Estresse crônico muda comportamento de escolha relacionado ao esforço em uma tarefa de barreira y-maze em camundongos

A tarefa da barreira do labirinto Y é um teste de comportamento que examina a motivação para gastar esforço para recompensa. Aqui, discutimos o teste de múltiplos estressores crônicos bem validados, incluindo corticosterona crônica e estresse de derrota social com esse comportamento, bem como o novo estresse crônico de derrota social não discriminatória (CNSDS), que é eficaz nas mulheres.

Transtornos de humor, incluindo transtorno depressivo grave, podem ser precipitados por estresse crônico. A tarefa de barreira do labirinto Y é um teste de escolha relacionado ao esforço que mede a motivação para gastar esforço e obter recompensa. Em camundongos, a exposição ao estresse crônico impacta significativamente a motivação para trabalhar por uma recompensa de maior valor quando uma recompensa de menor valor está livremente disponível em comparação com ratos não estressados. Aqui descrevemos o paradigma crônico da administração da corticosterona, que produz uma mudança na resposta esforçada na tarefa de barreira do labirinto Y. Na tarefa Y-maze, um braço contém 4 pelotas de alimentos, enquanto o outro braço contém apenas 2 pelotas. Depois que os ratos aprendem a selecionar o braço de alta recompensa, barreiras com altura progressivamente crescente são introduzidas no braço de alta recompensa durante várias sessões de teste. Infelizmente, a maioria dos paradigmas de estresse crônicos (incluindo corticosterona e derrota social) foram desenvolvidos em camundongos machos e são menos eficazes em camundongos fêmeas. Por isso, também discutimos o estresse crônico de derrota social não discriminatória (CNSDS), um paradigma de estresse que desenvolvemos que é eficaz tanto em camundongos masculinos quanto femininos. Repetir resultados com múltiplos estressores crônicos distintos em camundongos masculinos e femininos combinados com o aumento do uso de tarefas comportamentais translacionárias relevantes ajudará a avançar na compreensão de como o estresse crônico pode precipitar distúrbios de humor.

Transtornos de humor como depressão e ansiedade são altamente prevalentes na sociedade atual. Décadas de trabalho tem buscado continuamente tratamentos aprimorados e modelos de roedores relevantes para estudar esses transtornos complexos¹. O estresse crônico é um fator contribuinte para transtornos de humor como a depressão². Portanto, paradigmas crônicos de estresse, como o estresse de derrota social crônica (SDS) e a administração crônica de corticosterona (CORT) foram desenvolvidos em camundongos do sexo masculino e agora são amplamente utilizados para avaliar os efeitos neurobiológicos e comportamentais da exposição crônica ao estresse. Os testes comportamentais mais utilizados para avaliar os efeitos do estresse crônico incluem tarefas associadas ao comportamento de evasão, como labirinto elevado, campo aberto e alimentação suprimida por novidades, ou com eficácia antidepressivo, como teste de natação forçado. No entanto, esses comportamentos em roedores sem dúvida carecem de rosto e, mais importante, validade preditiva e relevância translacional para transtornos humanos como a depressão.

Um paradigma de estresse crônico popular, o estresse leve imprevisível crônico (CUMS), tem sido validado extensivamente usando comportamentos como a preferência de sacarose³. CUMS reduz a preferência por uma solução de sacarose de 1% em comparação com a água e é historicamente interpretado como comportamento relacionado à anedonia^4,,5. No entanto, essa redução na preferência por sacarose não é observada em humanos com transtorno depressivo maior^6,7. Além disso, a preferência por sacarose não permite o estudo da motivação de recompensa esforçada.

Recentemente, algumas pesquisas mudaram o foco para outros comportamentos associados à motivação e recompensa^8,9. Essas tarefas têm um valor translacional promissor porque avaliações de comportamento relativamente semelhantes podem ser realizadas em humanos e roedores. Aqui, descrevemos os paradigmas CORT e SDS e seus efeitos em uma tarefa comportamental de barreira y-maze que mede a motivação para exercer esforços para recompensa. Em seguida, discutimos um novo paradigma de estresse crônico que desenvolvemos, o estresse crônico de derrota social não discriminatória (CNSDS), que é eficaz tanto em camundongos masculinos quanto femininos.

A administração crônica de corticosterona (CORT) é um paradigma projetado para imitar o estresse crônico sem exposições reais de estresse. Ativação do eixo hipotálamo-pituitário-adrenal por estresse resulta na liberação endógena do cortisol esteroide adrenal em humanos^10,,11,12 e corticosterona em camundongos^13,14. A entrega de corticosterona através da água potável de camundongos machos adultos por pelo menos 4 semanas resulta em respostas comportamentais mal adaptativas em tarefas de evasão, como campo aberto, labirinto mais elevado e alimentação suprimida de novidade^{10,11,,12,,13,,14,,15,,16}. Curiosamente, o CORT também afeta o processamento de recompensas em tarefas instrumentais^16,,17,18,19. O paradigma CORT descrito aqui produz uma concentração sêmua consistente abaixo de 100 ng/mL CORT, que é mais de cinco vezes menor do que a produzida por um estressor agudo, como o nado forçado¹⁵. Portanto, é improvável que a administração crônica de CORT cause hipercortisolemia. Embora o CORT crônico só seja eficaz em camundongos machos^20,recentemente demonstramos que ele produz uma mudança robusta na resposta esforçada na tarefa de barreira^{y-maze 21}. Para nosso conhecimento, este foi um dos primeiros estudos a examinar os efeitos do estresse crônico em um comportamento de escolha relacionado ao esforço em camundongos machos²¹. Um estudo anterior demonstrou pela primeira vez o impacto do estresse de contenção aguda na tomada de decisões baseadas em esforços em ratos²². Em comportamentos de escolha relacionados ao esforço, um animal opta por exercer esforços para uma recompensa de alto valor ou aceitar uma recompensa de menor valor que esteja mais livremente disponível. Em humanos, o esforço-gasto para a tarefa de recompensas (EEfRT), é um jogo de computador desenvolvido para ser análogo a tarefas de escolha relacionadas ao esforço em camundongos²³. A depressão resulta em respostas mal adaptativas no EEfRT (menor probabilidade de escolher tarefas difíceis para recompensas de alto valor). Portanto, as tarefas de escolha relacionadas ao esforço em roedores são particularmente interessantes devido à sua relevância translacional.

O estresse de derrota social crônica (SDS) é um dos modelos de estresse pré-clínico mais utilizados em camundongos machos. É um protocolo de 10 dias onde grandes e agressivos criadores aposentados CD-1 machos atacam ratos experimentais, tipicamente C57BL/6J, em 5 min sessões diárias²⁴. Isso produz um fenótipo comportamental mal adaptável robusto em um subconjunto de camundongos experimentais. Um teste de interação social é usado para estratificar camundongos em populações resilientes ou suscetíveis ao estresse de derrota, e vários estudos têm usado essa característica única da SDS para sondar os mecanismos de circuito molecular e neural subjacentes à dependência e suscetibilidade do estresse. Aqui descrevemos os detalhes do paradigma CORT e sua implementação para a tarefa comportamental da barreira do labirinto Y. Também discutimos os efeitos da SDS na tarefa de barreira do labirinto Y. A tarefa da barreira do labirinto Y é baseada na tarefa de barreira do labirinto T, que é usada principalmente em ratos para medir a motivação para gastar esforços para recompensas altas ou baixas presentes nos dois braços do labirinto^8,,9,,25. Esta tarefa também foi implementada para estudar a resposta esforçada em camundongos administrados antagonistas de cafeína ou dopamina em camundongos²⁶. Os roedores podem gastar maior esforço escalando barreiras de altura progressivamente crescente em um braço do labirinto por um valor de recompensa mais alto, tipicamente 4 pelotas de recompensa, ou gastar significativamente menos esforço no outro braço do labirinto para receber apenas 2 pelotas de recompensa⁹. Paradigmas de derrota social de 10 dias produzem um fenótipo mal adaptável robusto em camundongos suscetíveis que dura aproximadamente 30 dias, por isso modificamos a tarefa de barreira do labirinto Y para treinar e testar animais mais rapidamente, a fim de completar todos os experimentos dentro deste prazo de 30 dias²⁴. Portanto, aqui também detalhamos um protocolo de tarefa comportamental da barreira y-maze contendo sessões de treinamento condensadas e sessões de teste de barreira única para medir a motivação para gastar esforços de recompensa em camundongos crônicos expostos ao estresse.

Infelizmente, tanto a corticosterona crônica quanto o estresse de derrota social crônica foram desenvolvidos em camundongos machos e são menos eficazes em camundongos fêmeas. Isso é altamente problemático, pois as mulheres são mais propensas do que os homens a serem diagnosticadas com transtornos de humor, como a^{depressão 1}. Adaptações inteligentes às SDS permitiram o uso em camundongos femininos, mas exigem cirurgias difíceis ou coleta de urina tediosa^26,27. Recentemente, descrevemos uma simples modificação no paradigma da SDS, chamado estresse crônico de derrota social não discriminatória (CNSDS). O CNSDS permite a estratificação suscetível e resiliente de camundongos experimentais masculinos e femininos²⁸. Tanto camundongos suscetíveis femininos quanto machos expostos ao CNSDS mostram maior evasão de braços abertos em labirinto de mais elevados e do centro em campo aberto e apresentam maior latência para comer em alimentação suprimida por novidades. O CNSDS também é mais eficiente do que outras modificações na SDS, pois ambos os sexos são combinados em sessões de derrota. Isso resulta em um aumento do rendimento de camundongos experimentais sem um aumento associado no tempo e esforço necessário para completar o protocolo. Portanto, concluímos este manuscrito com uma apresentação aprofundada deste paradigma de estresse crônico recentemente desenvolvido.

Esses experimentos foram conduzidos em conformidade com as diretrizes de cuidados com animais laboratoriais do NIH e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Rutgers.

1. Corticosterona crônica (CORT)

1. Atribua aleatoriamente ratos a grupos de tratamento. Divida aleatoriamente ratos adultos C57BL/6J em grupos de Veículo e Corticosterona (CORT).
   1. Ratos de veículos domésticos em gaiolas distintas, e camundongos CORT em outros, como seu tratamento é entregue através da garrafa de água da gaiola.
   2. Rotule cartões de água especiais para colocar na gaiola que notifica a equipe de cuidados com animais de que as garrafas de água contêm soluções necessárias para o experimento.
2. Faça uma solução de veículo dissolvendo 3.375 g de betaciclextrina em 750 mL de água da torneira em um recipiente de vidro tamanho 1 L.
   1. Encha garrafas de água da gaiola do veículo com esta solução. Certifique-se de que a garrafa não vaze para medir o consumo líquido.
   2. Rotule o recipiente e armazene à temperatura ambiente na prateleira do laboratório. Use a solução do veículo para encher garrafas de gaiola por cerca de 1 semana.
   3. Refil garrafas de veículos ao longo da semana. Reabastecer garrafas de gaiola 1x-2x durante a semana, conforme necessário. Mude para uma garrafa fresca 1x por semana, seja no início ou no final da semana.
      NOTA: Após uma semana, a beta-ciclodextrina começará a revestir o interior da garrafa de água e torna a solução turva.
   4. Monitore a quantidade de líquido consumida duas vezes por semana e regissão. Pese cada garrafa e registro, cuidado para não derramar nenhum líquido. Reabasteir e devolver cada garrafa.
      NOTA: Uma gaiola de 5 ratos beberá 80-120 mL de líquido em 3-4 dias.
3. Faça a solução CORT dissolvendo primeiro 3.375 g de betacicro em 750 mL de água da torneira em um recipiente de vidro tamanho 1 L. Em seguida, adicione 26,25 mg de corticosterona.
   1. Solução Sonicate CORT para dissolver CORT na água. Coloque o recipiente em um banho de água ultrassônico. Sonicato a 40 kHz por aproximadamente 30 min ou até que a corticosterona seja dissolvida e o líquido pareça claro.
      NOTA: Homogeneizadores ultrassônicos (estilo ponta) também são eficazes para dissolver o CORT.
   2. Encha garrafas de água para todas as gaiolas CORT com solução. Rotular o recipiente e armazenar à temperatura ambiente na prateleira do laboratório. A solução CORT pode ser usada para encher garrafas de gaiola por cerca de 1 semana.
      NOTA: Use garrafas de água de vidro marrom ou garrafas opacas de plástico, pois o CORT é sensível à luz.
   3. Monitore a quantidade de líquido consumida duas vezes por semana e regise. Pese todos os camundongos do veículo e CORT semanalmente para comparar o líquido consumido com o peso dos ratos dentro de cada gaiola.
   4. Para determinar o volume de líquido consumido (mL/g/dia), use a seguinte equação:
      (Gaiola de volume bebido nos últimos 3-4 dias) / (Peso corporal médio de ratos na gaiola) X número de dias desde que a garrafa de Veículo ou CORT foi reenchida)
      NOTA: Uma gaiola média de camundongos C57BL/6J masculinos adultos consumirá em média 0,25 – 0,30 mg/g/dia, que normalmente permanece consistente através de períodos de tempo ad libitum e sem alimentos. Essas concentrações resultam em doses aproximadas de 24 mg/kg/dia beta-ciclodextrina, e 9,5 mg/kg/dia CORT^15,16.
4. Estresse de derrota social (SDS)
   1. Use protocolos de estresse de derrota social padrão, conforme descrito em profundidade em outros lugares^24,29.
5. Tarefa de barreira y-maze
   1. Privação de alimentos para a tarefa de barreira do labirinto Y
      1. No dia seguinte à conclusão do teste de interação social, pesam todos os ratos Control e Experimental. Este será o peso corporal deles.
         NOTA: Aqui, usamos "Controle" e "Experimental" para se referir tanto ao Controle SDS quanto aos ratos experimentais SDS, bem como aos camundongos administrados por Veículos e CORT nos respectivos paradigmas SDS e CORT.
      2. Para privar os ratos, remova apenas a comida de laboratório do lado C57BL/6J de cada gaiola.
      3. Pesar todos os camundongos, bem como a quantidade de chow de laboratório que será dada diariamente, a fim de manter adequadamente o peso corporal em aproximadamente 90% do peso de alimentação livre durante os testes.
         NOTA: A quantidade de alimento entregue na gaiola doméstica de cada rato ou camundongo dependerá do peso corporal flutuante e da quantidade de pelotas de recompensa consumidas em cada dia de treinamento ou teste no labirinto Y.
      4. Estabeleça familiaridade com as pelotas de recompensa. Despeje uma pequena colher de 20 mg de pelotas de alimentos à base de grãos (Bio-Serv) na gaiola doméstica. Isso estabelecerá familiarmente com as pelotas e motivará os ratos a consumi-las no labirinto Y em sessões de treinamento habituais e iniciais.
6. Aparelho y-maze
   1. Construa uma estrutura y-maze de plexiglas brancos opacos de 3/16", com três braços medindo 26 cm de comprimento, 20 cm de altura e 7 cm de largura.
   2. Use divisores que deslizam entre ranhuras no labirinto Y para permitir que um pesquisador feche a caixa de partida onde os ratos são inicialmente colocados, ou para conter o rato em ambos os braços uma vez que eles tenham selecionado e introduzido os braços esquerdo ou direito do labirinto Y.
   3. Crie múltiplas barreiras de labirinto Y de 10, 15 e 20 cm de altura a partir da malha de arame para o lado vertical, e com plexiglas em aproximadamente um ângulo de 45° no lado angular traseiro. Isso permite que os ratos C57BL/6J agarrem e subam o lado vertical da malha de arame de cada barreira e, em seguida, atravessem o lado angular plexiglas da barreira.
      1. Adicione passos finos no lado angular para permitir maior tração.
7. Habituação y-maze
   1. Habituar todos os ratos de controle e experimentais ao aparelho Y-maze.
      1. No dia seguinte à privação alimentar, coloque um grande número de pelotas de alimentos à base de grãos de 20 mg (por exemplo, Bio-Serv) na tampa de um tubo de centrífuga de 50 mL e coloque nas extremidades de cada braço do labirinto Y. Essas tampas servem como pequenos recipientes de comida para os ratos, e os ratos aprenderão prontamente a comer as pelotas de comida.
      2. Coloque cada mouse na caixa inicial do labirinto Y com o divisor de caixa de partida no lugar.
      3. Após alguns segundos, remova o divisor, permitindo que cada rato explore o labirinto Y por 15 minutos. Esse tempo permite que o rato explore adequadamente todos os braços do labirinto e estabeleça familiaridade com o aparelho.
         NOTA: Alguns camundongos podem não consumir pelotas de alimentos neste primeiro dia de habitação.
   2. No dia seguinte, complete uma segunda habituação de 15 min Y-maze usando um procedimento idêntico.
      1. Note todos os ratos que não tenham comido nenhuma pelota. Para esses ratos, despeje outra pequena colher cheia de pelotas em suas gaiolas.
8. Treinamento de escolha forçada do labirinto y
   1. Designe o braço de alta recompensa (RH) e baixa recompensa (LR) para cada mouse.
      1. Atribua aleatoriamente ratos em ambos os grupos Control e Experimental o braço esquerdo como o braço de alta recompensa (RH) e o braço direito como o braço de baixa recompensa (LR), ou vice-versa. Assim, 4 pelotas estarão disponíveis em cada ensaio na esquerda, braço de RH e 2 pelotas disponíveis na direita, braço LR ou oposto.
      2. Contrabalancear estes braços LR e HR designados tanto no grupo Controle quanto no Experimental, de modo que aproximadamente metade de cada grupo tinha o braço esquerdo como braço de HR, e metade tinha o braço direito como braço de RH.
   2. Julgamentos de escolha forçada
      1. Após os 2 dias de habituação do labirinto Y, os ratos começam 3 dias de 10 testes de treinamento de escolha forçada.
      2. Para cada teste de escolha forçada, coloque o mouse na caixa inicial e, em seguida, remova o divisor, permitindo que o mouse 60 s entre no braço esquerdo ou direito e consuma as pelotas disponíveis. Para cada tentativa de escolha forçada, bloqueie o braço oposto com o divisor, forçando o mouse a selecionar o outro braço. Para um teste de escolha forçada por RH, bloqueie o acesso ao braço LR, ou vice-versa.
      3. Remova o mouse após o ensaio e reponha as respectivas pelotas que foram comidas.
      4. Testes alternativos de escolha forçada para cada mouse em cada dia de treinamento, de modo que os ratos completem 5 testes de escolha forçada de 5 HR e 5 LR.
         NOTA: Os testes de escolha forçada treinam os ratos para associar um braço com a recompensa maior e o outro com a recompensa mais baixa.
      5. Coloque o mouse de volta em sua gaiola doméstica e, em seguida, execute não mais do que 3-5 ratos subsequentes, a fim de manter um intervalo intertrial de 5 minutos para cada rato.
9. Treinamento de livre escolha do labirinto y
   1. Testes de escolha gratuita
      1. Inicie cada sessão de livre escolha com um teste de escolha forçada de braço HR e LR. Assim, os ratos terão experimentado ser forçados a cada braço antes de iniciar 10 testes de livre escolha.
      2. Coloque cada mouse na caixa inicial e remova o divisor. Uma vez que o mouse tenha selecionado um braço e atravessado até o final onde o copo contendo as pelotas está localizado, coloque o divisor de braço no lugar desse lado, travando no mouse até que ele tenha consumido as pelotas.
      3. Remova o mouse de volta para sua gaiola doméstica e execute os subsequentes 3-5 ratos usados nesse ciclo para permitir um intervalo inter-ensaio de 5 minutos.
   2. Regissuas informações: latência para escolher um braço, seleção de braço e latência para alcançar o copo de pelotas.
      1. Regisso que arma o mouse entra e atravessa totalmente até o copo de pelota. Regiss também a latência para selecionar esse braço e alcançar o copo de pelotas.
      2. Considere qualquer ensaio em que um mouse não selecione um braço ou não consuma todas as 4 ou 2 pelotas como um teste omitido.
   3. Critério de livre escolha de 70%
      1. Registo qual braço é selecionado para todos os 10 testes de livre escolha diariamente.
      2. Uma vez que um mouse tenha selecionado o braço de RH em 7 dos 10 testes em um dia de treinamento de livre escolha (critério de 70%) mova o mouse para sessões de teste de barreira.
         NOTA: Continue o treinamento de livre escolha até que todos os camundongos atinjam o critério de braço de 70% de RH para garantir tanto a discriminação adequada dos braços de RH quanto LR e que os camundongos demonstrem igual preferência pelo braço de RH.
10. Teste de barreira de labirinto y
    1. Sessão de teste de barreira de 10 cm
       1. Coloque a barreira de 10 cm no meio do braço hr no labirinto Y.
       2. Comece com vários testes de escolha forçada para ambos os braços. Camundongos resistentes a escalar a barreira podem ser solicitados com uma peça plexiglas longa e fina.
          NOTA: Por experiência, recomendamos pelo menos 2 testes de escolha forçada para braços de RH e LR no início de cada sessão em uma nova altura de barreira. Recomendamos a gravação de ensaios onde é necessário solicitar que o mouse suba sobre a barreira se for necessário. Os ratos geralmente aprendem a escalar a barreira de 10 cm, que não é tão alta que eles não podem ficar e ver sobre ela, dentro de 1-2 ensaios. A barreira terá que ser colocada do outro lado para ratos com o braço oposto como o braço de RH designado.
       3. Coloque cada mouse na caixa inicial, remova o divisor e deixe que o mouse atravesse o labirinto e selecione um braço para 10 testes de livre escolha contendo a barreira de 10 cm no braço DE RH.
       4. Se o mouse escolher o lado DO RH, ele subirá sobre a barreira a fim de obter a maior recompensa, as 4 pelotas. Caso contrário, ele selecionará o braço LR e simplesmente atravessará o chão do labirinto para a menor recompensa, 2 pelotas.
       5. Registo o braço selecionado e a latência para selecionar um braço e alcançar o copo de pelotas para todos os ensaios. Da mesma forma, gire 4-6 ratos totais por ciclo, para manter um intervalo inter-ensaio de 5 minutos.
          NOTA: Pulverize 70% de etanol no labirinto Y e limpe consistentemente e entre cada rato.
    2. Sessão de teste de barreira de 15 cm
       1. No dia seguinte complete todas as etapas listadas como acima (etapa 1.10.1), mas com a barreira de 15 cm de altura no braço de RH.
    3. Sessão de teste de barreira de 20 cm
       1. No dia seguinte complete todas as etapas listadas como acima (etapa 1.10.1), mas com a barreira de 20 cm de altura no braço de RH.
          NOTA: Pela experiência, pela altura da barreira de 20 cm a maioria dos camundongos SDS ou CORT Experimental (e até mesmo vários ratos de controle) mudará suas respostas para o braço LR, pois eles não estão motivados o suficiente para subir sobre a barreira alta de 20 cm. Além disso, os adaptadores Plexiglas podem precisar ser usados para evitar que os ratos subam do topo desta barreira para as bordas das paredes do labirinto Y. Não recomendamos a construção de um labirinto Y mais alto, pois torna-se mais difícil para o experimentador reabastecer as pelotas em cada xícara e remover os ratos após cada ensaio.
    4. Sessão de teste de discriminação de recompensa
       1. Para garantir que tanto os ratos controlam quanto os experimentais expuem alavancas adequadas e similares de discriminação por recompensa, realize uma sessão de teste de discriminação.
       2. Siga todos os passos acima (passo 1.10.1), mas coloque uma barreira de 10 cm no braço LR. Agora, ambos os braços contêm barreiras de 10 cm, e os ratos precisarão subir para obter a recompensa de 4 ou 2 pelotas.
       3. Registo de latência e seleção de braço para todos os 10 ensaios.
          NOTA: Como os ratos terão que gastar o mesmo esforço para obter qualquer recompensa, os ratos devem selecionar o braço de RH na maioria dos ensaios. Para examinar latências para selecionar o braço DE RH e LR, calcule uma latência média do braço de RH e uma latência média do braço LR para cada mouse individual. Em seguida, compare a latência para selecionar ambos os braços usando um ANOVA misto de duas vias, com SDS (Control, SDS-Susceptible, SDS-Resilient) como o fator entre os sujeitos, e braço (braço de RH, braço LR) como o fator dentro dos sujeitos.

2. Estresse crônico de derrota social não discriminatória (CNSDS)

1. Tela para comportamento agressivo em ratos CD-1
   1. Coloque um rato C57BL/6J masculino e uma fêmea na gaiola de cada CD-1 para 180 s ou até que o CD-1 ataque ambos os ratos. Estes camundongos C57BL6/J não precisam ser ingênuos, e não serão usados em outros experimentos. Durante esta fase de triagem de agressores, não cohouse ratos C57BL/6J com ratos CD-1.
      1. Registo de latência para atacar ambos os mouses C57BL/6J para cada CD-1.
      2. Selecione todos os agressores de CD-1 que atacam camundongos C57BL/6J masculinos e femininos dentro de 60 segundos em sessões consecutivas de um total de 3 sessões de triagem. Outros podem ser usados para co-habitação em gaiolas domésticas.
         NOTA: Uma ressalva importante da derrota social é a presença de ferimentos como consequência da agressão física. Cada camundongo na triagem e fases experimentais deve ser verificado para feridas e tratado com desinfetante cloro-hexano se pequenas lesões cutâneas presentes. Qualquer rato com uma ferida maior que 1 cm deve ser removido do experimento.
2. Designe ratos para controlar e grupos experimentais.
   1. Reúna todos os camundongos C57BL/6J adultos ingênuos, bem como criadores de CD-1 masculinos aposentados, bem como machos CD-1 para serem usados em co-habitação.
      1. Atribuem aleatoriamente camundongos C57BL/6J adultos para controlar ou condições experimentais. Cada homem e mulher serão emparelhados para todas as sessões de derrota social no grupo EXPERIMENTAL CNSDS. Machos e fêmeas do grupo controle CNSDS irão girar todos os dias.
      2. Designar machos CD-1 para serem usados em sessões de derrota social ou ser co-alojados com os machos e fêmeas experimentais após cada sessão, que se alternarão diariamente para cada par de camundongos C57BL/6J masculinos e femininos.
3. Estresse crônico de derrota social não discriminatória (CNSDS)
   1. Traga todos os ratos para a sala de derrota social dedicada, incluindo todos os machos CD-1, os ratos C57BL/6J do CONTROLE CNSDS, e os ratos C57BL/6J experimentais do CNSDS.
      1. Alinhe 4-6 gaiolas de machos CD-1 com C57BL/6J masculinos e fêmeas com gaiolas CD-1 na frente e gaiolas C57BL/6J atrás.
      2. Indique com etiquetas de identificação da gaiola qual mouse está sendo atacado e, em seguida, co-alojado com o CD-1 para garantir a organização de todos os ratos.
         NOTA: Após a inicialização de experimentos no primeiro dia, os ratos podem ser girados para as 9 sessões restantes de derrota, de modo que cada par masculino e feminino C57BL/6J são girados uma gaiola à esquerda para cada sessão. Isso permite uma nova interação com novos CD-1s em cada sessão.
   2. Procedimento de Grupo Experimental do CNSDS
      1. Coloque um macho adulto e um rato adulto C57BL/6J na gaiola de cada homem agressor do CD-1 para uma sessão de derrota social de 5 minutos.
      2. Latência de ataque recorde e frequência de ataque para camundongos C57BL/6J experimentais masculinos e femininos.
      3. Após 5 minutos, remova o rato C57BL/6J masculino e coloque na gaiola do macho CD-1 co-alojado, separado por uma barreira plexiglas clara e perfurada. Separado atacando CD-1 e fêmea C57BL/6J mouse com uma barreira plexiglas clara e perfurada semelhante. Alternar se o rato C57BL/6J masculino ou feminino está alojado com o CD-1 agressor todos os dias.
         NOTA: Após cada interação diária de 5 minutos cada rato será avaliado para lesões e feridas tratadas se menos de 1cm. Qualquer ferida maior que 1 cm resultará na remoção e eutanásia imediata do rato. Assim, tanto os camundongos experimentais masculinos quanto femininos são co-alojados com o agressor do CD-1 por 5 dias e com o novo CD-1 não utilizado na sessão de ataque pelos 5 dias restantes. Barreiras plexiglas claras e perfuradas impedem a interação física, mas permitem o contato sensorial com o agressor do CD-1 nas 24 horas entre as sessões. A lavagem vaginal pode ser realizada em todos os camundongos fêmeas aproximadamente 30 minutos após a derrota todos os dias, como descrito anteriormente²⁸.
   3. Procedimento do grupo de controle do CNSDS
      1. Coloque uma mulher de controle na gaiola doméstica de um rato Controlador C57BL/6J masculino.
      2. Após 5 minutos, separe os ratos e coloque um divisor plexiglas claro e perfurado entre os ratos.
      3. Volte os ratos para a sala da colônia e coloque em uma prateleira separada como gaiolas experimentais CNSDS. Na sala da colônia, designamos prateleiras onde ratos estressados são alojados separadamente de outros ratos na sala da colônia. Além disso, os efeitos podem ser vistos nos camundongos não estressados se testemunharem a agressão ocorrendo, como é visto nos paradigmas de derrota social^{vicário 30}
      4. Observe qualquer comportamento de ataque ou montagem durante cada interação controle.
   4. O controle de camundongos machos e fêmeas será introduzido a um novo conespecífico nos dias subsequentes, como é feito nos tradicionais grupos de Controle de Estresse de Derrota Social. Complete 10 dias consecutivos de Controle do CNSDS e Sessões Experimentais.
      1. Após concluir a^10ª e última sessão de Controle ou CNSDS Experimental, co-abrigar todos os ratos e manter esta co-habitação durante todos os testes comportamentais. Cada gaiola será composta por 2 ratos separados em ambos os lados do divisor de plexiglass para permitir a exposição sensorial. Os ratos de controle são alojados com outros ratos de controle de sexo opostos, enquanto ratos experimentais são co-alojados com ratos experimentais de sexo oposto.
      2. Cada controlador C57BL/6J feminino é co-alojado com o controle C57BL/6J masculino^th com o qual interagiu na 10ª sessão, com um divisor claro e plexiglass colocado na gaiola para separar os dois ratos.
      3. Aproximadamente 24 horas após a sessão final de derrota executam um teste padrão de interação social para determinar se o CNSDS reduz o comportamento social com um novo mouse CD-1 em comparação com o controle, e para estratificar ratos "resilientes" ou "suscetíveis" ao estresse^24,,29.
   5. Teste o Controle do CNSDS e camundongos masculinos e femininos experimentais em outros comportamentos, incluindo a tarefa de barreira do labirinto Y, e estratifique o grupo CNSDS em grupos resilientes ao CNSDS e cnsds-suscetíveis.
4. Teste de interação social
   1. Configuração inicial para teste de interação social
      1. 24 horas após a última sessão de derrota do CNSDS, realize um teste de interação social.
      2. Leve todos os ratos de Controle e Experimentais, bem como um novo CD-1 masculino não usado no paradigma CNSDS, para uma sala comportamental separada para executar um Teste de Interação Social.
      3. Configure uma câmara de campo aberto padrão (75 cm x 75 cm) sob uma câmera de gravação conectada ao software de rastreamento comportamental (por exemplo, EthoVision) em execução em um computador dedicado.
      4. Configure um novo experimento com uma zona de interação social de 24 cm x 24 cm em torno de um recipiente de interação (pequeno recipiente plexiglas perfurado medindo aproximadamente 10 cm x 10 cm x 10 cm) que abrigará o novo CD-1 ao longo de uma parede do campo aberto, no segundo de 2 ensaios consecutivos de 2,5 min. Assim, uma zona de interação de 7 cm de largura circunda o contêiner que abriga o novo mouse CD-1.
   2. Executando um mouse no Teste de Interação Social
      1. Coloque cada mouse em um canto distante do campo aberto para um teste de 2,5 minutos sem o presente de CD-1 e inicie o programa de software de gravação.
         NOTA: Tenha em mente que o recipiente de interação deve ser colocado no centro de uma parede do campo aberto e não conter nenhum mouse CD-1 para este primeiro teste.
      2. Depois de 2,5 min, remova o rato de volta para sua gaiola. Limpe o campo aberto com 70% de etanol.
      3. Coloque o novo CD-1 masculino em um segundo cubo plexiglas perfurado ao longo do meio de uma parede do campo aberto.
      4. Novamente, coloque o mouse no canto do campo aberto para um segundo teste de 2,5 min, agora com o CD-1 presente, e inicie o programa de software de gravação.
      5. Remova o mouse e coloque-o de volta em sua gaiola. Remova o CD-1 e coloque-o de volta em sua gaiola doméstica. Limpe o campo aberto com 70% de etanol.
   3. Execute o controle de CNSDS restante e ratos experimentais e calcule a Razão de Interação.
      1. Repita este procedimento com todos os outros camundongos, a fim de quantificar o tempo gasto na zona de interação tanto no teste 1 quanto no teste 2 para cada controle de CNSDS e mouse experimental.
      2. Para calcular uma razão de interação, compare o tempo gasto na zona de interação social no ensaio 2 (CD-1 presente) versus no ensaio 1 (CD-1 ausente), utilizando a seguinte equação:
         Razão de interação = (fuso de interação no ensaio 2)/(tempo no fuso de interação no ensaio 1)
   4. Estratifique os ratos como "Resilientes ao CNSDS" ou "suscetíveis ao CNSDS". Camundongos resistentes têm uma razão de interação de > 1.0, enquanto os ratos suscetíveis têm uma razão de interação de <=1.0.
      1. Em medidas comportamentais subsequentes, como a tarefa de barreira do labirinto Y ou outros testes de comportamento, sub-divida os ratos experimentais do CNSDS nesses fenótipos resistentes ao CNSDS e ao CNSDS.
      2. Assim, para as fêmeas, as ANOVAs unidirecionais podem ser conduzidas entre o Controle cnsds, os grupos Experimental-Resiliente CNSDS e CNSDS Experimental-Suscetível, com comparações pós-hoc para determinar diferenças entre grupos quando apropriado.
      3. Para comparações de diferença de sexo, realize ANOVAs bidirecionais com CNSDS (Controle, Resiliente, Suscetível) e Sexo (Masculino, Feminino) como fatores entre os sujeitos. Use comparações pós-hoc quando apropriado.

O CORT crônico foi administrado por 4 semanas seguido de treinamento e teste de barreira y-maze(Figura 1A). Em uma coorte separada, o paradigma de 10 dias da SDS foi seguido da mesma forma por treinamento e testes na tarefa de barreira do labirinto Y(Figura 1C),para determinar o efeito desses paradigmas de estresse crônico no comportamento de escolha relacionado ao esforço em camundongos machos. CORT crônico e SDS reduziram o peso médio do corpo em comparação com camundongos veiculares e camundongos de controle de SDS, conforme determinado por t-testes(Tabela 1). Esses camundongos também consumiram menos comida média de laboratório de gaiola doméstica durante os testes(Tabela 1).

Na coorte CORT, uma ANOVA mista com CORT como fator entre os sujeitos e semana como fator de subsetos indicam que os camundongos administrados por veículos e CORT consumiram um volume semelhante de líquido ao longo de 4 semanas de tratamento mais 3 semanas de testes de comportamento (7 semanas no total) (Figura 1B). Na coorte da SDS, os homens de Controle e Experimental completaram 10 dias do protocolo SDS, e foram avaliados para suscetibilidade ao protocolo SDS por meio de um teste de interação social onde o tempo gasto interagindo com um novo CD-1 masculino foi comparado ao tempo na zona de interação sem o CD-1 presente²⁴. A ANOVA unidirecional indicou que a SDS produz um fenótipo mal adaptável em camundongos suscetíveis (60%), em comparação com ambos os camundongos resistentes (40%) ou Controlar camundongos não expostos a SDS (Figura 1D). Especificamente, os ratos suscetíveis ao SDS exibem uma redução no tempo gasto na zona de interação contendo um novo mouse CD-1, quando comparado com ratos SDS-Resiliente e Controle.

Em seguida, treinamos as coortes CORT (Camundongos Experimentais e de Controle) e SDS (Suscetível e Controle) na tarefa de barreira do labirinto Y(Figura 2A). Medimos o número de ensaios que os ratos control e experimental gastariam esforço para escalar uma barreira para uma recompensa de 4 pelotas, em vez de escolher o outro braço do labirinto Y que continha apenas 2 pelotas, mas não apresentava nenhuma barreira para subir. Para a SDS, uma ANOVA mista bidirecional, com SDS (Control, SDS-Susceptible, SDS-Resilient) como fator entre os sujeitos e braço (braço de RH, braço LR) como o fator dentro dos sujeitos foi usado para examinar a resposta esforçada no labirinto Y. Para o CORT crônico, uma ANOVA mista bidirecional, com administração CORT (Vehicle, CORT) como fator entre os sujeitos, e braço (RH, braço, braço LR) como fator dentro dos sujeitos. Tanto o CORT crônico quanto o SDS produziram uma mudança na resposta esforçada quando a altura da barreira aumentou para 15 cm e para 20 cm (Figura 2B e Figura 2C). Nenhum dos dois mudou de resposta quando apenas uma barreira de 10 cm estava no braço de RH. Além disso, em uma sessão de discriminação de recompensa após o teste, todos os camundongos responderam da mesma forma para o braço de RH quando uma barreira de 10 cm foi colocada em ambos os braços de RH e LR. Por fim, as ANOVAs bidireis com CORT ou SDS como fator entre os sujeitos e braço de RH ou LR como fator de dentro dos sujeitos revelam que a latência do braço de RH e LR com a barreira de 15 cm não foi impactada pela administração do CORT, e foi semelhante para ambos os grupos com braços de LR e RH(Figura 3). Assim, cort crônico e SDS robustamente mudam de esforço respondendo na tarefa de barreira do labirinto Y em camundongos machos.

É importante ressaltar que, se o CORT crônico ou a SDS prejudicam o aprendizado da tarefa de barreira do labirinto Y(Figura 4),esses camundongos podem não atingir o critério em sessões de treinamento de livre escolha, impactando a interpretação subsequente dos resultados da barreira. Portanto, mostramos resultados representativos potencialmente negativos mostrando essa diferença, avaliados utilizando amostras independentes separadas t-testes(Figura 4).

O procedimento cnsds produz um fenótipo mal adaptável robusto em camundongos suscetíveis c57BL/6J masculino e feminino(Figura 5A). Uma tarefa de interação social é usada para estratificar camundongos em resilientes (38,3%) e suscetíveis (61,7%) populações (Figura 5B), que podem ser ainda subdivididas por sexo (masculino: 43,3% resilientes, 56,7% suscetíveis; mulheres: 36,7% resilientes, 63,3% suscetíveis), utilizando ANOVAs unidirecionais entre o Controle de CNSDS, CNSDS Experimental-Resiliente e CNSDS Experimental-Suscetível. Embora este paradigma modificado produz efeitos mal-dados semelhantes aos SDS em comportamentos de evasão^28,ele ainda não foi implementado em combinação com testes comportamentais relacionados à recompensa e motivação, como a tarefa de barreira do labirinto Y. É essencial que estudos futuros avaliem os efeitos de estressores como o CNSDS sobre comportamentos translacionalmente relevantes, como a tarefa de barreira do labirinto Y em machos e fêmeas.

Tabela 1: Peso corporal e quantidade de alimentos fornecidos diariamente. Os camundongos administrados por veículos e CORT, bem como os ratos control e SDS foram pesados semanalmente e a quantidade de alimentos dada foi registrada. O peso corporal médio (g) em todos os testes do labirinto Y e os alimentos médios diários (g) fornecidos são indicados.

Figura 1: A SDS induz um fenótipo depressivo caracterizado por menor interação social.
(A) Esquema representando a linha do tempo para os protocolos de barreira CORT e Y-maze. (B) Dados representativos que mostram o volume consumido (mL/g/dia) em camundongos administrados por Veículos e CORT. (C) Esquema representando a linha do tempo para os protocolos de barreira SDS e Y-maze. (D) Em um teste representativo de interação social, os ratos suscetíveis de SDS exibem tempo reduzido gasto interagindo com um novo mouse em comparação com ratos SDS Resilient ou Control. As barras são médias ± SEM. *p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: CORT e SDS mudam de esforço respondendo em uma tarefa de barreira de labirinto Y.
(A) Linha do tempo da tarefa de barreira y-maze para CORT e SDS. (B) Cort crônico reduz a seleção de braço de RH a 15cm e 20cm de altura de barreira. Este número foi modificado a partir de Dieterich et al. 2020²¹. (C) Resultados representativos demonstrando que os camundongos suscetíveis à SDS reduzem a seleção de braço de RH a 15 cm e 20 cm de altura de barreira, em comparação com os camundongos Control ou SDS-Resilientes. As barras são médias ± SEM. *p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: A latência do labirinto y não é impactada pelo CORT crônico.
O CORT crônico não afeta a latência para selecionar braços LR ou HR no labirinto Y. Além disso, tanto os mouses do Veículo quanto do CORT selecionam o braço LR ou HR com latências semelhantes. Este número é reimpresso de Dieterich et al. 2020²¹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: CorT crônico e SDS prejudica a seleção de braço de RH de livre escolha.
Resultados representativos mostrando que os camundongos expostos tanto cort crônico ou SDS reduzem o número de seleções de braço de alta recompensa em comparação com os ratos de controle em treinamento de livre escolha, complicando a interpretação dos resultados e/ou atrasando ou impedindo a transição para testes de barreira. As barras são médias ± SEM. *p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Estratificação de camundongos machos e fêmeas expostos ao CNSDS em populações suscetíveis e resilientes.
(A) Esquema do paradigma experimental e de controle do CNSDS. Este número é reimpresso de Yohn et al. 2019²⁸. (B) O CNSDS produz uma estratificação robusta dos camundongos CNSDS-Resiliente (RES) e CNSDS-Suscetíveis (SUS). Este número é reimpresso de Yohn et al. 2019²⁸. As barras são médias ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Enquanto o paradigma cort crônico fornece uma dose constante de CORT na água potável, pela experiência pode haver alguma variabilidade na quantidade consumida pelos camundongos. Além disso, o consumo só pode ser avaliado para a gaiola total, e uma média tomada com base no número de ratos na gaiola. Além disso, o derramamento pode ocorrer ao pesar as garrafas, transferir os ratos para testes de comportamento ou quando se muda para uma gaiola fresca. No entanto, o rastreamento do consumo de veículos e CORT ainda é viável e preciso ao longo de semanas de tratamento e testes de comportamento. Recomendamos fortemente a mudança para uma garrafa fresca contendo veículo ou CORT uma vez por semana, bem como manter horários definidos para pesar e trocar garrafas. Por exemplo, mudar para garrafas frescas ao pesar e reabastecendo as garrafas pode ser feito às segundas-feiras, e depois pesar e reabastecendo todas as garrafas feitas novamente na quinta ou sexta-feira. Da mesma forma, é melhor pesar todos os ratos ao mesmo tempo em um dia designado a cada semana. Por fim, é importante ressaltar que este paradigma CORT reduz a produção endógena de corticosterona pelo eixo HPA. Assim, os camundongos devem permanecer no CORT durante os testes comportamentais até serem sacrificados. Se os ratos forem retirados do CORT, então eles podem sofrer uma crise addisoniana de insuficiência adrenal aguda. Procedimentos alternativos têm utilizado uma exposição de 2-3 semanas DE CORT, seguido por desmame progressivo fora do CORT e, em seguida, uma janela de teste de comportamento de aproximadamente 3-4 semanas à medida que os níveis de CORT endógenos voltam ao normal^17,19.

Na tarefa de barreira do labirinto Y, é fundamental iniciar a habituação e o treinamento do labirinto imediatamente após o protocolo SDS(Figura 2A). Uma ressalva potencial desta linha do tempo experimental é que os ratos são treinados após a manipulação e não de antemão, onde eles poderiam ser divididos igualmente com base no desempenho de treinamento. No entanto, em nossa experiência de treinamento antes versus após a administração do CORT não impacta significativamente o comportamento instrumental¹⁶. Todos os camundongos são treinados minuciosamente e alcançam critério (>70% de seleção de braço de RH em sessões de livre escolha) antes de avançar para testes de barreira. Os ratos devem primeiro ser devidamente habituados ao labirinto, por isso torna-se um aparelho familiar, pois descobrimos que isso ajuda na fase de treinamento subsequente. Ao treinar cada rato, é fundamental manter os braços de alta e baixa recompensa projetados para cada rato individual, para que um rato não atravesse um braço esperando 4 pelotas e encontrando 2, ou vice-versa. Recomendamos manter tanto o papel quanto as cópias digitais de grandes arquivos de dados brutos indicando os braços de alta e baixa recompensa contrabalanceados para todos os mouses Control e SDS.

Não acreditamos que haja diferença no desempenho do labirinto devido às especificações exatas da forma do labirinto (Y-maze versus T-maze), e acreditamos que os pesquisadores poderiam usar tanto em experimentos comportamentais relacionados ao esforço. Além disso, já relatamos um ligeiro aumento na seleção de braço de RH em 15 cm em comparação com 10 cm em camundongos administrados por veículos²¹. No entanto, os pesquisadores devem esperar uma seleção de braço de RH semelhante ou reduzida, uma vez que a altura da barreira aumenta acima de 15 cm, já que pelos ratos de barreira de 20 cm raramente selecionam o braço de RH²¹.

Além disso, é importante usar um spray de etanol de 70% para limpar o labirinto e remover odores residuais após cada sessão. Também recomendamos executar os ratos de forma consistente para que haja um intervalo inter-trial relativamente constante para todos os ratos. Sugerimos pedalar aproximadamente 4-6 ratos de cada vez, o que deve dar um intervalo de cerca de 5 minutos. Finalmente, na última sessão de livre escolha, e em todas as sessões de teste de barreira, é importante registrar latência para selecionar ambos os braços em todos os ensaios. Além disso, os ratos ocasionalmente conseguem saltar para o topo das paredes plexiglas, ou mais frequentemente do topo das barreiras. Recomendamos adaptadores de parede Plexiglas mais altos ao longo das laterais do labirinto, se isso ocorrer. Estas podem ser simplesmente peças retangulares de Plexiglas (largura de 20 cm, comprimento de 80 cm). Marcamos qualquer ensaio onde um rato não consegue selecionar um braço dentro de 60 segundos ou seleciona um braço, mas não come as pelotas de comida como um teste omitido. Por fim, tanto o CORT crônico quanto o SDS podem diminuir o peso corporal, o que impacta a quantidade de alimentos consumidos ao longo das semanas de teste²¹. Os pesquisadores devem pesar regularmente camundongos e ajustar a quantidade de alimentos dadas na gaiola doméstica para manter os camundongos em aproximadamente 90% de seu peso corporal de alimentação livre.

Aqui também discutimos um paradigma recentemente desenvolvido, o estresse crônico de derrota social não discriminatória (CNSDS) (Figura 5A),para induzir populações suscetíveis ao estresse e resilientes em camundongos machos e femininos(Figura 5B). O paradigma do CNSDS pode ser usado por pesquisadores pré-clínicos interessados em transtornos de estresse ou humor. No paradigma do CNSDS é vital que as fêmeas experimentais sejam atacadas pelo menos uma vez por sessão. Em quase todas as sessões de derrota social, os machos experimentais são atacados várias vezes. Cada agressor de CD-1 deve ser rigorosamente examinado com camundongos C57BL/6J masculinos e femininos antes de iniciar o protocolo CNSDS, bem como registrar todo e qualquer ataque em cada sessão. Embora descrevamos uma condição de controle sexual duplo na metodologia CNSDS onde um homem e uma mulher interagem, pode ser apropriado para alguns incluir um macho adicional para essas interações de controle, imitando assim os dois machos e uma fêmea utilizados no procedimento CNSDS. Este procedimento alternativo de controle não afeta o comportamento dos camundongos nos comportamentos de evasão²⁸. Além disso, um teste de interação social deve ser implementado 24 horas após o protocolo de derrota de 10 dias para garantir a eficácia do método e estratificar camundongos masculinos e femininos como resistentes ou suscetíveis ao CNSDS²⁴.

Uma questão ao usar a abordagem histórica de subdividir camundongos em populações resilientes e suscetíveis com base no teste de interação social é que nem todos os comportamentos de aversão podem ser medidos com precisão usando software de rastreamento de vídeo. Ratos "resilientes" com uma pontuação de interação >1 podem estar demonstrando comportamento submisso em torno do recipiente que abriga o mouse CD1³¹. É importante que o campo desenvolva um software que rastreie melhor esses microesportores. Ferramentas como a análise comportamental simples (SimBA^32),desenvolvida pelo laboratório Golden para permitir classificadores comportamentais para comportamentos sociais complexos em roedores, podem ser úteis nesse sentido.

Algumas montagems podem ocorrer durante o protocolo CNSDS. Embora não tenhamos observado nenhuma gravidez nesse paradigma, os pesquisadores devem estar cientes dessa possibilidade.

Outra limitação dos protocolos de derrota social, incluindo o CNSDS, é a janela de tempo supostamente limitada para investigar os efeitos do estresse sobre o comportamento após a conclusão das sessões de derrota social. Assim, adaptamos os protocolos de barreira de labirinto existentes para encaixar todas as sessões de habituação, treinamento e testes em um prazo de 30 dias. No entanto, isso pode acelerar o treinamento geral para alguns camundongos, que podem lutar para alcançar o critério de 70% para a seleção de braço de alta recompensa necessária para completar sessões de livre escolha(Figura 4). Além disso, há dias limitados disponíveis para completar quaisquer outros testes comportamentais sem o devido planejamento. No entanto, estudos recentes indicam que o estresse de derrota social pode produzir impactos mais persistentes no cérebro e no comportamento. Estudos do laboratório Miczek mostram que 10 dias de estresse de derrota social podem aumentar o consumo voluntário de álcool em camundongos com duração mínima de 4 semanas^31,33. Protocolos de derrota social usam sessões de derrota que duram entre 5 e 10 minutos. Utilizamos exposições de 5 min para CNSDS para diminuir a probabilidade de lesões em camundongos C57BL/6J experimentais²⁸. O protocolo CNSDS produz resultados comparáveis em fêmeas ao protocolo de derrota social desenvolvido por Newmann e colegas, no qual camundongos fêmeas C57BL/6J são expostos aos camundongos suíços residentes weber²⁸. Semelhante ao CNSDS, essa variação do protocolo de derrota social utiliza 10 dias de interações de 5 min para induzir um fenótipo de estresse crônico.

Esses métodos podem ser usados para examinar como o estresse crônico impacta o processamento e a motivação em camundongos. Tanto o processamento de recompensas, quanto os sujeitos femininos, são historicamente subestudados no campo do transtorno de humor pré-clínico. Estudos futuros devem determinar o impacto do estresse crônico na motivação da recompensa masculina e feminina e estratificar camundongos resilientes versus suscetíveis(Figura 5B). Será valioso saber se essa estratificação produz efeitos diferentes no desempenho da barreira do labirinto Y, como visto em comportamentos de evasão, como campo aberto, labirinto de mais elevados e alimentação suprimida por novidades. Estudos futuros podem combinar essas metodologias com outras técnicas, como optogenética ou tecnologia DREADDS, para examinar os circuitos neurais que mediam a resposta ao estresse ou a motivação da recompensa.

Os autores não têm nada a revelar.

Os autores gostariam de agradecer a Thomas Grace por construir labirintos Y, barreiras e gaiolas de derrota social. Os autores gostariam de agradecer a Jay Lee, Karina Stech e Prachi Srivastava pela ajuda com a coleta de dados. Este trabalho foi financiado pelo NIMH Grant R01 MH112861 (BAS).