per favorire la formazione di conidia⁴² (Figura 1,pannello A).
   NOTA: Trichoderma spp. SBT10-2018 è stato isolato dal legno ed è utilizzato come modello in questo studio per la sua rapida crescita e facilità di recupero delle spore. Questo ceppo è conservato dal nostro laboratorio.
2. Recupera conidia(Figura 1, pannello A)
   1. Posare 3 mL dello 0,05% di Tween-20 sul micelio trichoderma.
   2. Utilizzare un rastrello per rilasciare conidia dai conidiofori; evitare di premere sul micelio per evitare che le ife vengano strappate via.
   3. Recuperare rapidamente la soluzione con una micropipetta per evitare che venga assorbita dal mezzo agar e trasferirla in un tubo da 15 ml.
   4. Contare il numero totale di spore utilizzando un emocitometro e preparare una soluzione contenente 3 x 10⁶ spore/mL.
      NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito con attenzione per evitare l'estrazione delle ife. La preparazione delle spore viene quindi controllata al microscopio. Alla fine, per i ceppi che presentano micelio altamente aereo e soffice, è possibile aggiungere un passo di filtrazione utilizzando un filtro filtrante da 40 μM per eliminare il frammento di micelio residuo.

2. Preparazione delle piastre fungine(Figura 1,pannello B)

1. Depositare 100 μL di 3 x 10^{6 spore/mL} con una micropipetta su una piastra di Petri di 9 cm di diametro contenente mezzo PDA per ottenere 4.800 spore/cm² corrispondenti a 925 spore/spina di agar di diametro 5 mm.
2. Aggiungere 10 g di perline di vetro di 2 mm di diametro con una spatola sterile ed eseguire movimenti avanti e indietro paralleli e perpendicolari al braccio dell'operatore per distribuire uniformemente le spore sulla superficie dell'agar.
3. Ruotare la piastra di 90° e ripetere i movimenti rotanti (come nella sezione 2.2); ripetere questi passaggi fino a quando la piastra non è stata ruotata completamente.
4. Utilizzare immediatamente la piastra per impostare esperimenti che richiedono spore o incubare le piastre a 30 °C per 17 ore o 24 ore quando sono necessarie rispettivamente le prime ife o micelio.
   NOTA: Per confrontare l'attività antimicotica misurata dopo il trasferimento della spina del micelio e il trasferimento del disco di micelio, utilizzare pinzette sterili e posizionare dischi sterili di cellulosa da 5 mm casualmente sulla superficie della piastra di agar dopo la diffusione della spora.

3. Preparazione di composti antifungini

1. Preparazione del prodotto di origine vegetale: preparazione aglio-polvere
   1. Sbucciare gli spicchi d'aglio fresco e tagliare gli spicchi a fette larghe 2-3 mm usando una lama bisturi.
   2. Asciugare all'aria le fette per 2 giorni a 40 °C.
   3. Macinare le fette per 3 x 15 secondi utilizzando un mulino a coltello per ottenere una polvere fine.
   4. Conservare l'aglio in polvere a 4 °C in tubi da 50 ml prima dell'uso.
      NOTA: Poiché l'aglio non è autoclavato (per prevenire la degradazione di composti antifungini sensibili alla temperatura) pulire il macinino, il bisturi e l'essiccatore d'aria con etanolo al 70% prima dell'uso.
2. Preparazione essenziale dell'olio
   1. Prepara soluzioni di olio essenziale 0,5%, 1%, 2,5%, 5% e 20% Thymus vulgaris in 0,5% Tween-80.
   2. Mescolare bene per formare un'emulsione prima di aggiungerla nel mezzo PDA (vedere la sezione 4.2).
3. Preparazione carbendazim
   1. Pesare carbendazim per preparare una soluzione di etanolo da 200 mg/L (il carbendazim è scarsamente solubile in acqua).
   2. Conservare la soluzione a temperatura ambiente prima di aggiungerla nel mezzo PDA (vedere la sezione 4.2).
      ATTENZIONE: Carbendazim presenta un pericolo per la salute e l'ambiente. Indossare guanti e maschere durante la manipolazione di questo prodotto. Conservalo in uno spazio ventilato.

4. Saggio di inibizione del contatto

1. Preparazione di piatti di agar contenenti aglio in polvere
   1. Preparare e autoclave PDA medium.
   2. Pesare la quantità di aglio in polvere desiderata in un tubo da 50 ml utilizzando una spatola sterile, per ottenere concentrazioni generalmente che vanno da 0,25 mg/ml a 16 mg/ml.
   3. Aggiungere 10 mL di PDA dopo aver controllato la temperatura del mezzo all'interno del polso. La temperatura deve essere il più bassa possibile per prevenire la degradazione di molecole sensibili. Idealmente, questa temperatura dovrebbe essere di 45 °C.
   4. Omogeneizzare con attenzione capovolgendo il tubo per distribuire uniformemente la polvere nel mezzo PDA. Versare rapidamente 10 mL in una piastra di Petri di 5 cm di diametro(Figura 1,pannello C).
   5. Con la piastra di Petri posta a temperatura ambiente, attendere che l'agar si solidifichi.
2. Preparazione di piastre di agar contenenti olio essenziale o carbendazim
   1. Introdurre 10 ml di PDA in un tubo da 50 ml. Controllare la temperatura come per il punto 4.1.3.
   2. Aggiungere 100 μL delle diverse soluzioni di Thymus vulgaris olio essenziale in PDA per ottenere soluzioni 0,005%, 0,01%, 0,025%, 0,05% e 0,2% (vedi sezione 3.2.1).
   3. Aggiungere il volume richiesto di carbendazim dalla soluzione da 200 mg/L per ottenere soluzioni che vanno da 0,0625-2 mg/L (vedere la sezione 3.3.1).
   4. Omogeneizzare con cura capovolgendo il tubo, versare rapidamente 10 ml in una piastra di Petri di 5 cm di diametro(Figura 1,pannello C).
   5. Con la piastra di Petri posta a temperatura ambiente, attendere che l'agar si solidifichi.
3. Saggio di inibizione del contatto (Figura 1)
   1. Con un tubo sterile in acciaio inossidabile di 5 mm di diametro, tracciare un cerchio al centro delle piastre di Petri contenenti PDA o PDA, compresi i composti antifungini. Smaltire il cilindro dell'agar utilizzando uno stuzzicadenti sterile (pannello C).
   2. Con un tubo sterile in acciaio inossidabile di 5 mm di diametro, tracciare i cerchi casualmente nelle piastre fungine della sezione 2. Tracciare tra 15-20 cerchi per piastra (pannello B).
   3. Ritirare con cura i cilindri di agar coperti da spore, iphae precoci o micelio con uno stuzzicadenti sterile e posizionare le spine nello spazio vuoto delle piastre di Petri contenenti PDA o PDA compresi i composti antifungini (pannello C).
   4. Incubare le piastre contenenti spore per 48 ore a 30 °C, 31 ore per le piastre contenenti iphae precoce e, 24 ore per le piastre ricoperte di micelio (pannello C).
   5. Misurare il diametro della crescita radiale e calcolare la percentuale di inibizione della crescita fungina rispetto al controllo utilizzando la formula (pannello D)
      % inibizione della crescita fungina = (C - A/C)* 100
      dove C è il diametro della crescita radiale nel mezzo PDA e A il diametro della crescita radiale nel mezzo PDA contenente i composti antifungini.
      NOTA: Per confrontare l'attività antimicotica misurata dopo il trasferimento della spina del micelio e il trasferimento del disco di micelio, utilizzando pinzette sterili, trasferire un disco di 5 mm di diametro precedentemente depositato sulla superficie delle piastre fungine (sezione 2 nota) al centro delle piastre di Petri contenenti PDA o PDA contenenti composti antifungini e procedere esattamente come per il trasferimento dell'agar-plug

5. Saggio di inibizione della fase di vapore

1. Preparazione di piatti di agar contenenti aglio in polvere
   1. Procedere come nella sezione 3.1.
2. Preparazione di una piastra di agar contenente olio essenziale o carbendazim
   1. Procedere come nelle sezioni 3.2 e 3.3.
3. Preparazione di piatti fungini
   1. Procedere come nella sezione 2.
4. Saggio di inibizione antifungina in fase di vapore(Figura 1)
   1. Versare 10 mL di mezzo PDA nel coperchio delle piastre di Petri di 5 cm di diametro contenenti 10 mL di mezzo PDA o 10 mL di mezzo PDA contenente composti antifungini nella parte inferiore dei piatti. Attendere fino alla completa solidificazione dell'agar a temperatura ambiente (pannello C).
   2. Utilizzare un tubo centrifugo da 50 mL come strumento di calibrazione per ottenere un cerchio di PDA al centro del coperchio; rimuovere il PDA intorno al cerchio con una spatola sterile (pannello C).
   3. Tracciare un cerchio al centro del mezzo PDA posto nel coperchio con un tubo sterile in acciaio inossidabile di 5 mm di diametro. Scartare il cilindro di agar con uno stuzzicadenti sterile (pannello C).
   4. Formare tappi con un tubo sterile in acciaio inossidabile di 5 mm di diametro casualmente nelle piastre fungine come nella sezione 4.3.2 (pannello B).
   5. Utilizzando uno stuzzicadenti sterile, trasferire accuratamente le spine coperte da spore, iphae precoci o micelio da piastre fungine nei coperchi delle piastre di dosaggio (pannello C).
   6. Incubare a 30 °C come nella sezione 4.3.4 (pannello C).
   7. Misurare il diametro della crescita radiale e calcolare la percentuale di inibizione della crescita fungina utilizzando la formula nella sezione 4.3.5 (pannello D).

Per valutare la capacità del metodo quantitativo di discriminare le modalità di azione di diversi tipi di composti antifungini, abbiamo confrontato l'efficacia di tre noti agenti antifungini. Carbendazim è un fungicida sintetico non volatile che è stato ampiamente utilizzato per controllare una vasta gamma di malattie fungine nelle^{piante 39,40}. L'olio essenziale di thymus vulgaris è stato in gran parte descritto per la sua attività antibatterica e antimicotica ed è usato come agente conservante alimentare^{naturale 41}. L'aglio in polvere è stato scelto come modello di un bioproduttivo di origine vegetale. È stato tradizionalmente utilizzato come rimedio naturale con attività antimicrobiche che sono state in gran parte attribuite alla presenza di composti organosolfuri volatili ma anche alla presenza di saponine non volatili e composti fenolici^26,dando a questo modello una complessità rilevante in questo studio.

Questo metodo quantitativo si basa sul trasferimento di tappi di agar contenenti quantità controllate di funghi in diversi stadi di sviluppo dalle spore al micelio, mentre nel metodo avvelenato dal cibo, il micelio di 5-giorni a quello di 7 giorni viene trasferito dai dischi di cellulosa¹³. Nel saggio, spore, iphae precoce (incubazione di 17 ore) e micelio (incubazione di 24 ore) sono stati usati come materiale fungino di partenza. L'uso del trasferimento su disco potrebbe non essere rilevante in quanto la conidia o l'ife residua rimangono almeno parzialmente sul supporto agar dopo il trasferimento del disco, portando successivamente a misurazioni imprecise dell'inibizione della crescita come illustrato nella figura 2. Diversi diametri di crescita fungino-radiale sono stati osservati dopo il trasferimento di aree di agar situate sotto dischi di cellulosa seguita da incubazione di 24 ore(Figura 2,pannelli A, B e C) evidenziando la presenza di iphae fungine residue sull'agar dopo il trasferimento del disco. La quantificazione delle ife residue è stata confermata dalla misurazione della crescita che ha portato fino al 22% di variabilità del diametro(figura 2, pannello D). L'effetto sull'inibizione della crescita è stato successivamente valutato utilizzando l'olio essenziale di Thymus vulgaris come composto antimicotico e rispetto all'inibizione ottenuta dopo il trasferimento dell'agar-plug(Figura 2, pannello E). L'inibizione della crescita dopo il trasferimento del disco è stata superiore a quella dopo il trasferimento dell'agar-plug per basse concentrazioni di olio di Timo, portando a una sopravvalutazione dell'effetto inibitorio, che potrebbe essere dovuto al trasferimento incompleto di materiale fungino e supportare l'approccio basato sul trasferimento dell'agar-plug.

Trichoderma spp. L'inibizione della crescita SBT10-2018 innescata dai tre composti antifungini è stata successivamente valutata utilizzando i test di inibizione della fase di contatto e vapore per ogni stadio fungino (Figura 3). Le spore erano accuratamente distribuite su piastre di agar per ottenere 4.800 spore / cm². Sono stati trasferiti direttamente su piastre di agar contenenti composti antifungini attraverso l'estrazione agar-plug utilizzando un tubo sterile in acciaio inossidabile da 5 mm, consentendo all'esperimento di partire dalle spore. Per gli altri due stadi di sviluppo, le piastre di agar ricoperte di spore sono state incubate in primo luogo per 17 h o 24 ore a 30°C prima di trasferire la spina di agar per consentire la germinazione e lo sviluppo precoce dell'ife (17 h) e della formazione di micelio (24 ore)(figura 3, pannello A). Per quantificare il contributo delle molecole volatili attive all'attività antimicotica complessiva, il saggio di inibizione del contatto è stato adattato e le spore, l'iphae precoce e il micelio sono stati posti a distanza dai composti antifungini versati nel mezzo DOP per quanto riguarda il saggio di inibizione del contatto. La crescita radiale del trichodermaè stata misurata nell'oltre 48 ore e la percentuale di inibizione è stata determinata rispetto alle condizioni di controllo. La concentrazione minima inibitoria (MIC) è stata definita come la concentrazione più bassa di composti antifungini che impediscono la crescita visibile dopo 48 ore di incubazione a 30°C.

La figura 3(pannello B) mostra una maggiore sensibilità alle spore al carbendazim rispetto alle prime reti di ifae e micelio con inibizione della crescita del 50%, 22% e 30% rispettivamente a 0,25 μg/mL carbendazim quando trichoderma e composti antifungini erano in contatto. Concomitante, un valore MIC di 0,5 μg/mL è stato stimato sulla germinazione delle spore, mentre è stato ottenuto un aumento a 0,75 μg/mL all'allungamento precoce delle ife e al micelio. Al contrario, il carbendazim non ha avuto alcun effetto antimicotico sul Trichoderma quando il fungo è stato posizionato a distanza dal fungicida in conformità con la bassa volatilità di questa sostanza. I risultati che abbiamo ottenuto utilizzando l'olio essenziale di Thymus vulgaris (TEO) come composto antimicotico(Figura 3, pannello C) hanno mostrato una maggiore sensibilità alle spore al TEO rispetto alle prime ife e micelio con il 65% e circa il 50% di inibizione della crescita rispettivamente allo 0,01% di TEO. I valori MIC ottenuti erano simili per la germinazione delle spore e l'allungamento precoce delle ife (0,025% TEO) e superiori per la crescita del micelio (0,05% TEO). Come previsto, l'olio essenziale di Thymus vulgaris presentava un'identica attività antimicotica indipendentemente dalla distanza tra il fungo e l'olio. Valori MIC simili (0,025% TEO) sono stati ottenuti sulla germinazione delle spore e sull'allungamento precoce delle iphae per i test a contatto e in fase di vapore, anche se alla percentuale inferiore è stata osservata una maggiore sensibilità quando le spore di TEO e Trichoderma erano in contatto (60% di inibizione della crescita a contatto contro il 45% di inibizione della crescita a distanza). Sorprendentemente, i valori MIC ottenuti sul micelio erano diversi nei test di inibizione della fase di contatto e vapore (0,05% contro 0,1%) suggerendo che una parte delle molecole volatili non è attiva contro un micelio ben sviluppato. Infine, quando si utilizza l'aglio in polvere come composto antimicotico(Figura 3, pannello D), è stata osservata una maggiore efficacia contro la germinazione delle spore (inibizione della crescita del 50% a 0,25 mg/mL di aglio in polvere e valore MIC di 0,5 mg/mL) e l'allungamento precoce delle ife (0,25 mg/mL di aglio in polvere e valore MIC di 0,5 mg/mL) e l'allungamento precoce delle ife (0,25 mg/mL di aglio in polvere e valore MIC di 0,5 mg/mL) e all'allungamento precoce delle ife (0,25 mg/mL di aglio in polvere e valore MIC di 0,5 mg/mL) e all'allungamento precoce delle ife (0,25 mg/mL di aglio in polvere e inibizione della crescita del 59% a 0,25 mg/mL e valore MIC di 0,5 mg/mL) rispetto alla crescita del micelio (inibizione della crescita del 29% a 0,5 mg/mL di aglio in polvere e valore MIC di 0,75 mg/mL). Quando sono stati confrontati i test di contatto e di fase di vapore, i risultati hanno mostrato una significativa diminuzione dell'attività antifungina a distanza indipendentemente dalla fase di sviluppo del fungo. I valori MIC sono passati da 0,5 mg/mL a 1 mg/mL per la germinazione delle spore, da 0,5 mg/mL a 2 mg/mL per l'allungamento precoce delle ife e da 0,75 mg/mL a 4 mg/mL per la crescita del micelio(figura 3, pannello D e figura 4 per immagini rappresentative). Quindi, questi risultati suggeriscono che l'aglio in polvere contiene una miscela di composti volatili e non volatili con proprietà antifungine.

Complessivamente, questi risultati mostrano che il contributo relativo degli agenti volatili e non volatili contenuti nei prodotti di origine vegetale può essere determinato in diverse fasi di crescita fungina in quanto le condizioni sperimentali sono comparabili. Questo approccio è quindi particolarmente adatto per miscele complesse di composti antifungini. L'olio essenziale di Thymus vulgaris è una miscela di composti volatili e mostra un'attività simile a distanza e a contatto per la germinazione delle spore e l'allungamento precoce delle ife, supportando il confronto di questo saggio di fase di vapore e inibizione del contatto e evidenziando che la migrazione nella fase di vapore non è compromessa versando nel mezzo agar. I risultati sottolineano anche che l'aglio in polvere utilizzato come modello in questo studio contiene componenti attivi non volatili che hanno un contributo significativo nell'attività antimicotica complessiva e che sono stati trascurati a favore di tiosolfinati volatili derivati dall'allio^27,28.

Figura 1: Schema sinottico del protocollo per i saggi a contatto e in fase di vapore Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.

Figura 2: Imprecisione associata al trasferimento fungino daldisco di cellulosa. A. Schema che rappresenta il trasferimento del disco su piastre di agar coperte da spore e il trasferimento del disco sulla superficie su piastre di agar contenenti composti antifungini B. Schema che rappresenta il trasferimento di agar di aree sotto dischi di cellulosa seguito da incubazione e misurazione della crescita residua. C. La commissione per l' Quadro rappresentativo della crescita radiale del micelio residuo dopo il trasferimento di aree sotto dischi di cellulosa. D. La commissione per l' Misurazione radiale della crescita del micelio residuo. E. La commissione per l' Effetto di Thymus vulgaris olio essenziale sulla crescita del micelio trasferito dal disco di cellulosa o dalla spina di agar (N=2, media ± SD) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Confronto delle attività antifungine mediante i saggi di inibizione della fase di vapore e del contatto su spore, ifae precoci e micelio. A. La commissione per l'a Immagini rappresentative delle spore di Trichoderma, delle prime ife (crescita di 17 ore) e del micelio (crescita di 24 ore). Inibizione della crescita del trichoderma da parte del carbendazim (B), thymus vulgaris olio essenziale (C) e aglio in polvere (D). (N=2, media ± SD) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Immagini rappresentative dell'attività antimicotica all'aglio su piastre di agar neisaggi di inibizione a contatto ( A) o fase di vapore (B) Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questacifra. 

L'approccio qui presentato consente la valutazione delle proprietà antifungine dei prodotti di origine vegetale minimamente lavorati. In questo protocollo, la distribuzione omogenea delle spore sulla superficie dell'agar si ottiene utilizzando perline di vetro da 2 mm. Questo passaggio richiede capacità di movimentazione per distribuire correttamente le perline e ottenere risultati riproducibili, consentendo in ultima analisi il confronto di effetti antifungini in diverse fasi della crescita fungina. Abbiamo scoperto che perline di vetro da 5 mm o rotazione eccessiva durante l'omogeneizzazione durante la diffusione può causare un diametro di crescita variabile. Pertanto, si consiglia di addestramento per padroneggiare la distribuzione delle spore prima della sperimentazione. Inoltre, quando le polveri vegetali devono essere testate, si deve prestare attenzione alla dispersione omogenea del prodotto nel mezzo di agar. Per evitare che la polvere si stabilizza nella parte inferiore della piastra, il prodotto deve essere miscelato in mezzo agar quando la temperatura del mezzo fuso raggiunge i 45 °C (quando la temperatura ambiente è di 24 °C). Questa temperatura deve essere regolata in base alla temperatura ambiente locale per evitare la sedimentazione.

Mentre il metodo che descriviamo qui può fornire informazioni preziose, è necessario considerare alcuni svantaggi. Questo metodo consente confronti accurati e fianco a fianco in un'unica configurazione sperimentale a scapito di una quantità significativa di tempo di preparazione in quanto il numero di piastre di agar da preparare può essere considerevole a seconda delle domande a cui è necessario rispondere. Inoltre, questo test è un saggio su scala media progettato per 5 cm di piastre petri. Pertanto, la quantità di sostanze attive necessarie per testare tutti gli aspetti può essere sostanziale. Ciò significa che le sostanze rare potrebbero non essere idonee a richiedere test per questo protocollo. Una scale-down del saggio può essere considerata utilizzando piastre di Petri più piccole e riducendo le dimensioni delle spine. Ciò potrebbe essere testato utilizzando il protocollo di benchmarking qui descritto con particolare attenzione all'estrazione dell'agar-plug, che potrebbe essere difficile. L'accuratezza delle misurazioni della crescita radiale potrebbe essere ridotta su scala più piccola.

I metodi attuali sono appropriati per misurare l'attività antimicotica dei composti in soluzione e meno applicabili allo studio delle polveri¹³. L'approccio che abbiamo stabilito è ben adattato sia per i composti liquidi che per i composti solidi, che consente la valutazione delle proprietà antifungine dei prodotti di origine vegetale minimamente lavorati. Ciò riduce il tempo necessario per testare gli estratti e riduce le insidie legate ai principi attivi che mostrano scarsa solubilità. Poiché alcuni prodotti di origine vegetale contengono molecole attive sensibili alle alte temperature⁴³, ciò offre il vantaggio di limitare il rischio di perdita di attività di tali composti. Questo approccio è stato adattato dal metodo di diffusione dell'agar e dal metodo avvelenato dagli alimenti^{15,16,17,18,19} per consentire inoltre il confronto diretto delle attività antifungine su diverse fasi di crescita fungina utilizzando contesti sperimentali simili. Il trasferimento agar-plug consente un controllo accurato delle quantità di microrganismi all'interno del saggio. Questo è un vantaggio rispetto al trasferimento su disco, che porta a una sopravvalutazione degli effetti antifungini associati al trasferimento incompleto di spore o ife. Infine, mentre i saggi in fase di vapore non vengono generalmente applicati ai saggi di inibizione del^{contatto 27,28,29,30,31}, il metodo che proponiamo affronta i contributi relativi di agenti volatili e non volatili contenuti in miscele complesse come polveri vegetali o estratti e, in ultima analisi, consente la valutazione di attività antifungine in diverse fasi di crescita fungina.

L'approccio che descriviamo qui potrebbe essere particolarmente rilevante per sostenere la necessità di metodi che valutino le proprietà antifungine nei prodotti di origine vegetale per il biocontrollo. Il metodo quantitativo che proponiamo consente agli operatori di determinare i rispettivi contributi di composti volatili e non volatili all'attività antimicotica di una miscela bioattiva complessa. Ciò fornisce preziose informazioni che possono guidare la scelta delle modalità di applicazione per il trattamento e la pertinenza dell'esecuzione dell'estrazione di liquidi. Applicazioni che potrebbero essere considerate a distanza dal fitopatogeno mirato (ad esempio, inclusione del prodotto di biocontrollo in un imballaggio) o potrebbero aver bisogno di un contatto diretto per ottimizzare l'efficacia del prodotto di biocontrollo (nebulizzazione sulle piante o immersione di frutta in una soluzione di prodotto di biocontrollo). Consente inoltre il confronto dell'efficacia antimicotico in diverse fasi di crescita fungina dalla germinazione delle spore alla crescita del micelio in fase successiva, il che porta alla definizione di raccomandazioni per stabilire soglie di controllo necessarie per applicare i prodotti di biocontrollo alle colture. Infatti, definire l'efficacia delle sostanze in diverse fasi fungine può aiutare a classificare se le sostanze possono essere utilizzate come trattamenti preventivi o curativi e a pianificare il programma per i trattamenti vegetali con prodotti di biocontrollo. Questo è essenziale per sfruttare l'efficacia dei prodotti quando vengono utilizzati sul campo o dopo la raccolta.

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Siamo molto grati a Frank Yates per il suo prezioso consiglio. Questo lavoro è stato sostenuto da Sup'Biotech.