El estrés crónico cambia el comportamiento de la elección relacionada con el esfuerzo en una tarea de barrera del laberinto Y en ratones

La tarea de barrera del laberinto Y es una prueba de comportamiento que examina la motivación para gastar esfuerzo para recompensar. Aquí, discutimos la prueba de múltiples factores de estrés crónicos bien validados, incluyendo la corticosterona crónica y el estrés de derrota social con este comportamiento, así como el nuevo estrés crónico crónico de la derrota social no discriminatorio (CNSDS), que es eficaz en las mujeres.

Los trastornos del estado de ánimo, incluido el trastorno depresivo mayor, pueden ser precipitados por el estrés crónico. La tarea de barrera del laberinto Y es una prueba de elección relacionada con el esfuerzo que mide la motivación para gastar esfuerzo y obtener recompensa. En ratones, la exposición al estrés crónico afecta significativamente la motivación para trabajar por una recompensa de mayor valor cuando una recompensa de menor valor está disponible libremente en comparación con los ratones sin estrés. Aquí describimos el paradigma crónico de administración de corticosterona, que produce un cambio en la respuesta esfuerzo en la tarea de barrera del laberinto Y. En la tarea del laberinto Y, un brazo contiene 4 pellets de alimentos, mientras que el otro brazo contiene sólo 2 pellets. Después de que los ratones aprenden a seleccionar el brazo de alta recompensa, las barreras con una altura progresivamente creciente se introducen en el brazo de alta recompensa en varias sesiones de prueba. Desafortunadamente, la mayoría de los paradigmas de estrés crónico (incluyendo la corticosterona y la derrota social) se desarrollaron en ratones macho y son menos eficaces en ratones hembra. Por lo tanto, también discutimos el estrés crónico de la derrota social no discriminatoria (CNSDS), un paradigma de estrés que desarrollamos que es eficaz tanto en ratones masculinos como femeninos. Repetir resultados con múltiples factores de estrés crónicos distintos en ratones masculinos y femeninos combinados con un mayor uso de tareas de comportamiento relevantes traslacionalmente ayudará a avanzar en la comprensión de cómo el estrés crónico puede precipitar trastornos del estado de ánimo.

Los trastornos del estado de ánimo como la depresión y la ansiedad son muy frecuentes en la sociedad actual. Décadas de trabajo han buscado continuamente mejores tratamientos y modelos de roedores relevantes para estudiar estos trastornos complejos^1. El estrés crónico es un factor que contribuye a trastornos del estado de ánimo como la depresión². Por lo tanto, los paradigmas de estrés crónico como el estrés crónico por derrota social (SDS) y la administración crónica de corticosterona (CORT) se desarrollaron en ratones macho y ahora se utilizan ampliamente para evaluar los efectos neurobiológicos y conductuales de la exposición al estrés crónico. Las pruebas conductuales más utilizadas para evaluar los efectos de estrés crónico incluyen tareas asociadas con el comportamiento de evitación, como el laberinto elevado más, el campo abierto y la alimentación suprimida por la novedad, o con la eficacia de los antidepresivos, como la prueba de natación forzada. Sin embargo, estos comportamientos en roedores podrían carecer de rostro y, lo que es más importante, validez predictiva y relevancia traslacional para trastornos humanos como la depresión.

Un paradigma de estrés crónico popular, estrés leve impredecible crónico (CUMS), ha sido validado ampliamente utilizando comportamientos como la preferencia de sacarosa³. CUMS reduce la preferencia por una solución de sacarosa del 1% en comparación con el agua y se interpreta históricamente como un comportamiento relacionado con la anhedonia^4,5. Sin embargo, esta reducción de la preferencia de sacarosa no se observa en seres humanos con trastorno depresivo mayor^6,,7. Además, la preferencia de sacarosa no permite el estudio de la motivación de recompensas esponyosas.

Recientemente, algunas investigaciones han cambiado el enfoque a otros comportamientos asociados con la motivación y la recompensa^8,,9. Estas tareas tienen un valor traslacional prometedor porque se pueden llevar a cabo evaluaciones de comportamiento relativamente similares tanto en humanos como en roedores. Aquí, describimos los paradigmas CORT y SDS y sus efectos en una tarea de comportamiento de barrera del laberinto Y que mide la motivación para esforzarse por obtener recompensas. Luego discutimos un nuevo paradigma de estrés crónico que desarrollamos, estrés crónico de derrota social no discriminatorio (CNSDS), que es eficaz tanto en ratones masculinos como femeninos.

La administración crónica de corticosterona (CORT) es un paradigma diseñado para imitar el estrés crónico sin exposiciones reales al estrés. La activación del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal por estrés resulta en la liberación endógena del cortisol esteroide suprarrenal en los seres humanos^10,11,12 y corticosterona en ratones^13,14. La entrega de corticosterona a través del agua potable de ratones macho adultos durante al menos 4 semanas da como resultado respuestas conductuales maladaptivas en tareas de evitación como campo abierto, elevado más laberinto, y novedad suprimida alimentación^{10,,11,12,13,14,15,16}. Curiosamente, CORT también afecta al procesamiento de recompensas en tareas instrumentales^16,17,18,19. El paradigma CORT descrito aquí produce una concentración sérica consistente de menos de 100 ng/mL CORT, que es más de cinco veces menor que la producida por un estresor agudo como la natación forzada¹⁵. Por lo tanto, es poco probable que la administración crónica de CORT cause hipercortisolemia. Mientras que el CORT crónico sólo es eficaz en ratones macho^20,recientemente demostramos que produce un cambio robusto en la respuesta esfuerzosada en la tarea de barrera del laberinto Y²¹. Hasta nuestro conocimiento, este fue uno de los primeros estudios para examinar los efectos del estrés crónico en un comportamiento de elección relacionado con el esfuerzo en ratones macho²¹. Un estudio anterior demostró por primera vez el impacto del estrés agudo de restricción en la toma de decisiones basadas en el esfuerzo en ratas²². En los comportamientos de elección relacionados con el esfuerzo, un animal elige esforzarse por obtener una recompensa de alto valor o aceptar una recompensa de menor valor que esté más libremente disponible. En los seres humanos, el esfuerzo-gasto para la tarea de recompensas (EEfRT), es un juego de ordenador desarrollado para ser análogo a las tareas de elección relacionadas con el esfuerzo en ratones²³. La depresión da como resultado respuestas maldaptivas en EEfRT (disminución de la probabilidad de elegir tareas difíciles para recompensas de alto valor). Por lo tanto, las tareas de elección relacionadas con el esfuerzo en roedores son particularmente interesantes debido a su relevancia traslacional.

El estrés de derrota social crónica (SDS) es uno de los modelos de estrés preclínico más utilizados en ratones machos. Es un protocolo de 10 días donde machos reproductores retirados grandes y agresivos CD-1 atacan ratones experimentales, típicamente C57BL/6J, en sesiones diarias de 5 minutos²⁴. Esto produce un fenotipo conductual maladaptivo robusto en un subconjunto de ratones experimentales. Una prueba de interacción social se utiliza para estratificar a los ratones en poblaciones resilientes o susceptibles al estrés de derrota, y varios estudios han utilizado esta característica única de SDS para sondear los mecanismos moleculares y de circuito neural subyacentes a la dependencia y la susceptibilidad al estrés. Aquí describimos los detalles del paradigma CORT y su implementación para la tarea de comportamiento de la barrera del laberinto Y. También discutimos los efectos sdS en la tarea de barrera del laberinto Y. La tarea de barrera del laberinto Y se basa en la tarea de barrera del laberinto T, que se utiliza principalmente en ratas para medir la motivación para gastar esfuerzo para recompensas altas o bajas presentes en los dos brazos del laberinto^8,,9,,25. Esta tarea también se ha implementado para estudiar la respuesta esfuerzoica en ratones administrados con cafeína o antagonistas de la dopamina en ratones²⁶. Los roedores pueden gastar un mayor esfuerzo escalando barreras de altura progresivamente creciente en un brazo del laberinto para un valor de recompensa más alto, por lo general 4 pellets de recompensa, o gastar significativamente menos esfuerzo en el otro brazo del laberinto para recibir sólo 2 pellets de recompensa^9. Los paradigmas de derrota social de 10 días producen un fenotipo maladaptivo robusto en ratones susceptibles que dura aproximadamente 30 días, por lo que modificamos la tarea de barrera del laberinto Y para entrenar y probar animales más rápidamente con el fin de completar todos los experimentos dentro de este plazo de 30 días²⁴. Por lo tanto, aquí también detallamos un protocolo de tarea conductual de barrera Y-maze que contiene sesiones de entrenamiento condensadas y sesiones de prueba de barrera única para medir la motivación para gastar esfuerzo para recompensa en ratones crónicos expuestos al estrés.

Desafortunadamente, tanto la corticosterona crónica como el estrés crónico de la derrota social se desarrollaron en ratones macho y son menos eficaces en ratones hembra. Esto es altamente problemático ya que las mujeres son más propensas que los hombres a ser diagnosticadas con trastornos del estado de ánimo como la depresión¹. Las adaptaciones inteligentes a SDS han permitido el uso en ratones hembra, pero requieren cirugías difíciles o tediosa colección de orina^26,,27. Recientemente describimos una simple modificación del paradigma SDS, llamada estrés crónico de derrota social no discriminatoria (CNSDS). El SNCSDS permite la estratificación susceptible y resistente de ratones experimentales masculinos y femeninos²⁸. Tanto los ratones susceptibles hembra como macho expuestos al SNCS muestran una mayor evitación de los brazos abiertos en el laberinto elevado-más y del centro en campo abierto y muestran una mayor latencia para comer en la alimentación suprimida por la novedad. CNSDS también es más eficiente que otras modificaciones a SDS, ya que ambos sexos se combinan en sesiones de derrota. Esto se traduce en un mayor rendimiento de ratones experimentales sin un aumento asociado en el tiempo y el esfuerzo necesario para completar el protocolo. Por lo tanto, concluimos este manuscrito con una presentación en profundidad de este paradigma de estrés crónico recientemente desarrollado.

Estos experimentos se llevaron a cabo de conformidad con las directrices de cuidado y cuidado de animales de laboratorio NIH y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Rutgers.

1. Corticosterona crónica (CORT)

1. Asigne ratones aleatoriamente a grupos de tratamiento. Divida aleatoriamente los ratones C57BL/6J machos adultos en grupos de vehículos y corticosterona (CORT).
   1. Ratones de vehículos domésticos en jaulas distintas, y ratones CORT en otros, ya que su tratamiento se entrega a través de la botella de agua de la jaula.
   2. Etiquetar tarjetas de agua especiales para colocar en la jaula que notifica al personal de cuidado de animales que las botellas de agua contienen las soluciones necesarias para el experimento.
2. Haga una solución para el vehículo disolviendo 3,375 g de beta-ciclodextrina en 750 ml de agua del grifo en un recipiente de vidrio atornillado de tamaño 1 L.
   1. Llene las botellas de agua de jaula del vehículo con esta solución. Asegúrese de que la botella no se filtre para medir el consumo de líquido.
   2. Etiquete el recipiente y guárdelo a temperatura ambiente en el estante del laboratorio. Utilice la solución del vehículo para llenar las botellas de jaula durante aproximadamente 1 semana.
   3. Rellene las botellas de vehículos durante toda la semana. Rellene las botellas de jaula 1x-2x durante la semana según sea necesario. Cambie a una botella fresca 1 veces por semana, ya sea al principio o al final de la semana.
      NOTA: Después de una semana, la beta-ciclodextrina comenzará a cubrir el interior de la botella de agua y hace que la solución esté turbia.
   4. Monitoree la cantidad de líquido consumido dos veces por semana y registre. Pesar cada botella respectiva y grabar, cuidado de no derramar ningún líquido. Rellene y devuelva cada botella.
      NOTA: Una jaula de 5 ratones beberá 80-120 ml de líquido en 3-4 días.
3. Haga la solución CORT disolviendo primero 3.375 g de beta-ciclodextrina en 750 ml de agua del grifo en un recipiente de vidrio atornillado de tamaño 1 L. A continuación, añadir 26,25 mg de corticosterona.
   1. Sonicar la solución CORT para disolver CORT en el agua. Coloque el recipiente en un baño de agua más limpio ultrasónico. Sonicar a 40 kHz durante aproximadamente 30 minutos o hasta que la corticosterona se disuelva y el líquido parezca claro.
      NOTA: Los homogeneizadores ultrasónicos (estilo punta) también son eficaces para disolver CORT.
   2. Llene las botellas de agua para todas las jaulas CORT con solución. Etiquetar el recipiente y almacenar a temperatura ambiente en el estante en el laboratorio. La solución CORT se puede utilizar para llenar botellas de jaula durante aproximadamente 1 semana.
      NOTA: Utilice botellas de agua de vidrio marrón o botellas de plástico opacas, ya que CORT es sensible a la luz.
   3. Supervise la cantidad de líquido consumido dos veces por semana y registre. Pesar todos los ratones del vehículo y CORT semanalmente para comparar el líquido consumido con el peso de los ratones dentro de cada jaula.
   4. Para determinar el volumen de líquido consumido (mL/g/día), utilice la siguiente ecuación:
      (La jaula de volumen bebió en los últimos 3-4 días) / (Peso corporal medio de ratones en la jaula) X número de días desde que el vehículo o la botella CORT ha sido rellenado)
      NOTA: Una jaula promedio de no 5 ratones macho adultos C57BL/6J consumirá en promedio 0.25 – 0.30 mg/g/día, que por lo general permanece consistente a través de ad libitum y períodos de tiempo privados de alimentos. Estas concentraciones dan lugar a dosis aproximadas de 24 mg/kg/día beta-ciclodextrina, y 9,5 mg/kg/día CORT^15,16.
4. Estrés de derrota social (SDS)
   1. Utilice los protocolos de estrés de derrota social estándar como se describe en profundidad en otros lugares^24,,29.
5. Tarea de barrera Y-Maze
   1. Privación de alimentos para la tarea de la barrera del laberinto Y
      1. Al día siguiente de completar la prueba de interacción social, sopesar todos los ratones de Control y Experimental. Este será su peso corporal de alimentación libre.
         NOTA: En este documento, utilizamos "Control" y "Experimental" para referirse tanto a SDS Control y SDS Experimental mice, así como a vehículos y ratones administrados por CORT en los respectivos paradigmas SDS y CORT.
      2. Para privar a los ratones, solo retire la comida de laboratorio del lado C57BL/6J de cada jaula.
      3. Pesar todos los ratones, así como la cantidad de comida de laboratorio que se dará diariamente, con el fin de mantener adecuadamente el peso corporal en aproximadamente 90% de peso de alimentación libre durante las pruebas.
         NOTA: La cantidad de alimentos entregados en la jaula casera de cada ratón o ratones dependerá del peso corporal fluctuante y de la cantidad de pellets de recompensa consumidos en cada día de entrenamiento o pruebas en el laberinto Y.
      4. Establezca familiaridad con los pellets de recompensa. Vierta una pequeña cucharada de 20 mg de pellets de alimentos a base de granos (Bio-Serv) en la jaula casera. Esto establecerá familiarizado con los pellets y motivará a los ratones a consumirlos en el laberinto Y en sesiones de entrenamiento habituentas e iniciales.
6. Aparato de laberinto Y
   1. Construir una estructura de laberinto Y de plexiglás blanco opaco de 3/16", con tres brazos de 26 cm de longitud, 20 cm de altura y 7 cm de ancho.
   2. Utilice divisores que se deslizan entre las ranuras en el laberinto Y para permitir que un investigador cierre el cuadro de inicio donde se colocan inicialmente los ratones, o que contenga el ratón en cualquiera de los brazos una vez que hayan seleccionado y entre en los brazos izquierdo o derecho del laberinto Y.
   3. Cree múltiples barreras de laberinto Y de 10, 15 y 20 cm de altura de malla de alambre para el lado vertical, y con plexiglás en aproximadamente un ángulo de 45o en el lado en ángulo posterior. Esto permite que los ratones C57BL/6J agarren y suban el lado de malla de alambre vertical de cada barrera, y luego atraviesen el lado angular del plexiglás de la barrera.
      1. Agregue pasos finos en el lado en ángulo para permitir una mayor tracción.
7. Habituación del laberinto Y
   1. Habituar todos los ratones de control y experimentales al aparato del laberinto Y.
      1. Al día siguiente de la privación de alimentos, coloque un gran número de 20 mg de pellets de alimentos a base de grano (por ejemplo, Bio-Serv) en la tapa de un tubo centrífugo de 50 ml y colóquelos en los extremos de cada brazo del laberinto Y. Estas tapas sirven como pequeños recipientes alimentarios para los ratones, y los ratones aprenderán fácilmente a comer los pellets de alimentos.
      2. Coloque cada ratón en el cuadro de inicio del laberinto Y con el divisor de cuadro de inicio en su lugar.
      3. Después de unos segundos, retire el divisor, permitiendo que cada ratón explore el laberinto Y durante 15 minutos. Esta cantidad de tiempo permite al ratón explorar adecuadamente todos los brazos del laberinto y establecer familiaridad con el aparato.
         NOTA: Algunos ratones pueden no consumir pellets de alimentos en este primer día de habituación.
   2. Al día siguiente, complete una segunda habituación del laberinto Y de 15 minutos utilizando un procedimiento idéntico.
      1. Tenga en cuenta cualquier ratón que no haya comido pellets. Para estos ratones, arroje otra pequeña cucharada de pellets en sus jaulas caseras.
8. Entrenamiento de elección forzada de Y-maze
   1. Designa el brazo de alta recompensa (HR) y recompensa baja (LR) para cada ratón.
      1. Asigna aleatoriamente ratones en los grupos Control y Experimental del brazo izquierdo como el brazo de alta recompensa (HR) y el brazo derecho como el brazo de recompensa baja (LR), o viceversa. Por lo tanto, 4 pellets estarán disponibles en cada ensayo en la izquierda, brazo HR, y 2 pellets disponibles en el brazo derecho, LR, o el opuesto.
      2. Contrapeso a estos brazos de LR y HR designados en el grupo Control y Experimental de modo que aproximadamente la mitad de cada grupo tenía el brazo izquierdo como el brazo HR, y la mitad tenía el brazo derecho como el brazo HR.
   2. Ensayos de elección forzada
      1. Después de los 2 días de habituación del laberinto Y, hacer que los ratones comiencen 3 días de 10 pruebas de entrenamiento de elección forzada.
      2. Para cada prueba de elección forzada, coloque el ratón en el cuadro de inicio y, a continuación, retire el divisor, lo que permite que el ratón 60 s entre en el brazo izquierdo o derecho y consuma los pellets disponibles. Para cada bloque de prueba de elección forzada del brazo opuesto con el divisor, obligando al ratón a seleccionar el otro brazo. Para una prueba de opción forzada de recursos humanos, bloquee el acceso al brazo LR, o viceversa.
      3. Retire el ratón después del ensayo y reponer los pellets respectivos que se comieron.
      4. Pruebas de elección forzadas alternativas para cada ratón a lo largo de cada día de entrenamiento, de modo que los ratones completen 5 HR y 5 lr pruebas de elección forzada.
         NOTA: Las pruebas de elección forzada entrenan a los ratones para asociar un brazo con la recompensa más alta y el otro con la recompensa más baja.
      5. Coloque el ratón de nuevo en su jaula de inicio y luego ejecute no más de 3-5 ratones subsiguientes con el fin de mantener un intervalo intertrial de 5 minutos para cada ratón.
9. Entrenamiento de libre elección de laberinto Y
   1. Pruebas de libre elección
      1. Comience cada sesión de libre elección con una prueba de elección forzada del brazo HR y LR. Por lo tanto, los ratones habrán experimentado ser forzados en cada brazo antes de comenzar 10 pruebas de libre elección.
      2. Coloque cada ratón en el cuadro de inicio y retire el divisor. Una vez que el ratón ha seleccionado un brazo y lo ha atravesado hasta el final donde se encuentra la copa que contiene los pellets, coloque el divisor de brazo en su lugar en ese lado, bloqueando el ratón hasta que haya consumido los pellets.
      3. Retire el ratón de vuelta a su jaula de inicio y ejecute los 3-5 ratones posteriores utilizados en ese ciclo para permitir un intervalo entre pruebas de 5 minutos.
   2. Registre los siguientes datos: latencia para elegir un brazo, selección de brazo y latencia para alcanzar la taza de pellets.
      1. Registre qué brazo entra el ratón y se atraviesa completamente a la taza de pellets. También registre la latencia para seleccionar ese brazo y alcanzar la copa de pellets.
      2. Considere cualquier ensayo en el que un ratón no seleccione un brazo o no consuma los 4 o 2 pellets como ensayo omitido.
   3. Criterio de libre elección del 70%
      1. Registre qué brazo se selecciona para las 10 pruebas de libre elección diarias.
      2. Una vez que un ratón ha seleccionado el brazo HR en 7 de las 10 pruebas en un día de entrenamiento de libre elección (criterio del 70%), mueva el ratón a sesiones de prueba de barrera.
         NOTA: Continúe el entrenamiento de libre elección hasta que todos los ratones alcancen el criterio del brazo del 70% HR para garantizar la discriminación adecuada de los brazos HR y LR y que los ratones demuestren la misma preferencia por el brazo HR.
10. Pruebas de barrera del laberinto Y
    1. Sesión de prueba de barrera de 10 cm
       1. Coloque la barrera de 10 cm a mitad del brazo HR en el laberinto Y.
       2. Comience con múltiples pruebas de elección forzada para ambos brazos. Los ratones resistentes a subir la barrera pueden ser provocados con una pieza de plexiglás larga y delgada.
          NOTA: Por experiencia, recomendamos al menos 2 pruebas de elección forzada para brazos HR y LR al comienzo de cada sesión a una nueva altura de barrera. Recomendamos grabar las pruebas en las que sea necesario pedir al ratón que suba la barrera si es necesario. Los ratones generalmente aprenden a trepar por encima de la barrera de 10 cm, que no es tan alta que no pueden pararse y ver sobre ella, dentro de 1-2 ensayos. La barrera tendrá que colocarse en el otro lado para los ratones con el brazo opuesto como el brazo HR designado.
       3. Coloque cada ratón en el cuadro de inicio, retire el divisor y permita que el ratón atraviese el laberinto y seleccione un brazo para 10 pruebas de libre elección que contengan la barrera de 10 cm en el brazo HR.
       4. Si el ratón elige el lado HR, subirá sobre la barrera con el fin de obtener la mayor recompensa, los 4 pellets. De lo contrario, seleccionará el brazo LR y simplemente atravesará el suelo del laberinto para obtener la recompensa menor, 2 pellets.
       5. Registre el brazo seleccionado, y la latencia para seleccionar un brazo y alcanzar la copa de pellets para todas las pruebas. De forma similar, gire 4-6 ratones totales por ciclo, para mantener un intervalo entre pruebas de 5 minutos.
          NOTA: Rocíe 70% de etanol en el laberinto Y y séquelo de forma consistente y entre cada ratón.
    2. Sesión de prueba de barrera de 15 cm
       1. Al día siguiente complete todos los pasos enumerados como arriba (paso 1.10.1), pero con la barrera de 15 cm de altura en el brazo HR.
    3. Sesión de prueba de barrera de 20 cm
       1. Al día siguiente complete todos los pasos enumerados como arriba (paso 1.10.1), pero con la barrera de 20 cm de altura en el brazo HR.
          NOTA: Por experiencia, por la altura de barrera de 20 cm la mayoría de los ratones sdS susceptibles o CORT Experimentales (e incluso varios ratones Control) desplazarán sus respuestas al brazo LR, ya que no están lo suficientemente motivados como para subir por encima de la barrera alta de 20 cm. Además, los adaptadores de plexiglás pueden necesitar ser utilizados para evitar que los ratones trepen desde la parte superior de esta barrera hasta los bordes de las paredes del laberinto Y. No recomendamos construir un laberinto Y más alto, ya que se hace más difícil para el experimentador rellenar los pellets en cada taza y eliminar los ratones después de cada ensayo.
    4. Sesión de prueba de discriminación de recompensa
       1. Para garantizar que los ratones de control y experimental muestren palancas adecuadas y similares de discriminación de recompensa, realice una sesión de prueba de discriminación.
       2. Siga todos los pasos anteriores (paso 1.10.1) pero coloque una barrera de 10 cm en el brazo LR. Ahora, ambos brazos contienen barreras de 10 cm, y los ratones tendrán que trepar por encima de cualquiera de los dos o 2 pellets.
       3. Registre la latencia y la selección de brazos para las 10 pruebas.
          NOTA: Como los ratones tendrán que gastar el mismo esfuerzo para obtener cualquiera de las recompensas, los ratones deben seleccionar el brazo HR en la mayoría de los ensayos. Para examinar las latencias para seleccionar el brazo HR y LR, calcule una latencia media del brazo HR y una latencia media del brazo LR para cada ratón individual. A continuación, compare la latencia para seleccionar ambos brazos utilizando un ANOVA mixto bidireccional, con SDS (Control, SDS-Susceptible, SDS-Resilient) como factor entre sujetos, y el brazo (brazo HR, brazo LR) como factor dentro de los sujetos.

2. Estrés crónico de derrota social no discriminatoria (CNSDS)

1. Pantalla para un comportamiento agresivo en ratones CD-1
   1. Coloque un macho y un ratón hembra C57BL/6J en la jaula de cada CD-1 durante 180 s o hasta que el CD-1 ataque a ambos ratones. Estos ratones C57BL6/J no necesitan ser ingenuos y no se utilizarán en ningún otro experimento. Durante esta fase de cribado de agresor, no comente ratones C57BL/6J con ratones CD-1.
      1. Registre la latencia para atacar ambos ratones C57BL/6J para cada CD-1.
      2. Seleccione todos los agresores de CD-1 que ataquen ratones C57BL/6J masculinos y femeninos en 60 segundos en sesiones consecutivas de un total de 3 sesiones de detección. Otros se pueden utilizar para co-vivienda en jaulas domésticas.
         NOTA: Una advertencia importante de la derrota social es la presencia de heridas como consecuencia de la agresión física. Cada ratón en las fases experimentales y de cribado debe ser revisado en busca de heridas y tratado con desinfectante de cloro-hexano si se presentan pequeñas lesiones cutáneas. Cualquier ratón con una herida superior a 1 cm debe ser retirado del experimento.
2. Asigne ratones a grupos experimentales y de control.
   1. Reúne a todos los machos adultos ingenuos y a las hembras C57BL/6J, así como a los criadores de CD-1 machos retirados, así como a los machos CD-1 que se utilizarán en el co-alojamiento.
      1. Asigne aleatoriamente ratones C57BL/6J machos y hembras adultos para controlar o condiciones experimentales. Cada hombre y mujer será emparejado para todas las sesiones de derrota social en el grupo experimental cnSDS. Los machos y las hembras del grupo de Control del SNCS rotarán cada día.
      2. Asigne a los machos CD-1 para que se utilicen en sesiones de derrota social o que se co-alojados con los machos y hembras experimentales después de cada sesión, que alternará diariamente para cada par de ratones machos y hembras C57BL/6J.
3. Estrés crónico de derrota social no discriminatorio (CNSDS)
   1. Lleve a todos los ratones a la sala de derrota social dedicada, incluyendo todos los machos CD-1, ratones C57BL/6J masculinos y femeninos de control del SNC, y ratones C57BL/6J experimentales del SNC.
      1. Alinee 4-6 jaulas de machos CD-1 con machos y hembras C57BL/6J con jaulas CD-1 en la parte delantera y jaulas C57BL/6J detrás.
      2. Indique con etiquetas de identificación de jaula qué ratón está siendo atacado y luego co-alojado con qué CD-1 para asegurar la organización de todos los ratones.
         NOTA: Después de inicializar experimentos en el primer día, los ratones se pueden rotar para las 9 sesiones de derrota restantes de tal manera que cada par macho y hembra C57BL/6J se giran una jaula a la izquierda para cada sesión. Esto permite una nueva interacción con nuevos CD-1 en cada sesión.
   2. Procedimiento experimental del grupo cnSDS
      1. Coloque un macho adulto y una hembra adulta C57BL/6J ratón en la jaula de casa de cada macho agresor CD-1 para una sesión de derrota social de 5 minutos.
      2. Registre la latencia del ataque y la frecuencia de ataque para ratones experimentales C57BL/6J masculinos y femeninos.
      3. Después de 5 minutos, retire el ratón macho C57BL/6J y colóquelo en jaula de macho CD-1 co-alojado, separado por una barrera de plexiglás clara y perforada. Separado de ataque CD-1 y hembra C57BL/6J ratón con una barrera de plexiglás clara y perforada similar. Alternar si el ratón C57BL/6J masculino o hembra está alojado con el agresor CD-1 cada día.
         NOTA: Después de cada interacción diaria de 5 minutos, cada ratón será evaluado por lesiones y heridas tratadas si es inferior a 1 cm. Cualquier herida que sea mayor de 1 cm resultará en la extracción y eutanasia inmediata del ratón. Por lo tanto, tanto los ratones experimentales masculinos como femeninos se alojan conjuntamente con el agresor CD-1 durante 5 días y con la novela CD-1 no utilizada en la sesión de ataque durante los 5 días restantes. Las barreras claras y perforadas de plexiglás evitan la interacción física, pero permiten el contacto sensorial con el agresor CD-1 en las 24 horas entre sesiones. El lavado vaginal se puede realizar en todos los ratones hembra aproximadamente 30 minutos después de la derrota todos los días como se describió anteriormente²⁸.
   3. Procedimiento del Grupo de Control del CNSDS
      1. Coloque una hembra control en la jaula doméstica de un ratón macho de control C57BL/6J.
      2. Después de 5 minutos, separe los ratones y coloque un divisor de plexiglás claro y perforado entre los ratones.
      3. Devuelva los ratones a la sala de colonias y colóquelos en un estante separado como jaulas experimentales del CNSDS. En la sala de colonias hemos designado estantes donde los ratones estresados se alojan por separado de otros ratones en la sala de la colonia. Además, los efectos pueden verse en los ratones no estresados si presenciaron la agresión que se está produciendo, como se ve en los paradigmas vicarios de la derrota social³⁰
      4. Tenga en cuenta cualquier ataque o comportamiento de montaje durante cada interacción de Control.
   4. Los ratones machos y hembras de control se introducirán en un nuevo conespecífico en los días posteriores como se hace en los grupos tradicionales de Control de Estrés de Derrota Social. Completa 10 días consecutivos de sesiones experimentales y de control de CNSDS.
      1. Después de completar la^th 10a y última sesión de Control o CNSD Experimental, co-casar todos los ratones y mantener esta co-vivienda durante todas las pruebas de comportamiento. Cada jaula constará de 2 ratones separados a cada lado del divisor de plexiglás para permitir la exposición sensorial. Los ratones de control se alojan con otros ratones de control sexual opuestos, mientras que los ratones experimentales están co-alojados con ratones experimentales de sexo opuesto.
      2. Cada hembra Control C57BL/6J está co-alojada con el macho Control C57BL/6J^th con el que interactuó en la 10a sesión, con un divisor claro de plexiglás colocado en la jaula para separar a los dos ratones.
      3. Aproximadamente 24 horas después de la sesión de derrota final ejecutar una prueba de interacción social estándar para determinar si CNSDS reduce el comportamiento social con un nuevo ratón CD-1 en comparación con el control, y para estratificar micetificar "resiliente" o "susceptible" a la^{tensión 24,,29}.
   5. Pruebe el control del CNSD y los ratones masculinos y femeninos experimentales en otros comportamientos, incluida la tarea de barrera del laberinto Y, y estratifique el grupo CNSDS en grupos resistentes al SNC y a los CNSDS-Susceptibles.
4. Prueba de interacción social
   1. Configuración inicial para la prueba de interacción social
      1. 24 horas después de la última sesión de derrota del CNSDS, realice una prueba de interacción social.
      2. Lleve todos los ratones de control y experimentales alojados en pareja, así como un nuevo macho CD-1 no utilizado en el paradigma del SNC, a una sala de comportamiento separada para ejecutar una prueba de interacción social.
      3. Configure una cámara de campo abierto estándar (75 cm x 75 cm) debajo de una cámara de grabación conectada al software de seguimiento del comportamiento (por ejemplo, EthoVision) que se ejecute en un ordenador dedicado.
      4. Establecer un nuevo experimento con una zona de interacción social de 24 cm x 24 cm que rodea un contenedor de interacción (pequeño contenedor de plexiglás perforado que mide aproximadamente 10 cm x 10 cm x 10 cm) que albergará el nuevo CD-1 a lo largo de una pared del campo abierto, en el segundo de 2 ensayos consecutivos de 2,5 minutos. Por lo tanto, una zona de interacción de 7 cm de ancho rodea el contenedor que alberga el nuevo ratón CD-1.
   2. Ejecutar un ratón en la prueba de interacción social
      1. Coloque cada ratón en una esquina más lejana del campo abierto para una prueba de 2,5 minutos sin CD-1 presente e inicie el programa de software de grabación.
         NOTA: Tenga en cuenta que el contenedor de interacción debe colocarse en el centro de una pared del campo abierto y no contener ningún ratón CD-1 para esta primera prueba.
      2. Después de 2.5 min, retire el ratón de vuelta a su jaula de origen. Limpie el campo abierto con 70% de etanol.
      3. Coloque el nuevo macho CD-1 en un segundo cubo de plexiglás perforado a lo largo del centro de una pared del campo abierto.
      4. Una vez más, coloque el ratón en la esquina del campo abierto para una segunda prueba de 2,5 minutos, ahora con el CD-1 presente, e inicie el programa de software de grabación.
      5. Retire el ratón y colóquelo de nuevo en su jaula de casa. Retire el CD-1 y colóquelo de nuevo en su jaula de origen. Limpie el campo abierto con 70% de etanol.
   3. Ejecute los ratones experimentales y de control CNSDS restantes y calcule la relación de interacción.
      1. Repita este procedimiento con todos los demás ratones para cuantificar el tiempo pasado en la zona de interacción tanto en el ensayo 1 como en el ensayo 2 para cada ratón experimental y de control CNSDS.
      2. Para calcular una relación de interacción, compare el tiempo invertido en la zona de interacción social en el ensayo 2 (CD-1 presente) frente al ensayo 1 (CD-1 ausente), utilizando la siguiente ecuación:
         Relación de interacción (tiempo en la zona de interacción en el ensayo 2)/(tiempo en la zona de interacción en el ensayo 1)
   4. Estratificar a los ratones como "resistentes al SNC" o "cnSDS-Susceptible". Los ratones resistentes tienen una relación de interacción de > 1,0, mientras que los ratones susceptibles tienen una relación de interacción de <-1,0.
      1. En medidas de comportamiento posteriores, como la tarea barrera del laberinto Y u otras pruebas de comportamiento, subdivide los ratones experimentales del CNSDS en estos fenotipos resistentes al SNC y al SNCS.
      2. Por lo tanto, para las mujeres, los ANOVA unidireccionales se pueden llevar a cabo entre los grupos de control de CNSDS, experimental-resiliente del SNC y de la insensatación, con comparaciones post hoc para determinar las diferencias entre los grupos cuando proceda.
      3. Para las comparaciones de diferencias de sexo, realice ANOVAs bidireccionales con CNSDS (Control, Resiliente, Susceptible) y Sexo (Hombre, Femenino) como factores entre sujetos. Utilice comparaciones post-hoc cuando corresponda.

El CORT crónico se administró durante 4 semanas seguido de entrenamiento y pruebas de barreras del laberinto Y(Figura 1A). En una cohorte separada, el paradigma SDS de 10 días fue seguido de manera similar por el entrenamiento y las pruebas en la tarea de barrera del laberinto Y (Figura 1C), para determinar el efecto de estos paradigmas de estrés crónico en el comportamiento de elección relacionado con el esfuerzo en ratones macho. Tanto el CORT crónico como la SDS redujeron el peso corporal medio en comparación con los ratones del vehículo y los ratones de control SDS según lo determinado por las pruebas t(Tabla 1). Estos ratones también consumieron menos comida media de laboratorio de jaula casera durante las pruebas (Tabla 1).

En la cohorte CORT, un ANOVA mixto con CORT como factor entre sujetos y semana como factor dentro de los sujetos indica que los ratones administrados por vehículos y CORT consumieron un volumen similar de líquido a lo largo de 4 semanas de tratamiento más 3 semanas de pruebas de comportamiento (7 semanas en total) (Figura 1B). En la cohorte SDS, los machos de control y experimentales completaron 10 días del protocolo SDS, y fueron evaluados por susceptibilidad al protocolo SDS utilizando una prueba de interacción social en la que el tiempo dedicado a interactuar con un nuevo macho CD-1 se comparó con el tiempo en la zona de interacción sin el CD-1 presente²⁴. Un ANOVA unidireccional indicó que la SDS produce un fenotipo maladaptivo en ratones susceptibles (60%), en comparación con los ratones resistentes (40%) o Controlar ratones no expuestos a SDS (Figura 1D). Específicamente, los ratones SDS-Susceptible muestran una reducción en el tiempo invertido en la zona de interacción que contiene un nuevo ratón CD-1, en comparación con los ratones SDS-Resilient y Control.

Luego, capacitamos a las cohortes CORT (Experimental y Control mice) y SDS (Susceptible y Control) en la tarea de barrera del laberinto Y (Figura 2A). Medimos el número de ensayos que los ratones de Control y Experimental gastarían esfuerzo para escalar una barrera para una recompensa de 4 pellets, en lugar de elegir el otro brazo del laberinto Y que contenía sólo 2 pellets pero no presentaba ninguna barrera para escalar. Para SDS, un ANOVA mixto bidireccional, con SDS (Control, SDS-Susceptible, SDS-Resilient) como factor entre sujetos, y brazo (brazo HR, brazo LR) como el factor dentro de los sujetos se utilizó para examinar la respuesta espontente en el laberinto Y. Para el CORT crónico, un ANOVA mixto bidireccional, con la administración de CORT (Vehículo, CORT) como factor entre sujetos, y el brazo (HR, brazo, brazo LR) como factor dentro de los sujetos. Tanto el CORT crónico como el SDS produjeron un cambio en la respuesta espontente cuando la altura de la barrera aumentó a 15 cm y a 20 cm(Figura 2B y Figura 2C). Ninguno de los dos se desplazó respondiendo cuando sólo una barrera de 10 cm estaba en el brazo HR. Además, en una sesión de discriminación de recompensa después de la prueba, todos los ratones respondieron de manera similar para el brazo hr cuando se colocó una barrera de 10 cm en los brazos HR y LR. Por último, los ANOVAs bidireccionales con CORT o SDS como factor entre sujetos y el brazo HR o LR como factor dentro de los sujetos revelan que la latencia del brazo HR y LR con la barrera de 15 cm no se vio afectada por la administración cortó, y fue similar para ambos grupos con brazos LR y HR (Figura 3). Por lo tanto, la CORT crónica y la SDS cambian con fuerza respondiendo en la tarea de barrera del laberinto Y en ratones machos.

Es importante destacar que si la CORT o SDS crónica perjudica el aprendizaje de la tarea de barrera del laberinto Y (Figura 4), estos ratones pueden no alcanzar el criterio en las sesiones de entrenamiento de libre elección, lo que afecta a la interpretación posterior de los resultados de la barrera. Por lo tanto, mostramos resultados representativos potencialmente negativos que muestran esta diferencia, evaluados utilizando muestras independientes separadas t-pruebas (Figura 4).

El procedimiento del SNC produce un fenotipo maladaptivo robusto en ratones susceptibles C57BL/6J masculinos y femeninos(Figura 5A). Una tarea de interacción social se utiliza para estratificar a los ratones en resilientes (38,3%) y susceptible (61,7%) poblaciones (Figura 5B), que pueden subdividirse aún más por sexo (hombres: 43,3% resistentes, 56,7% susceptibles; mujeres: 36,7% resistentes, 63,3% susceptibles), utilizando ANOVAS unidireccionales entre el Control de CNSDS, CNSDS-Resiliente, y CNSDS Experimental-Grupos. Si bien este paradigma modificado produce efectos maladaptivos similares a los de SDS en los comportamientos de evitación^28,todavía no se ha implementado en combinación con pruebas de comportamiento relacionadas con la recompensa y la motivación relevantes traslacionalmente, como la tarea de barrera del laberinto Y. Es esencial que futuros estudios evalúen los efectos de factores estresantes como el SNCS en comportamientos traslacionalmente relevantes, como la tarea de barrera del laberinto Y, tanto en hombres como en mujeres.

Tabla 1: Peso corporal y cantidad de alimentos que se proporcionan diariamente. Los ratones administrados por vehículos y CORT, así como los ratones de Control y SDS se pesaron semanalmente y se registró la cantidad de alimentos administrados. Se indican el peso corporal medio (g) a través de las pruebas del laberinto Y y la media de los alimentos diarios (g) dados.

Figura 1: La SDS induce un fenotipo depresivo caracterizado por una interacción menos social.
(A) Esquema que representa la línea de tiempo para los protocolos de barrera CORT y Y-maze. (B) Datos representativos que muestran el volumen consumido (mL/g/día) en ratones administrados por vehículos y CORT. (C) Esquema que representa la línea de tiempo para los protocolos de barrera SDS y Y-maze. (D) En una prueba de interacción social representativa, los ratones SDS Susceptible muestran un tiempo reducido de interacción con un ratón novedoso en comparación con los ratones SDS Resilient o Control. Las barras son medias de SEM. *p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: CORT y SDS cambian de esfuerzo respondiendo en una tarea de barrera del laberinto Y.
(A) Línea de tiempo de la tarea de barrera del laberinto Y para CORT y SDS. (B) Chronic CORT reduce la selección de brazos HR a 15cm y 20cm alturas de barrera. Esta cifra ha sido modificada de Dieterich et al. 2020²¹. (C) Resultados representativos que demuestran que los ratones SDS-Susceptible reducen la selección del brazo HR a alturas de barrera de 15 cm y 20 cm, en comparación con los ratones Control o SDS-Resilient. Las barras son medias de SEM. *p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: La latencia del laberinto Y no se ve afectada por la CORT crónica.
La CORT crónica no afecta a la latencia para seleccionar brazos LR o HR en el laberinto Y. Además, tanto los ratones de vehículos como los cortúnicos seleccionan el brazo LR o HR con latencias similares. Esta cifra se reimprime desde Dieterich et al. 2020²¹. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: El CORT crónico y el SDS afectan la selección libre de brazos HR.
Los resultados representativos que muestran que los ratones expuestos ya sea CORT crónico o SDS reducen el número de selecciones de brazos de alta recompensa en comparación con los ratones de control en el entrenamiento de libre elección, complicando la interpretación de los resultados y / o retrasando o impidiendo la transición a las pruebas de barrera. Las barras son medias de SEM. *p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Estratificación de ratones machos y hembras expuestos al SNC en poblaciones susceptibles y resistentes.
(A) Esquema del paradigma experimental y de control del CNSDS. Esta cifra se reimprime desde Yohn et al. 2019²⁸. (B) CNSDS produce una estratificación robusta de ratones resistentes al SNCSDS (RES) y CNSDS-Susceptibles (SUS). Esta cifra se reimprime desde Yohn et al. 2019²⁸. Las barras son medias de seM. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Mientras que el paradigma crónico CORT proporciona una dosis constante de CORT en el agua potable, por experiencia puede haber cierta variabilidad en la cantidad consumida por ratones. Además, el consumo sólo puede evaluarse para la jaula total, y un promedio tomado en función del número de ratones en la jaula. Además, el derrame puede ocurrir al pesar las botellas, transferir los ratones para realizar pruebas de comportamiento o al cambiar a una jaula nueva. Sin embargo, el seguimiento del consumo de vehículos y CORT sigue siendo factible y preciso a lo largo de semanas de pruebas de tratamiento y comportamiento. Recomendamos encarecidamente cambiar a una botella fresca que contenga Vehículo o CORT una vez por semana, así como mantener horarios establecidos para pesar e intercambiar botellas. Por ejemplo, cambiar a botellas frescas al pesar y rellenar las botellas se puede hacer los lunes, y luego pesar y rellenar todas las botellas hechas de nuevo el jueves o el viernes. Del mismo modo, lo mejor es pesar todos los ratones al mismo tiempo en un día designado cada semana. Por último, es importante señalar que este paradigma CORT ruborca la producción endógena de corticosterona por el eje HPA. Por lo tanto, los ratones deben permanecer en CORT durante las pruebas conductuales hasta que sean sacrificados. Si los ratones son retirados de CORT, entonces pueden sufrir una crisis addisoniana de insuficiencia suprarrenal aguda. Los procedimientos alternativos han utilizado una exposición CORT de 2-3 semanas, seguida de un destete progresivo fuera del CORT y luego una ventana de prueba de comportamiento de aproximadamente 3-4 semanas a medida que los niveles endógenos de CORT vuelven a^{la normalidad 17,,19}.

En la tarea barrera del laberinto Y, es fundamental comenzar la habituación y el entrenamiento del laberinto inmediatamente después del protocolo SDS (Figura 2A). Una posible advertencia de esta línea de tiempo experimental es que los ratones son entrenados después de la manipulación en lugar de antemano, donde podrían dividirse por igual en función del rendimiento del entrenamiento. Sin embargo, en nuestra experiencia la formación antes en comparación con después de la administración de CORT no afecta significativamente el comportamiento instrumental¹⁶. Todos los ratones se entrenan a fondo y alcanzan el criterio (>70% de selección de brazos HR en sesiones de libre elección) antes de avanzar a las pruebas de barrera. Los ratones primero deben ser adecuadamente habituados al laberinto, por lo que se convierte en un aparato familiar, ya que hemos encontrado esto ayuda en la fase de entrenamiento posterior. Al entrenar cada ratón, es fundamental mantener los brazos de recompensa alta y baja diseñados para cada ratón individual, por lo que un ratón no atraviesa un brazo esperando 4 pellets y encontrando 2, o viceversa. Recomendamos mantener copias en papel y digitales de grandes archivos de datos sin procesar que indiquen los brazos de recompensa alta y baja contrapesos para todos los ratones Control y SDS.

No creemos que haya una diferencia en el rendimiento del laberinto debido a las especificaciones exactas de la forma del laberinto (laberinto Y versus T-maze), y creemos que los investigadores podrían utilizar ya sea en experimentos de comportamiento de elección relacionados con el esfuerzo. Además, previamente hemos reportado un ligero aumento en la selección de brazos HR a 15 cm en comparación con 10 cm en ratones administrados por vehículos²¹. Sin embargo, los investigadores deben esperar una selección de brazo HR similar o reducida a medida que la altura de la barrera aumenta más allá de 15 cm, ya que por los ratones de barrera de 20 cm rara vez seleccionan el brazo HR²¹.

Además, es importante utilizar un spray de etanol al 70% para limpiar el laberinto y eliminar los olores residuales después de cada sesión. También recomendamos ejecutar los ratones de manera coherente para que haya un intervalo de pruebas entre pruebas relativamente constante para todos los ratones. Sugerimos ciclismo aproximadamente 4-6 ratones a la vez, que debe dar un intervalo de unos 5 minutos. Por último, en la última sesión de libre elección, y en todas las sesiones de prueba de barrera, es importante registrar la latencia para seleccionar cualquiera de los brazos en todas las pruebas. Además, los ratones ocasionalmente logran saltar a la parte superior de las paredes del plexiglás, o más frecuentemente desde la parte superior de las barreras. Recomendamos adaptadores de pared de plexiglás más altos a lo largo de los lados del laberinto si esto ocurre. Pueden ser simplemente piezas rectangulares de plexiglás (ancho de 20 cm, longitud de 80 cm). Marcamos cualquier ensayo en el que un ratón no seleccione un brazo en 60 segundos o seleccione un brazo, pero no come los pellets de alimentos como un ensayo omitido. Por último, tanto la CORT crónica como la SDS pueden disminuir el peso corporal, lo que afecta a la cantidad de alimentos consumidos a lo largo de las semanas de prueba²¹. Los investigadores deben pesar regularmente los ratones y ajustar la cantidad de alimentos que se dan en la jaula doméstica para mantener a los ratones en aproximadamente el 90% de su peso corporal de alimentación libre.

Aquí también discutimos un paradigma desarrollado recientemente, el estrés crónico de la derrota social no discriminatoria (CNSDS) (Figura 5A), para inducir poblaciones susceptibles y resilientes al estrés en ratones masculinos y femeninos (Figura 5B). El paradigma del SNC puede ser utilizado por investigadores preclínicos interesados en el estrés o trastornos del estado de ánimo. En el paradigma del CNSDS es vital que las hembras experimentales sean atacadas al menos una vez por sesión. En casi todas las sesiones de derrota social los machos experimentales son atacados varias veces. Cada agresor de CD-1 debe ser rigurosamente examinado con ratones C57BL/6J masculinos y femeninos antes de comenzar el protocolo CNSDS, así como para registrar todos y cada uno de los ataques en cada sesión. Si bien describimos una condición de control sexual dual en la metodología del SNCS donde un hombre y una mujer interactúan, puede ser apropiado que algunos incluyan un macho adicional para estas interacciones de control, imitando así a los dos machos y a una hembra utilizados en el procedimiento del SNC. Este procedimiento de control alternativo no afecta al comportamiento de los ratones en los comportamientos de evitación²⁸. Además, se debe implementar una prueba de interacción social 24 horas después del protocolo de derrota de 10 días para garantizar la eficacia del método y para estratificar a los ratones masculinos y femeninos como resistentes o susceptibles al CNSDS²⁴.

Un problema en el uso del enfoque histórico de subdividir ratones en poblaciones resistentes y susceptibles basadas en la prueba de interacción social es que no todos los comportamientos de aversión se pueden medir con precisión mediante software de seguimiento de vídeo. Los ratones "resistentes" con una puntuación de interacción >1 pueden estar demostrando un comportamiento sumiso alrededor del contenedor que aloja el ratón CD1³¹. Es importante para el campo desarrollar un software que haga un mejor seguimiento de estos microconductos. Herramientas como el análisis del comportamiento simple (SimBA^32),que fue desarrollado por el laboratorio Golden para permitir clasificadores de comportamiento para comportamientos sociales complejos en roedores, pueden resultar útiles en este sentido.

Es posible que se produzca algún montaje durante el protocolo CNSDS. Si bien no hemos observado ningún embarazo en este paradigma, los investigadores deben ser conscientes de esta posibilidad.

Otra limitación de los protocolos de derrota social, incluyendo CNSDS, es la ventana de tiempo supuestamente limitada para investigar los efectos de estrés en el comportamiento después de completar las sesiones de derrota social. Por lo tanto, adaptamos los protocolos de barrera de laberinto existentes para adaptarse a todas las sesiones de habituación, entrenamiento y pruebas en un plazo de 30 días. Sin embargo, esto puede acelerar el entrenamiento general para algunos ratones, que pueden tener dificultades para alcanzar el criterio del 70% para la selección de brazo de alta recompensa necesaria para completar sesiones de libre elección (Figura 4). Además, hay días limitados disponibles para completar cualquier otra prueba de comportamiento sin una planificación adecuada. Sin embargo, estudios recientes indican que el estrés de la derrota social puede producir impactos más persistentes en el cerebro y el comportamiento. Los estudios del laboratorio de Miczek muestran que 10 días de estrés de derrota social pueden aumentar el consumo voluntario de alcohol en ratones que duran al menos 4 semanas^31,,33. Los protocolos de derrota social utilizan sesiones de derrota que duran entre 5 y 10 minutos. Utilizamos exposiciones de 5 minutos para el SNC para disminuir la probabilidad de lesiones en ratones experimentales C57BL/6J²⁸. El protocolo CNSDS produce resultados comparables en las hembras al protocolo de derrota social desarrollado por Newmann y sus colegas, en el que los ratones hembra C57BL/6J están expuestos a ratones suizos residentes^{de Weber 28.} Al igual que el SNC, esta variación del protocolo de derrota social utiliza 10 días de interacciones de 5 minutos para inducir un fenotipo de estrés crónico.

Estos métodos se pueden utilizar para examinar cómo el estrés crónico afecta el procesamiento de recompensas y la motivación en ratones. Tanto el procesamiento de recompensas, como los sujetos femeninos, están históricamente infraestudiados en el campo del trastorno del estado de ánimo preclínico. Los estudios futuros deben determinar el impacto del estrés crónico en la motivación de la recompensa masculina y femenina y estratificar los ratones resistentes frente a los ratones susceptibles (Figura 5B). Será valioso saber si esta estratificación produce diferentes efectos en el rendimiento de la barrera del laberinto Y como se ve en los comportamientos de evitación, como campo abierto, laberinto elevado-plus, y la alimentación suprimida por la novedad. Estudios futuros pueden combinar estas metodologías con otras técnicas, como la optogenética o la tecnología DREADDS, para examinar el circuito neural mediando la respuesta al estrés o la motivación de recompensa.

Los autores no tienen nada que revelar.

Los autores quieren agradecer a Thomas Grace por construir laberintos Y, barreras y jaulas de derrota social. Los autores quieren agradecer a Jay Lee, Karina Stech y Prachi Srivastava por su ayuda con la recopilación de datos. Este trabajo fue financiado por NIMH Grant R01 MH112861 (BAS).