Messung der flüchtigen und nichtflüchtigen Antimykotika-Aktivität von Biocontrol-Produkten

Wir beschreiben eine modifizierte Agar-basierte Methode zur Quantifizierung der antimykotischen Wirkung pflanzlicher Produkte. Sowohl flüchtige als auch nichtflüchtige Beiträge zur Antimykotika-Aktivität können durch dieses Protokoll bewertet werden. Darüber hinaus kann die Wirksamkeit gegen Pilze in wichtigen Entwicklungsstadien in einem einzigen Versuchsaufbau gemessen werden.

Das beschriebene Protokoll basiert auf einer Plug-Transfer-Technik, die eine genaue Bestimmung der Mikroorganismenmengen und deren Entwicklungsstadien ermöglicht. Eine bestimmte Anzahl von Sporen wird auf einer Agarplatte verteilt. Diese Agarplatte wird für einen definierten Zeitraum inkubiert, damit die Pilze das erwartete Entwicklungsstadium erreichen können, mit Ausnahme von Sporen, bei denen keine Inkubation erforderlich ist. Agar-Stecker, die von Sporen, Hyphen oder Myzel bedeckt sind, werden als nächstes zurückgezogen und auf Agar-Medien übertragen, die die antimykotische Verbindung enthalten, die entweder in einem Abstand von den Pilzen oder in Kontakt gebracht werden soll. Dieses Verfahren ist sowohl für die Prüfung von flüssigen Extrakten als auch für feste Proben (Pulver) anwendbar. Es eignet sich besonders gut zur Quantifizierung der relativen Beiträge flüchtiger und nichtflüchtiger Wirkstoffe in bioaktiven Mischungen und zur Bestimmung ihrer Auswirkungen, insbesondere auf Sporen, frühe Hyphen und Myzel.

Das Verfahren ist für die Charakterisierung der antimykotischen Aktivität von Biokontrollprodukten, insbesondere pflanzlichen Produkten, von großer Bedeutung. Für die Pflanzenbehandlung können die Ergebnisse tatsächlich verwendet werden, um die Wahl der Art der Anwendung zu steuern und die Auslöseschwellen festzulegen.

Globale Verluste von Obst und Gemüse können bis zu 50% der Produktion¹ erreichen und resultieren vor allem durch Lebensmittelzerfall durch Pilzverderb auf dem Feld oder während der Lagerung nach der Ernte^2,3, trotz der umfangreichen Beschäftigung von synthetischen Fungiziden seit der Mitte des zwanzigsten Jahrhunderts⁴. Die Verwendung dieser Stoffe wird überdacht, da sie ernste Umwelt- und Gesundheitsgefahren darstellt. Da die schädlichen Folgen ihrer Verwendung in allen Ökosystemen auftauchen und sich Hinweise auf mögliche gesundheitliche Auswirkungen angesammelt haben^5,6, werden neue Alternativen zu alten prophylaktischen Strategien für Behandlungen vor und nach der Ernte entwickelt^7,8,9. Daher ist die Herausforderung, vor der wir stehen, zweifach. Neuartige fungizide Strategien müssen erstens das Niveau der Wirksamkeit des Lebensmittelschutzes gegen Phytopathogene aufrechterhalten und gleichzeitig dazu beitragen, den ökologischen Fußabdruck landwirtschaftlicher Praktiken drastisch zu verringern. Um dieses ehrgeizige Ziel zu erreichen, werden Strategien vorgeschlagen, die von den natürlichen Abwehrmaßnahmen inspiriert sind, die in Pflanzen entwickelt wurden, da mehr als 1000 Pflanzenarten für ihre antimikrobiellen Eigenschaften hervorgehoben wurden⁸. Zum Beispiel sind Pflanzen, die natürliche Fungizide zur Bekämpfung von Phytopathogenen entwickelt haben, eine neue Ressource bei der Erforschung der Entwicklung neuer Biokontrollprodukte². Ätherische Öle sind Flaggschiff-Moleküle dieser Art. Zum Beispiel schützt Ätherisches Origanum Tomatenpflanzen vor grauer Schimmelin in den Gewächshäusern ¹⁰ und Solidago canadensis L. und Cassia ätherische Öle haben gezeigt, dass sie nachgeernteten Erdbeeren vor grauer Schimmelbildung bewahren^11,12. Diese Beispiele veranschaulichen, dass Biokontrolle und insbesondere pflanzliche Produkte eine Lösung darstellen, die biologische Wirksamkeit und ökologische Nachhaltigkeit verbindet.

Pflanzen sind daher eine wichtige Ressource von Molekülen, die für die Pflanzenschutzindustrie von potenziellem Interesse sind. Es wurde jedoch nur eine Handvoll pflanzlicher Produkte vorgeschlagen, die als Biokontrollprodukte verwendet werden sollen, obwohl sie allgemein als sicher, nicht phytotoxisch und umweltfreundlich anerkannt sind². Es wurden einige Schwierigkeiten bei der Umsetzung vom Labor auf das Feld beobachtet, wie z. B. die Wirksamkeit, die nach anwendung in vivo^2,9abnimmt. Daher wird es wichtig, die Fähigkeit von Labortests zu verbessern, um die Feldwirksamkeit besser vorherzusagen. In diesem Zusammenhang sind antimykotische Prüfmethoden für pflanzliche Produkte sowohl zur Bewertung ihrer antimykotischen Wirksamkeit als auch zur Definition ihrer optimalen Einsatzbedingungen erforderlich. Insbesondere sind Biokontrollprodukte im Allgemeinen weniger effizient als chemische Fungizide, daher ist ein besseres Verständnis ihrer Wirkungsweise wichtig, um geeignete Formulierungen vorzuschlagen, die Art der Anwendung in Bereichen zu ermitteln und zu definieren, welches Entwicklungsstadium des Erregers anfällig für das Gegenprodukt ist.

Zu den aktuellen Ansätzen, die sich mit antibakteriellen und antimykotischen Aktivitäten befassen, gehören Diffusionsmethoden wie Agar-Disk-Diffusion, Verdünnung, Bioautographie und Durchflusszytometrie.¹³. Die meisten dieser Techniken, genauer gesagt, die Standard-Antimykotika-Anfälligkeitstests - Agar-Disk-Diffusion und Verdünnungstests - sind gut für die Bewertung der antimikrobiellen Aktivität von löslichen Verbindungen auf bakteriellen und Pilzsporen in flüssigen Suspensionen geeignet.¹⁴. Diese Methoden eignen sich jedoch im Allgemeinen nicht zur Prüfung fester Verbindungen wie getrocknetes Pflanzenpulver oder zur Quantifizierung der antimykotischen Aktivität während des Myzelwachstums, da sie eine Sporenverdünnung oder Sporenausbreitung auf Agarplatten und/oder Verdünnung von Antimykotika erfordern.¹³. Bei der lebensmittelvergifteten Methode werden Agarplatten, die das Antimykotika enthalten, mit einer Scheibe mit einem Durchmesser von 5-7 mm aus einer 7-Tage alten Pilzkultur geimpft, ohne die genaue Menge des beginnenden Myzels zu berücksichtigen. Nach der Inkubation wird die antimykotische Aktivität als Prozent der radialen Wachstumshemmung bestimmt^17,18,19. Mit diesem Ansatz können wir die antimykotische Aktivität auf mycelial Wachstum bewerten. Im Gegensatz dazu wird das Agar-Verdünnungsverfahren durchgeführt, um die antimykotische Aktivität auf Sporen zu bestimmen, die direkt auf der Oberfläche der Agarplatte geimpft werden, die die antimykotischen Verbindungen enthält.^13,20,21. Diese beiden Ansätze liefern ergänzende Ergebnisse zur antimykotischen Aktivität. Dies sind jedoch zwei unabhängige Techniken, die parallel verwendet werden und keinen genauen Vergleich der relativen Wirksamkeit von Antimykotika auf Sporen und Myzel ermöglichen.^17,20,22 da sich die Menge des Beginnenden Pilzmaterials in den beiden Ansätzen unterscheidet. Darüber hinaus resultiert die antimykotische Aktivität eines pflanzlichen Produkts oft aus der Kombination von antimykotischen Molekülen, die von Pflanzen synthetisiert werden, um Krankheitserregern zu begegnen. Diese Moleküle umfassen Proteine, Peptide^23,24, und Metaboliten mit großer chemischer Vielfalt und Zugehörigkeit zu verschiedenen Klassen von Molekülen wie Polyphenole, Terpene, Alcalo-ds²⁵, Glucosinolate⁸, und Organosulfur Verbindungen²⁶. Einige dieser Moleküle sind flüchtig oder werden während des Erregerangriffs flüchtig²⁷. Bei diesen Wirkstoffen handelt es sich meist um schlecht wasserlösliche und hochdampfbelastete Verbindungen, die durch Wasserdestillation als ätherische Öle zurückgewonnen werden müssen.²⁸. Vapor-Phase vermittelte Anfälligkeits-Assays wurden entwickelt, um die antimikrobielle Aktivität flüchtiger Verbindungen nach Verdampfung und Migration über die Dampfphase zu messen²⁹. Diese Methoden basieren auf der Einführung antimykotischer Verbindungen in einer Entfernung von der mikrobiellen^{29,30,31,32,33}. Im häufig verwendeten Dampfphasen-Agar-Assay werden ätherische Öle auf einer Papierscheibe abgelagert und in der Mitte der Abdeckung der Petrischale in der Entfernung von der bakteriellen oder Pilzsporensuspension platziert, die auf Agarmedium verteilt wird. Der Durchmesser der Wachstumshemmungszone wird dann auf die gleiche Weise gemessen wie bei der Agar-Disk-Diffusionsmethode^20,24. Es wurden weitere Ansätze entwickelt, um die quantitative Messung der Antimykotika-Empfindlichkeit von ätherischen Ölen in der Dampfphase zu ermöglichen, die aus der Brüroth-Verdünnungsmethode abgeleitet wurde, aus der eine hemmende, dampfphasenvermittelte antimikrobielle Aktivität berechnet wurde.³², oder abgeleitet von Agar-Disk Diffusions-Assays³¹. Diese Methoden sind im Allgemeinen spezifisch für Dampfphasenaktivitätsstudien und nicht geeignet für Kontaktinhibitionstests. Dies schließt die Bestimmung des relativen Beitrags flüchtiger und nichtflüchtiger Wirkstoffe zur antimykotischen Aktivität eines komplexen bioaktiven Gemischs aus.

Die von uns entwickelte quantitative Methode zielt darauf ab, die antimykotische Wirkung von getrocknetem Pflanzenpulver auf kontrollierte Sporenmengen und angebautes Myzel, das auf der Oberfläche eines Agarmediums abgelagert wird, zu messen, um das Luftwachstum von Phytopathogenen während der Infektion der Pflanzen¹⁵ sowie eines miteinander verbundenen Myzelnetzes¹⁶zu reproduzieren. Der Ansatz ist ein modifiziertes Versuchsgebild, das auf den Agar-Verdünnungs- und Lebensmittel-vergifteten Methoden basiert, die auch im gleichen Versuchsaufbau eine nebeneinander-bezogene Quantifizierung des Beitrags sowohl flüchtiger als auch nichtflüchtiger antimykogaler Metaboliten ermöglicht. In dieser Studie wurde die Methode mit der Aktivität von drei gut charakterisierten Antimykotika gemessen.

1. Inocula-Vorbereitung

1. Vor dem Experiment lagen 5 L Trichoderma spp. SBT10-2018 Sporen bei 4 °C auf Kartoffeldextrose Agar Medium (PDA) gelagert und inkubieren für 4 Tage bei 30°C mit regelmäßiger Lichtexposition zur Förderung der Konidienbildung⁴² (Abbildung 1, Panel A).
   HINWEIS: Trichoderma spp. SBT10-2018 wurde aus Holz isoliert und wird als Modell in dieser Studie für sein schnelles Wachstum und die einfache Erholung der Sporen verwendet. Diese Sorte wird von unserem Labor konserviert.
2. Conidia wiederherstellen (Abbildung 1, Panel A)
   1. Legen Sie 3 ml von 0.05% Tween-20 auf das Trichoderma Myzel.
   2. Verwenden Sie einen Rechen, um Conidia von Conidiophoren zu lösen; vermeiden Sie es, auf das Myzel zu drücken, um zu verhindern, dass Hyphen weggerissen werden.
   3. Stellen Sie die Lösung schnell mit einer Mikropipette wieder her, um zu vermeiden, dass sie vom Agarmedium absorbiert wird, und übertragen Sie sie in ein 15 ml-Rohr.
   4. Zählen Sie die Gesamtzahl der Sporen mit einem Hämozytometer und bereiten Sie eine Lösung mit 3 x 10⁶ Sporen/ml vor.
      HINWEIS: Dieser Schritt muss sorgfältig ausgeführt werden, um zu verhindern, dass Hyphen extrahiert werden. Die Sporenpräparation wird dann unter dem Mikroskop überprüft. Schließlich kann bei Stämmen, die hochantennes und flauschiges Myzel darstellen, ein Schritt der Filtration mit einem 40-M-Siebfilter hinzugefügt werden, um das Restmyzelfragment zu beseitigen.

2. PilzplattenVorbereitung (Abbildung 1, Tafel B)

1. Legen Sie 100 l von 3 x 10⁶ Sporen/ml mit einer Mikropipette auf einer Petrischale mit PDA-Medium mit 9 cm Durchmesser ab, um 4.800 Sporen/cm² zu erhalten, was 925 Sporen/5 mm Durchmesser-Agar-Stecker entspricht.
2. Fügen Sie 10 g Glasperlen mit 2 mm Durchmesser mit einem sterilen Spachtel hinzu und führen Sie Vorwärts- und Rückwärtsbewegungen parallel und senkrecht zum Arm des Bedieners aus, um die Sporen auf der Oberfläche des Agars gleichmäßig zu verteilen.
3. Drehen Sie die Platte um 90° und wiederholen Sie die rotierenden Bewegungen (wie in Abschnitt 2.2); wiederholen Sie diese Schritte, bis die Platte vollständig gedreht wurde.
4. Verwenden Sie die Platte sofort, um Experimente zu beginnen, die Sporen erfordern, oder bebrüten Sie die Platten bei 30 °C für 17 h bzw. 24 h, wenn frühe Shyphen bzw. Myzel benötigt werden.
   ANMERKUNG: Um die antimykotische Aktivität zu vergleichen, die nach mycelium plug-transfer und Mycelium Disk-Transfer gemessen wird, verwenden Sie sterile Pinzette und legen Sterile 5 mm Cellulosescheiben nach dem Sporenstreunen zufällig auf die Oberfläche der Agarplatte.

3. Antimykotika-Herstellung

1. Pflanzliche Produktzubereitung: Knoblauch-Pulver-Zubereitung
   1. Die Nelken von frischem Knoblauch schälen und die Nelken mit einer Skalpellklinge in 2-3 mm breite Scheiben schneiden.
   2. Die Scheiben 2 Tage bei 40 °C lufttrocknen.
   3. Schleifen Sie die Scheiben für 3 x 15 Sekunden mit einer Messermühle, um ein feines Pulver zu erhalten.
   4. Das Knoblauchpulver vor Gebrauch bei 4 °C in 50 ml-Röhrchen lagern.
      HINWEIS: Da Knoblauch nicht autoklaviert ist (um den Abbau temperaturempfindlicher Antimykotika zu verhindern), reinigen Sie den Schleifer, das Skalpell und den Lufttrockner vor Gebrauch mit 70 % Ethanol.
2. Ätherische Ölzubereitung
   1. Bereiten Sie 0,5%, 1%, 2,5%, 5% und 20% Thymus vulgaris ätherische Öllösungen in 0,5% Tween-80 vor.
   2. Gut mischen, um eine Emulsion zu bilden, bevor sie in das PDA-Medium einfügt (siehe Abschnitt 4.2).
3. Carbendazim Vorbereitung
   1. Wiegen Sie Carbendazim, um eine 200 mg/L Ethanollösung vorzubereiten (Carbendazim ist schlecht in Wasser löslich).
   2. Bewahren Sie die Lösung bei Raumtemperatur auf, bevor Sie sie in das PDA-Medium einfügt (siehe Abschnitt 4.2).
      VORSICHT: Carbendazim stellt eine Gesundheits- und Umweltgefährdung dar. Tragen Sie Handschuhe und Maske, wenn Sie mit diesem Produkt umgehen. Bewahren Sie es in einem belüfteten Raum auf.

4. Kontaktinhibitionstest

1. Zubereitung von Agarplatten mit Knoblauchpulver
   1. Vorbereiten und Autoklav PDA Medium.
   2. Wiegen Sie die gewünschte Knoblauchpulvermenge mit einem sterilen Spachtel in ein 50 ml-Rohr, um Konzentrationen von 0,25 mg/ml bis 16 mg/ml zu erhalten.
   3. Fügen Sie 10 ml PDA hinzu, nachdem Sie die Temperatur des Mediums auf der Innenseite des Handgelenks überprüft haben. Die Temperatur muss so niedrig wie möglich sein, um den Abbau empfindlicher Moleküle zu verhindern. Idealerweise sollte diese Temperatur 45 °C betragen.
   4. Homogenisieren Sie sorgfältig, indem Sie das Rohr auf den Kopf stellen, um das Pulver gleichmäßig in das PDA-Medium zu verteilen. Gießen Sie schnell 10 ml in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 5 cm(Abbildung 1, Tafel C).
   5. Mit der Petrischale bei Raumtemperatur platziert, warten, bis der Agar erstarrt.
2. Herstellung von Agarplatten mit ätherischem Öl oder Carbendazim
   1. 10 ml PDA in ein 50 ml Rohr einführen. Überprüfen Sie die Temperatur wie für Abschnitt 4.1.3.
   2. Fügen Sie 100 l der verschiedenen Lösungen von Thymus vulgaris ätherischem Öl in PDA hinzu, um 0,005%, 0,01%, 0,025%, 0,05% und 0,2% Lösungen zu erhalten (siehe Abschnitt 3.2.1).
   3. Fügen Sie das erforderliche Volumen von Carbendazim aus der 200 mg/L-Lösung hinzu, um Lösungen von 0,0625-2 mg/L zu erhalten (siehe Abschnitt 3.3.1).
   4. Homogenisieren Sie sorgfältig, indem Sie das Rohr auf den Kopf stellen, gießen Sie schnell 10 ml in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 5 cm(Abbildung 1, Tafel C).
   5. Mit der Petrischale bei Raumtemperatur platziert, warten, bis der Agar erstarrt.
3. Kontakthemmungstest (Abbildung 1)
   1. Mit einem sterilen Edelstahlrohr mit einem Durchmesser von 5 mm zeichnen Sie einen Kreis in der Mitte von Petrischalen, die entweder PDA oder PDA einschließlich antimykotischer Verbindungen enthalten. Entsorgen Sie den Agarzylinder mit einem sterilen Zahnstocher (Panel C).
   2. Mit einem sterilen Edelstahlrohr mit einem Durchmesser von 5 mm kreist das Plot zufällig in die Pilzplatten aus Abschnitt 2. Plotten Sie zwischen 15-20 Kreisen pro Platte (Panel B).
   3. Ziehen Sie die von Sporen, frühen Hyphen oder Myzel bedeckten Agar-Zylinder vorsichtig mit einem sterilen Zahnstocher ab und legen Sie die Stecker in den leeren Raum von Petri-Gerichten, die entweder PDA oder PDA mit antimykotischen Verbindungen (Panel C) enthalten.
   4. Inkubieren Sie die Platten mit Sporen für 48 h bei 30 °C, 31 h für die Platten mit frühem Hyphen und 24 h für die mit Myzel bedeckten Platten (Tafel C).
   5. Messen Sie den Durchmesser des radialen Wachstums und berechnen Sie den Prozentsatz der Pilzwachstumshemmung über die Kontrolle mit der Formel (Panel D)
      % Pilzwachstumshemmung = (C - A/C)* 100
      wobei C der Durchmesser des radialen Wachstums in PDA medium und A der Durchmesser des radialen Wachstums in PDA-Medium ist, das die antimykotischen Verbindungen enthält.
      ANMERKUNG: Um die antimykotische Aktivität zu vergleichen, die nach myzelischem Plug-Transfer und Myzelscheibentransfer gemessen wurde, mit steriler Pinzette, eine Scheibe mit einem Durchmesser von 5 mm, die zuvor auf die Oberfläche der Pilzplatten (Abschnitt 2 Hinweis) in der Mitte von Petrischalen mit PDA oder PDA mit Antimykotika abgelagert wurde, und genau wie bei der Agar-Plug-Übertragung vorzugehen

5. Vapor-Phase Inhibitionstest

1. Zubereitung von Agarplatten mit Knoblauchpulver
   1. Fahren Sie wie in Abschnitt 3.1 fort.
2. Herstellung von Agarplatten mit ätherischem Öl oder Carbendazim
   1. Fahren Sie wie in Abschnitt 3.2 und 3.3 fort.
3. Herstellung von Pilzplatten
   1. Fahren Sie wie in Abschnitt 2 fort.
4. Dampfphasen-Antimykotika-Hemmungstest (Abbildung 1)
   1. Gießen Sie 10 ml PDA-Medium in den Deckel der Petrischalen mit einem Durchmesser von 5 cm, die entweder 10 ml PDA-Medium oder 10 ml PDA-Medium enthalten, das antimykotische Verbindungen enthält, in den Boden der Gerichte. Warten Sie, bis die vollständige Erstarrung des Agars bei Raumtemperatur (Panel C) abgeschlossen ist.
   2. Verwenden Sie ein 50 ml Zentrifugalrohr als Kalibrierwerkzeug, um einen Kreis von PDA in der Mitte des Deckels zu erhalten; den PDA um den Kreis herum mit einem sterilen Spachtel (Panel C) zu entfernen.
   3. Zeichnen Sie einen Kreis in der Mitte des PDA-Mediums in den Deckel mit einem 5 mm Durchmesser sterilen Edelstahlrohr platziert. Entsorgen Sie den Agar-Zylinder mit einem sterilen Zahnstocher (Panel C).
   4. Formstecker mit einem sterilen Edelstahlrohr mit einem Durchmesser von 5 mm nach dem Zufallsprinzip in die Pilzplatten wie in Abschnitt 4.3.2 (Tafel B).
   5. Übertragen Sie die stecker, die entweder mit Sporen, frühem Hyphen oder Myzel von Pilzplatten bedeckt sind, vorsichtig in die Deckel der Assayplatten (Panel C).
   6. Bei 30 °C wie in Abschnitt 4.3.4 (Panel C) inkubieren.
   7. Messen Sie den Durchmesser des radialen Wachstums und berechnen Sie den Prozentsatz der Pilzwachstumshemmung mit der Formel in Abschnitt 4.3.5 (Panel D).

Um die Fähigkeit der quantitativen Methode zu bewerten, die Wirkungsweise verschiedener Arten von Antimykotika zu unterscheiden, haben wir die Wirksamkeit von drei bekannten Antimykotika verglichen. Carbendazim ist ein nichtflüchtiges synthetisches Fungizid, das weit verbreitet ist, um eine breite Palette von Pilzerkrankungen in Pflanzen zu kontrollieren^39,40. Thymus vulgaris ätherisches Öl wurde weitgehend für seine antibakterielle und antimykotische Aktivität beschrieben und wird als natürliches Lebensmittelkonservierungsmittel⁴¹verwendet. Knoblauchpulver wurde als Modell für ein pflanzliches Bioprodukt ausgewählt. Es wurde traditionell als natürliches Heilmittel mit antimikrobiellen Aktivitäten verwendet, die weitgehend auf das Vorhandensein von flüchtigen Organosulfur-Verbindungen, aber auch auf das Vorhandensein von nichtflüchtigen Saponinen und Phenolverbindungen²⁶zurückzuführen sind, was diesem Modell eine in dieser Studie relevante Komplexität verleiht.

Diese quantitative Methode beruht auf der Übertragung von Agar-Steckern, die kontrollierte Mengen an Pilzen in verschiedenen Entwicklungsstadien von Sporen zu Myzel enthalten, während bei der lebensmittelvergifteten Methode 5 Tage bis 7 Tage altes Myzel aus Zellulosescheiben übertragen wird¹³. Im Test wurden Sporen, frühe Hyphen (17 h Inkubation) und Myzel (24 h Inkubation) als beginnendes Pilzmaterial verwendet. Die Verwendung der Datenträgerübertragung ist möglicherweise nicht relevant, da Conidia oder Resthyphen nach der Übertragung der Scheibe zumindest teilweise auf dem Agarmedium verbleiben, was anschließend zu einer ungenauen Messung der Wachstumshemmung führt, wie in Abbildung 2dargestellt. Nach der Übertragung von Agarbereichen unter Zelluloseplatten, gefolgt von einer 24-h-Inkubation(Abbildung 2, Die Paneele A, B und C), die das Vorhandensein von Restpilzhyphase auf Agar nach der Übertragung der Scheibe hervorheben, wurden verschiedene Durchmesser des pilzradialen Wachstums beobachtet. Die Quantifizierung von Resthyphen wurde durch die Messung des Wachstums bestätigt, die zu einer Durchmesservariabilität von bis zu 22 % führt(Abbildung 2, Panel D). Die Wirkung auf die Wachstumshemmung wurde als nächstes mit Thymus vulgaris ätherisches Öl als Antimykotika-Verbindung bewertet und im Vergleich zu der Hemmung nach Agar-Plug-Transfer erhalten(Abbildung 2, Panel E). Die Wachstumshemmung nach der Übertragung von Platten war höher als nach agar-Plug-Transfer für niedrige Thymus-Ölkonzentrationen, was zu einer Überschätzung der hemmenden Wirkung führte, die auf eine unvollständige Übertragung von Pilzmaterial zurückzuführen sein könnte und den Ansatz auf der Grundlage des Agar-Plug-Transfers unterstützen könnte.

Trichoderma spp. Die durch die drei antimykogalen Verbindungen ausgelöste SBT10-2018-Wachstumshemmung wurde als nächstes anhand der Kontakt- und Dampfphaseninhibitionstests für jede Pilzstufe bewertet (Abbildung 3). Sporen wurden sorgfältig auf Agarplatten verteilt, um 4.800 Sporen/cm²zu erhalten. Sie wurden direkt auf Agarplatten übertragen, die antimykotische Verbindungen durch Agar-Plug-Extraktion mit einem 5 mm sterilen Edelstahlrohr enthalten, so dass das Experiment von den Sporen aus beginnen konnte. In den beiden anderen Entwicklungsstadien wurden zunächst mit Sporen bedeckte Agarplatten für 17 h oder 24 h bei 30°C inkubiert, bevor der Agarstecker übertragen wurde, um die Keimung und frühe Entwicklung von Hyphen (17 h) und Myzelbildung (24 h) zu ermöglichen(Abbildung 3, Panel A). Um den Beitrag aktiver flüchtiger Moleküle zur gesamten Antimykotika-Aktivität zu quantifizieren, wurde der Kontaktinhibitionstest angepasst und Sporen, frühe Hyphen und Myzel wurden in einer Entfernung von den antimykotischen Verbindungen platziert, die in das PDA-Medium gegossen wurden, wie für den Kontaktinhibition-Assay. Das Trichoderma-Radialwachstumwurde über 48 Stunden gemessen und der Hemmungsanteil wurde im Vergleich zu den Kontrollbedingungen bestimmt. Die minimalhemmende Konzentration (MIC) wurde als die niedrigste Konzentration von Antimykotika definiert, die ein sichtbares Wachstum nach 48 h Inkubation bei 30°C verhindert.

Abbildung 3(Panel B) zeigt eine höhere Sporenempfindlichkeit gegenüber Carbendazim im Vergleich zu frühen Hyphen- und Myzelnetzwerken mit einer Wachstumshemmung von 50 %, 22 % bzw. 30 % bei 0,25 g/ml Carbendazim, wenn Trichoderma und Antimykotische Verbindungen in Kontakt standen. Gleichzeitig wurde bei der Sporenkeimung ein MIC-Wert von 0,5 g/ml geschätzt, während bei der frühen Hyphendehnung und dem Myzel ein Anstieg auf 0,75 g/ml erzielt wurde. Im Gegensatz dazu hatte Carbendazim keine antimykotische Wirkung auf Trichoderma, wenn der Pilz in Übereinstimmung mit der geringen Volatilität dieser Substanz in Entfernung vom Fungizid platziert wurde. Die Ergebnisse, die wir mit Thymus vulgaris ätherischem Öl (TEO) als Antimykotika(Abbildung 3, Panel C) erhalten haben, haben eine höhere Sporenempfindlichkeit gegenüber TEO im Vergleich zu frühen Hyphen und Myzel mit 65% bzw. ca. 50% Wachstumshemmung bei 0,01% TEO gezeigt. Die erhaltenen MIC-Werte waren bei Sporenkeimung und früher Hyphendehnung (0,025% TEO) ähnlich und höher für das Myzelwachstum (0,05% TEO). Wie erwartet, Thymus vulgaris ätherisches Öl präsentierte identische antimykotische Aktivität unabhängig von der Entfernung zwischen dem Pilz und dem Öl. Ähnliche MIC-Werte (0,025% TEO) wurden bei Sporenkeimung und früher Hyphendehnung für Kontakt- und Dampfphasentests ermittelt, obwohl im niedrigeren Prozentsatz eine höhere Empfindlichkeit beobachtet wurde, wenn TEO- und Trichoderma-Sporen in Kontakt waren (60% Wachstumshemmung in Kontakt gegenüber 45% Wachstumshemmung in der Entfernung). Überraschenderweise unterschieden sich die am Myzel ermittelten MIC-Werte in den Kontakt- und Dampfphaseninhibitionstests (0,05% versus 0,1%) deutet darauf hin, dass ein Teil der flüchtigen Moleküle gegen ein gut entwickeltes Myzel nicht aktiv ist. Schließlich möchte ich, bei Verwendung von Knoblauchpulver als Antimykotika(Abbildung 3, Panel D) wurde eine höhere Wirksamkeit gegen Sporenkeimung (50% Wachstumshemmung bei 0,25 mg/ml Knoblauchpulver und MIC-Wert von 0,5 mg/ml) und frühe Hyphendehnung (59% Wachstumshemmung bei 0,25 mg/ml und MIC-Wert von 0,5 mg/ml) als bei Myzelwachstum (29% Wachstumshemmung bei 0,5 mg/ml Knoblauchpulver und MIC-Wert von 0,75 mg/ml). Beim Vergleich von Kontakt- und Dampfphasentests zeigten die Ergebnisse unabhängig vom Entwicklungsstadium des Pilzes eine signifikante Abnahme der antimykotischen Aktivität in der Ferne. Die MIC-Werte bewegten sich von 0,5 mg/ml auf 1 mg/ml für die Sporenkeimung, von 0,5 mg/ml auf 2 mg/ml für die frühe Hyphendehnung und von 0,75 mg/ml auf 4 mg/ml für das Myzelwachstum(Abbildung 3, Panel D und Abbildung 4 für repräsentative Bilder). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Knoblauchpulver eine Mischung aus flüchtigen und nichtflüchtigen Verbindungen mit antimykotischen Eigenschaften enthält.

Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass der relative Beitrag flüchtiger und nichtflüchtiger Wirkstoffe, die in pflanzlichen Produkten enthalten sind, in verschiedenen Pilzwachstumsstadien bestimmt werden kann, da die experimentellen Bedingungen vergleichbar sind. Dieser Ansatz eignet sich dann besonders gut für komplexe Mischungen antimykotischer Verbindungen. Thymus vulgaris ätherisches Öl ist eine Mischung aus flüchtigen Verbindungen und zeigt eine ähnliche Aktivität in der Entfernung und in Kontakt für Sporenkeimung und frühe Hyphendehnung, unterstützt den Vergleich dieser Dampfphase und Kontakt-Hemmung Assay und betont, dass migration in die Dampfphase nicht durch Gießen in das Agarmedium beeinträchtigt wird. Die Ergebnisse unterstreichen auch, dass Knoblauchpulver, das in dieser Studie als Modell verwendet wird, nichtflüchtige Wirkstoffe enthält, die einen signifikanten Beitrag zur gesamten antimykotischen Aktivität leisten und zugunsten flüchtiger Thiosulfinate, die aus Allium^{abgeleitet wurden,}vernachlässigt^wurden.

Abbildung 1: Synoptisches Schema des Protokolls für Kontakt- und Dampfphasen-Assays Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Ungenauigkeit im Zusammenhang mit Pilzübertragung von Zellulosescheibe. A. Schema, das die Übertragung von Platten auf Agarplatten darstellt, die von Sporen bedeckt sind, und Plattenübertragung auf die Oberfläche auf Agarplatten, die Antimykotika enthalten B. Schema, das agar Transfer von Bereichen unter Zelluloseplatten darstellt, gefolgt von Inkubation und Restwachstumsmessung. C. Repräsentatives Bild des radialen Wachstums des Restmyzels nach Übertragung von Flächen unter Zellulosescheiben. D. Radiale Wachstumsmessung des Restmyzels. E. Wirkung von Thymus vulgaris ätherisches Öl auf das Wachstum von Myzel aus Zellulosescheibe oder Agar-Stecker übertragen (N=2, mittels ± SD) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3:Vergleich der antimykotischen Aktivitäten mit der Dampfphase und Kontakthemmung soniert auf Sporen, frühe Hyphen und Myzel. A. Repräsentative Bilder von Trichoderma Sporen, frühe Hyphen (17 h Wachstum), und Myzel (24 h Wachstum). Trichoderma Wachstumshemmung durch Carbendazim (B), Thymus vulgaris ätherisches Öl (C) und Knoblauchpulver (D). (N=2, Mittelwert ± SD) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Repräsentative Bilder der antimykotischen Aktivität von Knoblauch auf Agarplatten in Kontakt- (A) oder Dampfphasen (B) Inhibitionstests Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Der hier vorgestellte Ansatz ermöglicht die Bewertung der antimykotischen Eigenschaften von minimal verarbeiteten pflanzlichen Produkten. In diesem Protokoll wird eine homogene Verteilung der Sporen auf der Agaroberfläche mit 2 mm Glasperlen erreicht. Dieser Schritt erfordert Handhabung fähigkeiten, um richtig die Perlen zu verteilen und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, letztlich ermöglicht den Vergleich von antimykotischen Wirkungen in verschiedenen Stadien des Pilzwachstums. Wir fanden heraus, dass 5 mm Glasperlen oder übermäßige Rotation während der Homogenisierung während der Streuung einen variablen Wachstumsdurchmesser verursachen können. Daher empfehlen wir schulungen, um die Sporenverteilung vor dem Experimentieren zu meistern. Darüber hinaus muss bei der Prüfung von Pflanzenpulvern auf eine homogene Dispersion des Erzeugnisses in das Agarmedium geachtet werden. Um zu verhindern, dass sich das Pulver an der Unterseite der Platte absetzt, muss das Produkt in Agarmedium gemischt werden, wenn die Temperatur des geschmolzenen Mediums 45 °C erreicht (bei Raumtemperatur 24 °C). Diese Temperatur muss entsprechend der lokalen Raumtemperatur angepasst werden, um Sedimentation zu vermeiden.

Während die Methode, die wir hier beschreiben, wertvolle Erkenntnisse liefern kann, müssen einige Nachteile berücksichtigt werden. Diese Methode ermöglicht genaue und nebeneinander anstehende Vergleiche in einem einzigen Versuchsaufbau auf Kosten einer erheblichen Vorbereitungszeit, da die Anzahl der zu erstellenden Agarplatten je nach den zu beantwortenden Fragen beträchtlich sein kann. Darüber hinaus ist dieser Assay ein mittelgroßer Assay, der für 5 cm Petrischalen entwickelt wurde. Daher kann die Menge der Wirkstoffe, die erforderlich sind, um alle Aspekte zu testen, erheblich sein. Das bedeutet, dass seltene Substanzen möglicherweise keine geeigneten Testkandidaten für dieses Protokoll sind. Eine Verkleinerung des Assays kann mit kleineren Petri-Schalen und der Verkleinerung der Stecker in Betracht gezogen werden. Dies könnte mit dem hier beschriebenen Benchmarking-Protokoll unter besonderer Berücksichtigung der Agar-Plug-Extraktion getestet werden, was schwierig sein könnte. Die Genauigkeit von Radialwachstumsmessungen kann in diesem kleineren Maßstab reduziert werden.

Aktuelle Methoden sind geeignet, um die antimykotische Aktivität von Verbindungen in Lösung zu messen und weniger anwendbar auf die Untersuchung von Pulvern¹³. Der von uns festgelegte Ansatz ist sowohl für flüssige als auch für feste Verbindungen gut angepasst, was die Bewertung der antimykotischen Eigenschaften von minimal verarbeiteten pflanzlichen Produkten ermöglicht. Dies reduziert den Zeitaufwand für das Testen von Extrakten und reduziert Fallstricke im Zusammenhang mit Wirkstoffen mit schlechter Löslichkeit. Da einige pflanzliche Produkte aktive Moleküle enthalten, die empfindlich auf Hochtemperatur⁴³reagieren, bietet dies den Vorteil, das Risiko eines Aktivitätsverlustes solcher Verbindungen zu begrenzen. Dieser Ansatz wurde von der Agar-Diffusionsmethode und der lebensmittelvergifteten Methode^{15,16,17,18,19} angepasst, um zusätzlich den direkten Vergleich antimykogaler Aktivitäten auf verschiedenen Pilzwachstumsstadien unter Verwendung ähnlicher experimenteller Einstellungen zu ermöglichen. Der Agar-Stecker-Transfer ermöglicht eine genaue Kontrolle der Mengen von Mikroorganismen innerhalb des Assays. Dies ist ein Vorteil gegenüber der Festplattenübertragung, was zu einer Überschätzung der antimykotischen Effekte führt, die mit einer unvollständigen Übertragung von Sporen oder Hyphen verbunden sind. Während Dampfphasen-Assays im Allgemeinen nicht auf Kontaktinhibitions-Assays^{27,28,29,30,31}angewendet werden, berücksichtigt die von uns vorgeschlagene Methode die relativen Beiträge flüchtiger und nichtflüchtiger Wirkstoffe, die in komplexen Mischungen wie Pflanzenpulvern oder Extrakten enthalten sind, und ermöglicht letztlich die Bewertung antimykogaler Aktivitäten in verschiedenen Pilzwachstumsstadien.

Der Ansatz, den wir hier beschreiben, könnte besonders relevant sein, um die Notwendigkeit von Methoden zu unterstützen, die antimykotische Eigenschaften in pflanzlichen Produkten für die Biokontrolle bewerten. Die von uns vorgeschlagene quantitative Methode ermöglicht es den Betreibern, die jeweiligen Beiträge flüchtiger und nichtflüchtiger Verbindungen zur antimykotischen Aktivität eines komplexen bioaktiven Gemischs zu bestimmen. Dies liefert wertvolle Informationen, die die Wahl der Anwendungsarten für die Behandlung und die Relevanz der Durchführung der Flüssigkeitsextraktion leiten können. Anwendungen, die in einem Abstand vom zielgerichteten Phytopathogen betrachtet werden können (z. B. Aufnahme des Biokontrollprodukts in eine Verpackung) oder einen direkten Kontakt benötigen, um die Wirksamkeit des Biokontrollprodukts zu optimieren (Vernebelung auf Pflanzen oder Eintauchen von Früchten in eine Lösung des Biokontrollprodukts). Es ermöglicht auch den Vergleich der Antimykotika-Wirksamkeit in verschiedenen Pilzwachstumsstadien von der Sporenkeimung bis zum späteren Myzelwachstum, was zur Definition von Empfehlungen für die Festlegung von Kontrollschwellen führt, die erforderlich sind, um Biokontrollprodukte auf Kulturen anzuwenden. Tatsächlich kann die Definition der Wirksamkeit der Stoffe in verschiedenen Pilzstadien dazu beitragen, zu kategorisieren, ob Stoffe als präventive oder kurative Behandlungen verwendet werden können, und den Zeitplan für Pflanzenbehandlungen mit Biokontrollprodukten zu planen. Dies ist wichtig, um die Wirksamkeit der Produkte zu nutzen, wenn sie in Feld- oder Nachernteverwendet werden.

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Wir sind Frank Yates sehr dankbar für seinen wertvollen Rat. Diese Arbeit wurde von Sup'Biotech unterstützt.