测量生物控制产品的挥发性和非挥发性抗真菌活性

我们描述了一种基于阿加的改进方法，旨在量化植物衍生产品的抗真果效应。可通过本议定书评估对抗真果活动的挥发性和非挥发性贡献。此外，在一项实验设置中，可在关键发育阶段测量对真菌的疗效。

所述协议基于插头传输技术，可准确确定微生物数量及其发育阶段。特定数量的孢子分布在阿加板上。这种阿加板的孵育期为一定时期，使真菌达到预期的发展阶段，但不需要孵化的孢子除外。下一步，由孢子、催眠或菌斑覆盖的 Agar 插头将被提取并转移到含有抗真菌化合物的 agar 介质中，以测试放置在离真菌或接触的距离。此方法适用于测试液体提取物和固体样品（粉末）。它特别适合量化挥发性和非挥发性制剂在生物活性混合物中的相对贡献，并确定其影响，特别是对孢子、早期催眠和菌精的影响。

该方法与生物控制产品，特别是植物衍生产品抗真菌活性的定性具有高度相关性。事实上，对于植物处理，结果可用于指导应用模式的选择和建立触发阈值。

全球水果和蔬菜损失可能^{高达产量的}50%，主要由于田间或收获后储存^2，3的真菌变质造成的食物腐烂，尽管自²⁰世纪4世纪中叶以来大量使用合成杀菌剂。正在重新考虑使用这些物质，因为它对环境和健康构成严重危害。由于这些药物的有害后果正在整个生态系统中显现出来，而且潜在的健康影响的证据已经累积了^5，6，新的替代旧的预防策略正在开发用于收获前和收获后治疗^7，8，9。因此，我们面临的挑战是双重的。新的杀菌策略首先必须保持食品保护对植物病原体的功效水平，其次，有助于大幅减少农业做法的环境足迹。为了实现这一雄心勃勃的目标，在植物进化的自然防御的启发下，提出了战略，因为超过1000种植物因其抗^菌特性而得到强调。例如，开发天然杀菌剂对抗植物病原体的植物是探索开发新的生物控制产品^{的新资源。}精油是这类的旗舰分子。例如，Origanum精油保护番茄植物免受¹⁰号温室的灰霉菌的侵害，而Solideago甘蔗剂L.和卡西亚精油已被证明可以保护收获后的草莓免受灰霉菌的损害11，12。这些例子说明，生物控制，特别是植物衍生产品，是一种结合了生物功效和环境可持续性的解决方案。

因此，植物是作物保护行业潜在利益分子的重要资源。然而，只有少数植物产品被建议用作生物控制产品，即使它们被普遍认为是安全的，非植物毒性和环保^的2。观察到从实验室到现场的转换存在一些困难，例如在体内^2、9中应用后疗效降低。因此，提高实验室测试的能力以更好地预测现场效果变得非常重要。在这方面，植物衍生产品的抗真果测试方法对于评估其抗真果效果和确定其最佳使用条件都是必要的。具体来说，生物控制产品通常不如化学杀菌剂有效，因此更好地了解其作用模式对于提出适当的配方、确定在田间的应用模式以及确定病原体的哪个发育阶段容易受到候选生物制品的影响非常重要。

目前处理抗菌和抗真菌活动的方法包括扩散方法，如阿加盘扩散、稀释、生物电图和流动细胞测量¹³.这些技术中，更具体地说，标准的抗真菌易感性测试（agar-磁盘扩散和稀释检测）非常适合评估液体悬浮剂中细菌和真菌孢子上可溶性化合物的抗菌活性¹⁴.然而，这些方法通常不适合测试固体化合物，如干植物粉末或量化在霉菌生长期间的抗真菌活性，因为它们需要孢子稀释或孢子在阿加板上传播和/或稀释抗真菌化合物¹³.在食物中毒方法中，含有抗真菌剂的阿加板接种了直径为5-7毫米的磁盘，从7天老真菌培养物中采样，而不考虑启动菌的精确数量。孵化后，抗真菌活性被确定为径向生长抑制的百分比^17,18,19.通过这种方法，我们可以评估我天体生长的反真菌活动。相比之下，进行阿加稀释法可以确定直接接种含有抗真菌化合物的阿加板表面孢子上的抗真菌活性^13,20,21.这两种方法在抗真果活动方面具有互补性。然而，这是两种并行使用的独立技术，不能提供准确并排比较孢子和菌体上抗真菌化合物的相对功效^17,20,22 由于启动真菌材料的数量在两种方法中有所不同。此外，植物衍生产品的抗真菌活性往往来自植物合成的抗真菌分子与面对病原体的组合。这些分子包括蛋白质、肽^23,24代谢物具有广泛的化学多样性，属于不同类别的分子，如多酚、三苯、藻类²⁵，葡萄糖素⁸，和有机硫化合物²⁶.其中一些分子在病原体攻击期间挥发性或变挥发性²⁷.这些制剂通常是水溶性差和高蒸汽压力化合物，必须通过水蒸馏作为精油回收，其中一些抗菌活动已经建立²⁸.已开发出蒸汽相介导易感性检测，以测量蒸发和通过蒸汽相迁移后挥发性化合物的抗菌活性²⁹.这些方法基于在距离微生物培养物较远的地方引入抗真菌化合物^{29,30,31,32,33}.在常用的蒸汽相阿加检测中，精油沉积在纸盘上，并放置在培养皿盖的中心，距离细菌或真菌孢子悬架（在 agar 介质上传播）很远。然后以与 agar-磁盘扩散方法相同的方式测量生长抑制区的直径^20,24.还开发了其他方法，以提供对精油的蒸汽相抗真菌性的定量测量，这种测量方法来自计算抑制性蒸汽相介导抗菌活性的肉汤稀释方法³²，或从阿加磁盘扩散检测中提取³¹.这些方法通常特定于蒸汽相活动研究，不适合接触抑制检测。这排除了确定挥发性和非挥发性制剂对复杂生物活性混合物抗真菌活动的相对贡献。

我们开发的定量方法旨在测量干植物粉末对受控孢子数量的抗真菌作用，并生长沉积在阿加介质表面的菌株，以再现植物病变在^{感染植物15} 期间的空中生长，以及相互连接的my天体网络^16。该方法是基于阿加稀释和食物中毒方法的改进实验设置，在同一实验设置中，还允许并排量化挥发性和非挥发性抗真果代谢物的贡献。在这项研究中，该方法以三种特征良好的抗真真药制剂的活动为基准。

1. 伊诺库拉准备

1. 在实验之前，铺设5μL的三叶草。SBT10-2018 孢子储存在马铃薯脱糖agar介质（PDA）的4°C，在30°C下孵育4天，定期照射光线，促进锥状形成^42（图1，面板A）。
   注: 特里乔德玛。SBT10-2018已被与木材分离，并作为本研究的模型，以快速生长和容易孢子回收。我们的实验室保存了这种菌株。
2. 恢复锥体（图1，面板A）
   1. 将3 mL的0.05%补间-20放在 三叶草 上。
   2. 使用铲子从锥体中释放锥形;避免压在骨髓上，以防止催眠被撕掉。
   3. 用微皮迅速恢复溶液，以避免它被阿加介质吸收并转移到 15 mL 管中。
   4. 使用测高仪计算孢子总数，并准备包含 3 x 10⁶ 孢子/mL 的溶液。
      注意:必须谨慎执行此步骤，以防止催眠被提取。然后在显微镜下检查孢子制备。最终，对于呈现高度空中和蓬松的菌株，可以添加使用 40μM 过滤器过滤的步骤，以消除残留的菌片。

2. 真菌板制备（图1，面板B）

1. 将 100 μL 的 3 x 10⁶ 孢子/mL 与微皮条放在直径 9 厘米的 Petri 盘上，其中含有 PDA 介质，以获得 4，800 孢子/厘米^2， 相当于 925 孢子/5 mm 直径 agar 插头。
2. 用无菌铲加入直径为 10 克的直径为 2 毫米的玻璃珠，向前和向后移动，平行垂直于操作员的手臂，均匀地将孢子分布在 agar 表面。
3. 将板旋转 90° 并重复旋转运动（如第 2.2 节）;重复这些步骤，直到板已完全旋转。
4. 立即使用板来设置实验，要求孢子或孵育板在30°C为17小时或24小时时，分别早期催眠或骨髓，分别。
   注意:要比较在骨髓插头转移和菌盘转移后测量的反真菌活性，使用无菌钳子，并在孢子扩散后将无菌5毫米纤维素盘随机放置在阿加板表面。

3. 抗真面体化合物制备

1. 植物衍生产品制备:大蒜粉制备
   1. 剥开新鲜大蒜的丁香，用手术刀刀片将丁香切成2-3毫米宽的切片。
   2. 在 40 °C 下将切片空气干燥 2 天。
   3. 使用刀磨机将切片磨碎 3 x 15 秒以获得细粉末。
   4. 使用前将大蒜粉存放在 50 mL 管中，以 4 °C 的速度储存。
      注意:由于大蒜不自封（防止温度敏感抗真菌化合物的降解），使用前用70%乙醇清洁研磨机、手术刀和空气干燥机。
2. 精油制备
   1. 准备 0.5%， 1%， 2.5%， 5% 和 20% 提穆斯低俗是 精油解决方案在 0.5% Tween-80.
   2. 在将其添加到 PDA 介质之前，混合好以形成乳液（参见第 4.2 节）。
3. 卡本达齐姆准备
   1. 称量卡本达齐姆准备200毫克/升乙醇溶液（卡本达齐姆在水中溶性差）。
   2. 在将溶液添加到 PDA 介质之前，在室温下存储溶液（参见第 4.2 节）。
      警告:卡本达齐姆对健康和环境造成危害。处理此产品时，戴上手套和口罩。将其存放在通风空间中。

4. 接触抑制检测

1. 准备含有大蒜粉的阿加板
   1. 准备和高压灭菌PDA介质。
   2. 使用无菌铲将所需的大蒜粉量称重到 50 mL 管中，以获得浓度，浓度一般从 0.25 毫克/mL 到 16 毫克/mL 不等。
   3. 检查手腕内侧介质温度后，添加 10 mL PDA。温度必须尽可能低，以防止敏感分子的降解。理想情况下，这个温度应该是45°C。
   4. 通过将管子倒置以均匀地将粉末分配到 PDA 介质中，小心地同质化。快速将 10 mL 倒入直径为 5 厘米的培养皿中（图 1，面板 C）。
   5. 将培养皿置于室温下，等待，直到凝固。
2. 准备含有精油或卡本达齐姆的阿加板
   1. 将 10 mL 的 PDA 引入 50 mL 管中。检查温度，了解第 4.1.3 节。
   2. 在 PDA 中加入 100 μL 的 Thymus 低俗 精油不同解决方案，以获得 0.005% 、0.01%、0.025% 、0.05% 和 0.2% 的解决方案（见第 3.2.1 节）。
   3. 从 200 毫克/升溶液中添加所需的卡本达齐姆体积，以获取 0.0625-2 毫克/升（参见第 3.3.1 节）的解决方案。
   4. 通过将管子倒置，小心地同质化，快速将 10 mL 倒入直径为 5 厘米的培养皿（图 1，面板 C）中。
   5. 将培养皿置于室温下，等待，直到凝固。
3. 接触抑制检测 （图 1）
   1. 使用直径为 5 毫米的无菌不锈钢管，在培养皿中心绘制一个圆圈，内含 PDA 或 PDA，包括抗真菌化合物。使用无菌牙签（面板 C）处理 agar 圆柱体。
   2. 用一个直径为5毫米的无菌不锈钢管，地块从第2节随机进入真菌板。每板（面板 B）的绘图为 15-20 圈。
   3. 小心地取出由孢子、早期催眠或无菌牙签覆盖的麦片缸，并将插头放入含有 PDA 或 PDA（包括抗真菌化合物（面板 C）的培养皿的空腔中。
   4. 在 30 °C 时将含有孢子的板孵化 48 小时，在含有早期催眠的板上孵化 31 小时，在覆盖着 mycelium（面板 C） 的板上孵化 24 小时。
   5. 测量径向生长的直径，并使用公式（面板 D）计算真菌生长抑制控制百分比
      % 真菌生长抑制 = （C - A/C）* 100
      其中C是PDA介质径向生长的直径，A是含有抗真菌化合物的PDA介质径向生长的直径。
      注意:要比较在菌塞转移和菌斑盘转移后测量的抗真菌活性，使用无菌钳子，将先前沉积在培养皿中心的真菌盘表面（第 2 节注）中，其中含有含有抗真菌化合物的 PDA 或 PDA，并完全按照 agar-插头转移进行

5. 蒸汽-相抑制检测

1. 准备含有大蒜粉的阿加板
   1. 按照第 3.1 节进行。
2. 准备含有精油或卡本达齐姆的阿加板
   1. 按照第3.2节和第3.3节进行。
3. 准备真菌板
   1. 继续按第 2 节进行。
4. 蒸汽相抗真果抑制检测 （图1）
   1. 将 10 mL 的 PDA 介质倒入直径为 5 厘米的培养皿的盖子中，其中含有 10 mL PDA 介质或含有抗真面化合物的 10 mL PDA 介质到菜肴底部。等到室温（面板 C）完全凝固。
   2. 使用 50 mL 离心管作为校准工具，在盖子中心获得一圈 PDA:用无菌铲（面板 C）取出圆圈周围的 PDA。
   3. 用直径为 5 毫米的无菌不锈钢管在 PDA 介质的中心绘制一个圆圈。"用无菌牙签（面板 C）丢弃 agar 缸。
   4. 形成直径为 5 毫米的无菌不锈钢管的插头，随机插入真菌板，如第 4.3.2 节（面板 B）。
   5. 使用无菌牙签，小心地将覆盖着孢子、早期催眠或菌斑的插头从真菌板转移到检测板（面板 C）的盖子中。
   6. 在 30 °C 下孵化，如第 4.3.4 节（面板 C）。
   7. 测量径向生长的直径，并使用第 4.3.5 节（面板 D） 中的公式计算真菌生长抑制百分比。

为了评估定量方法区分不同类型抗真果化合物作用模式的能力，我们比较了三种知名抗真果剂的疗效。卡本达齐姆是一种非挥发性合成杀菌剂，已广泛用于控制^植物中广泛的真菌疾病^39，40。提木斯粗俗精油主要被描述为其抗菌和抗真菌活性，并被用作天然食品防腐剂^41。大蒜粉被选为植物衍生生物制品的模型。传统上，它一直被用作抗菌活动的天然疗法，这在很大程度上归因于挥发性有机硫化合物的存在，但也归因于非挥发性皂素和酚类化合物²⁶的存在，使这个模型在这项研究中具有复杂性。

这种定量方法依赖于在不同发育阶段从孢子转移到菌群中含有受控数量真菌的阿加塞，而在食物中毒方法中，5天至7天大的菌斑从纤维素盘¹³转移。在检测中，孢子、早期催眠（17 h 孵化）和菌精（24 h 孵育）被用作真菌材料。磁盘转移的使用可能与磁盘转移无关，因为圆盘转移后，锥形或残余催眠至少部分停留在 agar 介质上，从而导致 图 2中所示的增长抑制测量不准确。在转移位于纤维素盘下的阿加区域后，观察到不同直径的真菌径向生长，随后又观察到24小时孵化（图2，A、B和C面板），突出表明磁盘转移后阿加上残留真菌催眠的存在。残留催眠的量化已通过测量生长，导致高达22%的直径变异（图2，面板D）得到确认。接下来，使用 Thymus粗俗的 精油作为抗真果化合物，与阿加插头转移后获得的抑制作用（图2，面板E）进行评价。磁盘转移后生长抑制高于低 胸腺 油浓度的阿加塞转移后，导致对抑制作用的过度估计，这可能是由于真菌材料的不完全转移，并支持基于 agar-插头转移的方法。

特里乔德玛 · 斯普 SBT10-2018-生长抑制触发的三种抗真菌化合物下一次评估使用接触和蒸汽相抑制检测每个真菌阶段（图3）。孢子被小心地撒在阿加板上，以获得4，800孢子/厘米^2。它们通过使用5毫米无菌不锈钢管提取，直接转移到含有抗真菌化合物的阿加板上，使实验从孢子开始。在另外两个发育阶段，覆盖孢子的藻类板首先在30°C下孵育17小时或24小时，然后转移藻类塞，使海藻（17 h）和菌形成（24 h）（图3，面板A）的发芽和早期发育。为了量化活性挥发性分子对整体抗真菌活动的贡献，对接触抑制检测进行了调整，将孢子、早期催眠和菌精放置在距离倒入PDA介质的抗真菌化合物与接触抑制检测的距离上。 三叶草径向生长测量超过48小时，抑制百分比已确定与控制条件比较。最低抑制浓度 （MIC） 被定义为抗真菌化合物的最低浓度，在 30°C 的潜伏 48 小时后防止可见增长。

图3（面板B）显示，与早期催眠和骨髓网络相比，对卡本达齐姆的孢子敏感性更高，在 接触Trichoderma 和抗真菌化合物时，在0.25微克/mL卡本达齐姆分别具有50%、22%和30%的增长抑制。同时，孢子发芽估计的MIC值为0.5微克/mL，而早期催眠拉长和霉菌的MIC值已增加到0.75微克/mL。相比之下，当真菌根据这种物质的低挥发性放置在与杀菌剂的距离时，卡本达齐姆对 三叶 草没有抗真菌作用。我们用 胸腺粗俗 精油（TEO）作为抗真菌化合物（图3，面板C）得出的结果表明，与早期催眠和骨髓相比，孢子敏感度较高，分别在0.01%TEO下具有65%和约50%的增长抑制。获得的MIC值与孢子发芽和早期催眠拉长（0.025%TEO）相似，而对于骨髓生长（0.05%TEO）则更高。不出所料， 蒂穆斯低俗 精油呈现相同的抗真菌活性，无论真菌和油之间的距离。在孢子发芽和早期催眠拉长接触和蒸汽相测中获得了类似的MIC值（0.025%TEO），尽管在TEO和 Trichoderma 孢子接触时观察到的敏感性较低（接触时增长抑制60%，距离增长抑制45%）。令人惊讶的是，在接触和蒸汽相抑制检测中获得的MIC值不同（0.05%对0.1%）表明挥发性分子的某些部分对发育良好的菌精不活跃。最后，当使用大蒜粉作为抗真菌化合物（图3，面板D）时，观察到对孢子发芽（50%生长抑制在0.25毫克/mL大蒜粉和MIC值0.5毫克/mL）和早期催眠拉长（50%生长抑制）的疗效 59% 的增长抑制在 0.25 毫克/mL 和 MIC 值 0.5 毫克/mL） 比米青生长 （29% 增长抑制在 0.5 毫克/mL 大蒜粉和 MIC 值 0.75 毫克/mL）.当比较接触和蒸汽相测定时，结果显示，无论真菌发育阶段如何，远处的反真菌活动都显著减少。孢子发芽的MIC值从0.5毫克/mL移动至1毫克/mL，早期催眠拉长从0.5毫克/mL移动至2毫克/mL，从0.75毫克/mL移动至4毫克/mL，用于肌芽生长（图3、面板D和 图4 代表图片）。因此，这些结果表明，大蒜粉含有挥发性和非挥发性化合物的混合物，具有抗真菌特性。

总之，这些结果表明，植物衍生产品中含有的挥发性和非挥发性制剂的相对贡献可以在不同的真菌生长阶段确定，因为实验条件是可比的。这种方法特别适合抗真果化合物的复杂混合物。Thymus 粗俗精油是挥发性化合物的混合物，在距离和接触孢子发芽和早期催眠拉长时表现出类似的活性，支持比较这种蒸汽相和接触抑制检测，并强调向蒸汽阶段的迁移不会因注入阿加介质而受损。研究结果还强调，本研究中用作模型的大蒜粉含有非挥发性活性成分，这些成分对整体抗真菌活动有重大贡献，而忽略了从^27、28中提取的挥发性硫化物。

图1:接触和蒸汽相测协议的概要方案请点击这里查看此图的更大版本。

图2:与纤维素盘真菌转移相关的不准确性。 A.表示圆盘转移到由孢子覆盖的阿加板上，并将圆盘转移到含有抗真菌化合物B的阿加板表面的方案，代表纤维素盘下区域的阿加转移，然后进行孵化和残余生长测量。C.纤维素盘下区域转移后残留菌细胞径向生长的代表性图片。D.残余菌的径向生长测量。E.Thymus 粗俗精油对从纤维素盘或阿加塞转移的骨髓生长的影响 （N=2， 平均± SD）请单击此处查看此图的更大版本。

图3:使用蒸汽相和接触抑制检测孢子、早期催眠和骨髓的抗真菌活动比较。A.特里乔德玛孢子、早期催眠（17小时生长）和骨髓（24小时生长）的代表图片。三叶草生长抑制卡本达齐姆（B），胸腺粗俗精油（C）和大蒜粉（D） 。（N=2，平均±SD）请单击此处查看此图的较大版本。

图4:接触（A）或蒸汽相（B）抑制检测中阿加板块上大蒜抗真菌活性的代表性图片 请点击这里查看此图的较大版本。

此处介绍的方法允许评估最小加工植物衍生产品的抗真菌特性。在此协议中，使用 2 mm 玻璃珠实现在 agar 表面上孢子的均质分布。这一步骤要求处理技能正确分配珠子并获得可重复的结果，最终允许比较真菌生长不同阶段的抗真菌效果。我们发现，5毫米玻璃珠或过度旋转，而在传播过程中均质可能导致可变的生长直径。因此，我们建议在实验前进行培训，以掌握孢子分布。此外，当必须测试植物粉末时，必须注意产品向阿加介质的均质分散。为了防止粉末在板底部沉降，当熔化介质的温度达到 45 °C（室温为 24 °C 时），产品必须混合到 agar 介质中等。这种温度必须根据当地的室温进行调整，以避免沉降。

虽然我们在这里描述的方法可以提供有价值的见解，但必须考虑一些缺点。这种方法允许在单个实验设置中进行准确和并排比较，而牺牲了大量的准备时间，因为要准备的 agar 板数量可能很大，具体取决于必须回答的问题。此外，此检测是一种中等尺度检测，专为 5 厘米的培养皿设计。因此，测试所有方面所需的活性物质量可以相当可观。这意味着稀有物质可能不适合本协议的测试候选者。使用较小的培养皿和缩小插头的大小可以考虑缩小检测范围。这可以使用此处描述的基准协议进行测试，并特别注意 agar-插头提取，这可能很困难。径向生长测量的准确性可能会在较小的尺度上降低。

目前的方法适合测量溶液中化合物的抗真面活性，不太适用于研究粉末^13。我们建立的方法非常适用于液体和固体化合物，这允许评估最低加工植物衍生产品的抗真菌特性。这减少了测试提取物所需的时间，并减少了与显示溶解性差的活性物质相关的陷阱。由于一些植物衍生产品含有对高温^敏感的活性分子，这为限制此类化合物活性损失的风险提供了优势。这种方法已经适应了阿加扩散法和食物中毒法15，16，17，18，19，以进一步允许使用类似的实验设置在不同的真菌生长阶段的抗真菌活动直接比较。Agar 插头转移可准确控制检测中微生物的数量。这是一个优势，而不是磁盘转移，这导致高估与孢子或催眠不完全转移相关的抗真菌效果。最后，虽然蒸汽相测定一般不应用于接触抑制检测27、28、29、30、31，但我们建议的方法解决了植物粉末或提取物等复杂混合物中含有的挥发性和非挥发性制剂的相对贡献，并最终允许在不同的真菌生长阶段评估抗真菌活动。

我们在这里描述的方法可能特别相关，以支持需要评估植物衍生产品中用于生物控制的反真菌特性的方法。我们建议的定量方法允许操作员确定挥发性和非挥发性化合物对复杂生物活性混合物抗真菌活性的相应贡献。这提供了有价值的信息，可以指导选择治疗的应用模式和执行液体提取的相关性。可能考虑与目标植物病原（例如，将生物控制产品纳入包装）或可能需要直接接触以优化生物控制产品的功效（在植物上雾化或将水果浸入生物控制产品的解决方案）的应用。它还允许比较不同真菌生长阶段的抗真菌功效，从孢子发芽到晚期的骨髓生长，从而确定了确定将生物控制产品应用于作物所需的控制阈值的建议。事实上，确定不同真菌阶段物质的疗效可能有助于分类物质是否可以用作预防性或治疗性治疗，并规划生物控制产品的植物治疗时间表。这对于在田间或收获后使用产品时的功效至关重要。

没有

我们非常感谢弗兰克·耶茨的宝贵建议。这项工作得到了苏普生物技术公司的支持。