Lo stress cronico sposta il comportamento di scelta correlato allo sforzo in un'attività di barriera del labirinto Y nei topi

Il compito di barriera Y-labirinto è un test di comportamento che esamina la motivazione a spendere sforzo per la ricompensa. Qui, discutiamo di testare più fattori di stress cronici ben convalidati tra cui corticosterone cronico e stress di sconfitta sociale con questo comportamento, così come il nuovo stress cronico non discriminatorio di sconfitta sociale (CNSDS), che è efficace nelle femmine.

I disturbi dell'umore, compreso il disturbo depressivo maggiore, possono essere precipitati da stress cronico. Il compito di barriera Y-laze è un test di scelta legato allo sforzo che misura la motivazione a spendere sforzo e ottenere ricompensa. Nei topi, l'esposizione cronica allo stress influisce significativamente sulla motivazione a lavorare per una ricompensa di valore superiore quando una ricompensa di valore inferiore è liberamente disponibile rispetto ai topi non stressati. Qui descriviamo il paradigma cronico dell'amministrazione del corticosterone, che produce un cambiamento nella risposta sforzosa nel compito della barriera del labirinto Y. Nel compito del labirinto Y, un braccio contiene 4 pellet di cibo, mentre l'altro braccio contiene solo 2 pellet. Dopo che i topi imparano a selezionare il braccio ad alta ricompensa, le barriere con altezza progressivamente crescente vengono introdotte nel braccio ad alta ricompensa durante più sessioni di test. Sfortunatamente, la maggior parte dei paradigmi di stress cronico (tra cui corticosterone e sconfitta sociale) sono stati sviluppati nei topi maschi e sono meno efficaci nei topi femminili. Pertanto, discutiamo anche dello stress cronico non discriminatorio della sconfitta sociale (CNSDS), un paradigma di stress che abbiamo sviluppato che è efficace sia nei topi maschi che in quello femminile. Risultati ripetuti con più fattori di stress cronici distinti nei topi maschi e femmine combinati con un maggiore utilizzo di attività comportamentali traslazione rilevanti aiuterà a far progredire la comprensione di come lo stress cronico può precipitare disturbi dell'umore.

Disturbi dell'umore come la depressione e l'ansia sono altamente prevalenti nella società di oggi. Decenni di lavoro hanno costantemente cercato trattamenti migliorati e modelli di roditori rilevanti per studiare questi disturbi complessi¹. Lo stress cronico è un fattore che contribuisce ai disturbi dell'umore come la depressione². Pertanto, i paradigmi di stress cronico come lo stress cronico da sconfitta sociale (SDS) e la somministrazione cronica di corticosterone (CORT) sono stati sviluppati nei topi maschi e sono ora ampiamente utilizzati per valutare gli effetti neurobiologici e comportamentali dell'esposizione cronica allo stress. I test comportamentali più utilizzati per valutare gli effetti di stress cronico includono compiti associati al comportamento di evitamento, come il labirinto elevato più, il campo aperto e l'alimentazione soppressa novità, o con l'efficacia antidepressiva, come il test di nuoto forzato. Tuttavia, questi comportamenti nei roditori probabilmente mancano di volto e, cosa più importante, di validità predittiva e rilevanza trassletica per disturbi umani come la depressione.

Un paradigma di stress cronico popolare, stress lieve cronico imprevedibile (CUMS), è stato convalidato ampiamente utilizzando comportamenti come la preferenza di saccarosio³. CUMS riduce la preferenza per una soluzione di saccarosio dell'1% rispetto all'acqua ed è storicamente interpretato come comportamento correlato all'anedonia^4,5. Tuttavia, questa riduzione della preferenza di saccarosio non è osservata negli esseri umani con disturbo depressivo^{maggiore 6,7}. Inoltre, la preferenza di saccarosio non consente lo studio della motivazione della ricompensa sforzosa.

Recentemente, alcune ricerche hanno spostato l'attenzione su altri comportamenti associati alla motivazione e alla^{ricompensa 8,9}. Questi compiti hanno un promettente valore traslazione perché valutazioni del comportamento relativamente simili possono essere condotte sia negli esseri umani che nei roditori. Qui, descriviamo i paradigmi CORT e SDS e i loro effetti in un compito comportamentale barriera Y-labirinto che misura la motivazione a sforzo per la ricompensa. Discutiamo poi di un nuovo paradigma di stress cronico che abbiamo sviluppato, lo stress cronico non discriminatorio della sconfitta sociale (CNSDS), che è efficace sia nei topi maschi che in quello femminile.

La somministrazione cronica di corticosterone (CORT) è un paradigma progettato per imitare lo stress cronico senza esposizioni effettive allo stress. L'attivazione dell'asse ipotalamo-pituitario-surenale da parte dello stress si traduce nel rilascio endogeno dello steroide surrenale cortisolo negli esseri umani^10,11,12 e corticosterone nei topi^13,14. La consegna di corticosterone attraverso l'acqua potabile di topi maschi adulti per almeno 4 settimane comporta risposte comportamentali disadattative in attività di prevenzione come campo aperto, elevato più labirinto, e l'alimentazione soppressa^{novità 10,11,12,13,14,15,16}. È interessante notare che CORT influisce anche sull'elaborazione delle ricompense nelle attività^{strumentali 16,17,18,19}. Il paradigma CORT qui descritto produce una concentrazione costante del siero inferiore a 100 ng/mL CORT, che è più di cinque volte inferiore a quella prodotta da un fattorino acuto come il nuoto forzato¹⁵. Pertanto, la somministrazione cronica di CORT è improbabile che causi ipercortisolemia. Mentre corT cronica è efficace solo nei topi maschi²⁰, abbiamo recentemente dimostrato che produce un robusto cambiamento nella risposta sforzosa nel compito barriera Y-labirinto²¹. Per la nostra conoscenza, questo è stato uno dei primi studi per esaminare gli effetti dello stress cronico su un comportamento di scelta legato allo sforzo nei topi maschi²¹. Uno studio precedente ha dimostrato per la prima volta l'impatto dello stress di moderazione acuta sul processo decisionale basato sullo sforzo nei ratti²². Nei comportamenti di scelta legati allo sforzo, un animale sceglie di esercitare uno sforzo per una ricompensa di alto valore o accettare una ricompensa di valore inferiore che è più liberamente disponibile. Negli esseri umani, la spesa di sforzo per il compito di premi (EEfRT), è un gioco per computer sviluppato per essere analogo ai compiti di scelta legati allo sforzo nei^{topi 23}. La depressione si traduce in risposte disadattative in EEfRT (diminuzione della probabilità di scegliere compiti difficili per premi di alto valore). Pertanto, i compiti di scelta relativi allo sforzo nei roditori sono particolarmente interessanti a causa della loro rilevanza traslazione.

Lo stress da sconfitta sociale cronica (SDS) è uno dei modelli di stress preclinico più ampiamente utilizzati nei topi maschi. Si tratta di un protocollo di 10 giorni in cui grandi, aggressivi maschi di allevamento in pensione CD-1 attaccano topi sperimentali, in genere C57BL/6J, in sessioni giornaliere 5 min²⁴. Questo produce un fenotipo comportamentale disadattativo robusto in un sottoinsieme di topi sperimentali. Un test di interazione sociale viene utilizzato per stratificare i topi in popolazioni resilienti o suscettibili allo stress da sconfitta, e diversi studi hanno usato questa caratteristica unica della SDS per sondare i meccanismi del circuito molecolare e neurale alla base della dipendenza dallo stress e della suscettibilità. Qui descriviamo i dettagli del paradigma CORT e la sua implementazione per l'attività comportamentale barriera Y-labirinto. Discutiamo anche degli effetti SDS nell'attività di barriera del labirinto Y. Il compito di barriera del labirinto Y si basa sul compito barriera T-labirinto, che viene utilizzato principalmente nei ratti per misurare la motivazione a spendere sforzo per premi alti o bassi presenti nei due bracci del labirinto^8,9,25. Questo compito è stato anche implementato per studiare la risposta sforzosa nei topi somministrati caffeina o dopamina antagonisti nei topi²⁶. I roditori possono spendere maggiore sforzo salendo barriere di altezza progressiva aumentando in un braccio del labirinto per un valore di ricompensa più alto, in genere 4 pellet di ricompensa, o spendere significativamente meno sforzo nell'altro braccio del labirinto per ricevere solo 2 pellet ricompensa⁹. I paradigmi di sconfitta sociale di 10 giorni producono un robusto fenotipo maladaptivo nei topi suscettibili che dura circa 30 giorni, quindi abbiamo modificato il compito della barriera del labirinto Y per addestrare e testare più rapidamente gli animali al fine di completare tutti gli esperimenti entro questo periodo di 30 giorni²⁴. Pertanto, qui dettagliamo anche un protocollo di attività comportamentale barriera Y-labirinto contenente sessioni di allenamento condensato e sessioni di test a barriera singola per misurare la motivazione a spendere sforzo per la ricompensa in topi esposti allo stress cronico.

Sfortunatamente, sia il corticosterone cronico che lo stress cronico della sconfitta sociale sono stati sviluppati nei topi maschi e sono meno efficaci nei topi femminili. Questo è altamente problematico come le donne sono più probabilità rispetto agli uomini per essere diagnosticati con disturbi dell'umore come la depressione¹. Adattamenti intelligenti alla SDS hanno permesso l'uso nei topi femminili, ma richiedono interventi chirurgici difficili o noiosa raccolta delle urine^26,27. Recentemente abbiamo descritto una semplice modifica al paradigma SDS, chiamata stress cronico non discriminatorio della sconfitta sociale (CNSDS). CNSDS consente una stratificazione suscettibile e resiliente di topi maschi e femmine^{sperimentali 28}. Sia i topi sensibili alle donne che i topi maschi esposti al CNSDS mostrano una maggiore evitamento delle braccia aperte nel labirinto elevato e del centro in campo aperto e mostrano una maggiore latenza da mangiare nell'alimentazione soppressa delle novità. CNSDS è anche più efficiente di altre modifiche a SDS, come entrambi i sessi sono combinati in sessioni di sconfitta. Ciò si traduce in un aumento della resa di topi sperimentali senza un aumento associato di tempo e fatica necessari per completare il protocollo. Pertanto, concludiamo questo manoscritto con una presentazione approfondita di questo paradigma di stress cronico recentemente sviluppato.

Questi esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida niD per la cura degli animali di laboratorio e approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali istituzionali della Rutgers University.

1. Corticosterone cronico (CORT)

1. Assegnare casualmente i topi ai gruppi di trattamento. Dividere casualmente i topi maschi adulti C57BL/6J in gruppi Vehicle e Corticosterone (CORT).
   1. Topi domestici in gabbie distinte e topi CORT in altri, poiché il loro trattamento viene fornito tramite la bottiglia d'acqua della gabbia.
   2. Etichettare speciali carte d'acqua da inserire nella gabbia che notifica al personale di cura degli animali che le bottiglie d'acqua contengono le soluzioni necessarie per l'esperimento.
2. Fare una soluzione veicolo sciogliendo 3.375 g di beta-ciclodextrin in 750 mL di acqua del rubinetto in un contenitore di vetro a vite di taglia 1 L.
   1. Riempire le bottiglie d'acqua della gabbia del veicolo con questa soluzione. Assicurarsi che la bottiglia non perdite per misurare il consumo di liquido.
   2. Etichettare il contenitore e conservare a temperatura ambiente sullo scaffale in laboratorio. Utilizzare la soluzione del veicolo per riempire le bottiglie di gabbia per circa 1 settimana.
   3. Ricarica le bottiglie dei veicoli per tutta la settimana. Riempire le bottiglie di gabbia 1x-2x durante la settimana, se necessario. Passare a una bottiglia fresca 1x a settimana sia all'inizio che alla fine della settimana.
      NOTA: Dopo una settimana, la betaciclopedia inizierà a rivestire l'interno della bottiglia d'acqua e rende la soluzione torbide.
   4. Monitorare la quantità di liquido consumato due volte a settimana e registrare. Pesare ogni bottiglia rispettiva e registrare, attenzione a non versare alcun liquido. Ricaricare e restituire ogni bottiglia.
      NOTA: Una gabbia di 5 topi beverà 80-120 mL di liquido in 3-4 giorni.
3. Rendere la soluzione CORT sciogliendo prima 3.375 g di beta-ciclodextrin in 750 mL di acqua del rubinetto in un contenitore di vetro a vite di taglia 1 L. Quindi aggiungere 26.25 mg di corticosterone.
   1. Soluzione Sonicate CORT per sciogliere CORT in acqua. Mettere il contenitore in un bagno ad ultrasuoni più pulito. Sonicate a 40 kHz per circa 30 min o fino a quando il corticosterone è sciolto e liquido appare chiaro.
      NOTA: Gli omogeneizzatori ad ultrasuoni (in stile punta) sono efficaci anche per la dissoluzione del CORT.
   2. Riempire le bottiglie d'acqua per tutte le gabbie CORT con soluzione. Contenitore etichetta e conservare a temperatura ambiente su scaffale in laboratorio. Soluzione CORT può essere utilizzato per riempire le bottiglie di gabbia per circa 1 settimana.
      NOTA: Utilizzare bottiglie d'acqua di vetro marrone o bottiglie di plastica opache, in quanto CORT è sensibile alla luce.
   3. Monitorare la quantità di liquido consumato due volte a settimana e registrare. Pesare ogni settimana tutti i topi del veicolo e del CORT per confrontare il liquido consumato con il peso dei topi all'interno di ogni gabbia.
   4. Per determinare il volume del liquido consumato (mL/g/giorno), utilizzare la seguente equazione:
      (Gabbia di volume bevuta negli ultimi 3-4 giorni) / (Peso corporeo medio dei topi nella gabbia) X numero di giorni da quando il veicolo o la bottiglia CORT è stata riempita di nuovo)
      NOTA: Una gabbia media di n.5 topi maschi maschi C57BL/6J consumerà in media 0,25 – 0,30 mg/g/giorno, che in genere rimane coerente attraverso i periodi di tempo ad libitum e privi di cibo. Queste concentrazioni si trasfo in dosi approssimative di 24 mg/kg/giorno beta-ciclodextrin e 9,5 mg/kg/giorno CORT^15,16.
4. Stress da sconfitta sociale (SDS)
   1. Utilizzare i protocolli di stress di sconfitta sociale standard come descritto in profondità^{altrove 24,29}.
5. Attività barriera Y-Labirinto
   1. Privazione alimentare per il compito della barriera del labirinto Y
      1. Il giorno dopo aver completato il test di interazione sociale, pesare tutti i topi di controllo e sperimentale. Questo sarà il loro peso corporeo di alimentazione libera.
         NOTA: Qui usiamo "Control" e "Experimental" per fare riferimento sia ai topi SDS Control che SDS Experimental, così come ai topi con somministrazione di veicoli e CORT nei rispettivi paradigmi SDS e CORT.
      2. Per privare il cibo i topi, rimuovere solo il chow da laboratorio dal lato C57BL/6J di ogni gabbia.
      3. Pesare tutti i topi, così come la quantità di chow di laboratorio che verrà somministrato ogni giorno, al fine di mantenere correttamente il peso corporeo a circa il 90% del peso di alimentazione libera durante il test.
         NOTA: La quantità di cibo consegnato nella gabbia di ogni topo o mouse dipenderà dal peso corporeo fluttuante e dalla quantità di pellet di ricompensa consumati in ogni giorno di allenamento o test nel labirinto Y.
      4. Stabilisci familiarità con i pellet di ricompensa. Scaricare un piccolo misurino di 20 mg di pellet alimentari a base di grano (Bio-Serv) nella gabbia di casa. Questo stabilirà familiarità con i pellet e motiverà i topi a consumarli nel labirinto Y nelle sessioni di allenamento iniziale e di habituating.
6. Apparecchio Y-labirinto
   1. Costruire una struttura A-labirinto di plexiglas di larghezza 3/16" di larghezza, con tre bracci di 26 cm di lunghezza, 20 cm di altezza e 7 cm di larghezza.
   2. Utilizzare divisori che scivolano tra gli slot nel labirinto Y per consentire a un ricercatore di chiudere la casella di partenza in cui i topi sono posizionati inizialmente, o per contenere il mouse in entrambi i braccio una volta che hanno selezionato ed inserito le braccia sinistra o destra del labirinto Y.
   3. Creare più barriere da 10, 15 e 20 cm di altezza del labirinto Y dalla rete metallica per il lato verticale e con plexiglas ad un angolo di circa 45 gradi sul lato posteriore angolato. Questo permette ai topi C57BL/6J di afferrare e salire il lato della rete metallica verticale di ogni barriera, per poi attraversare il lato plexiglas angolato della barriera.
      1. Aggiungere gradini sottili sul lato angolato per consentire una maggiore trazione.
7. Assunti del labirinto Y
   1. Assunte tutti i topi di controllo e sperimentale all'apparato Y-laze.
      1. Il giorno dopo la privazione di cibo, inserire un gran numero di pellet alimentari a base di grano 20 mg (ad esempio, Bio-Serv) nel tappo di un tubo di centrifuga di 50 mL e posizionare alle estremità di ogni braccio del labirinto Y. Questi tappi servono come piccoli recipienti alimentari per i topi, e i topi impareranno facilmente a mangiare i pellet di cibo.
      2. Posizionare ogni mouse nella casella iniziale del labirinto Y con il divisore della casella iniziale in posizione.
      3. Dopo alcuni secondi, rimuovere il divisore, permettendo ad ogni mouse di esplorare il labirinto Y per 15 minuti. Questa quantità di tempo permette al mouse di esplorare adeguatamente tutte le braccia del labirinto e di stabilire familiarità con l'apparato.
         NOTA: Alcuni topi non possono consumare pellet di cibo in questo primo giorno di assu usbazione.
   2. Il giorno seguente, completare un secondo 15 min Y-labirizione utilizzando una procedura identica.
      1. Si noti tutti i topi che non hanno mangiato pellet. Per questi topi, butta un altro piccolo misurino di pellet nelle loro gabbie di casa.
8. Y-labirinto di formazione a scelta forzata
   1. Designare il braccio ad alta ricompensa (HR) e a bassa ricompensa (LR) per ogni mouse.
      1. Assegnare casualmente i topi in entrambi i gruppi Di controllo e Sperimentale il braccio sinistro come braccio ad alta ricompensa (HR) e il braccio destro come braccio a bassa ricompensa (LR), o viceversa. Così, 4 pellet saranno disponibili in ogni prova a sinistra, braccio HR, e 2 pellet disponibili a destra, braccio LR, o l'opposto.
      2. Controbilanciare questi bracci LR e HR designati sia nel gruppo Control che in Experimental in modo che circa la metà di ogni gruppo avesse il braccio sinistro come braccio HR e la metà avesse il braccio destro come braccio HR.
   2. Prove a scelta forzata
      1. Dopo i 2 giorni di assullazione del labirinto Y, i topi iniziano 3 giorni di 10 prove di allenamento a scelta forzata.
      2. Per ogni prova a scelta forzata, posizionare il mouse nella casella di avvio, quindi rimuovere il divisore, consentendo al mouse 60 s di entrare nel braccio sinistro o destro e consumare i pellet disponibili. Per ogni blocco di prova a scelta forzata dal braccio opposto con il divisore, costringendo il mouse a selezionare l'altro braccio. Per una prova a scelta forzata HR, bloccare l'accesso al braccio LR o viceversa.
      3. Rimuovere il mouse dopo la prova e ricostituire i rispettivi pellet che sono stati mangiati.
      4. Prove a scelta forzata alternativa per ogni mouse in ogni giorno di allenamento, in modo che i topi completino 5 prove HR e 5 LR a scelta forzata.
         NOTA: Le prove a scelta forzata allenano i topi ad associare un braccio alla ricompensa più alta e l'altro alla ricompensa inferiore.
      5. Mettere il mouse nella sua gabbia di casa e poi eseguire non più di 3-5 topi successivi al fine di mantenere un intervallo intertriale di 5 minuti per ogni topo.
9. Y-labirinto formazione a scelta libera
   1. Prove a scelta libera
      1. Inizia ogni sessione a scelta libera con una prova a scelta forzata HR e LR. Così, i topi avranno sperimentato di essere costretti in ogni braccio prima di iniziare 10 prove di libera scelta.
      2. Posizionare ogni mouse nella casella di avvio e rimuovere il divisore. Una volta che il mouse ha selezionato un braccio e lo ha attraversato fino alla fine dove si trova la coppa contenente i pellet, posizionare il divisore del braccio in posizione su quel lato, bloccando il mouse fino a quando non ha consumato i pellet.
      3. Rimuovere il mouse nella sua gabbia di casa ed eseguire i successivi 3-5 topi utilizzati in quel ciclo per consentire un intervallo di prova inter-prova di 5 minuti.
   2. Registrare i seguenti dati: latenza per scegliere un braccio, selezione del braccio e latenza per raggiungere la tazza di pellet.
      1. Registrare quale braccio entra il mouse e attraversa completamente la coppa di pellet. Registrare anche la latenza per selezionare quel braccio e raggiungere la coppa di pellet.
      2. Considerare qualsiasi prova in cui un mouse non riesce a selezionare un braccio o non consuma tutti i 4 o 2 pellet come prova omessa.
   3. 70% criterio di libera scelta
      1. Registrare il braccio selezionato ogni giorno per tutte le 10 prove a scelta libera.
      2. Una volta che un mouse ha selezionato il braccio HR su 7 delle 10 prove in un giorno di allenamento a scelta libera (criterio 70%), spostare il mouse sulle sessioni di test di barriera.
         NOTA: continuare l'allenamento a libera scelta fino a quando tutti i topi non raggiungono il criterio del braccio HR del 70% per garantire sia un'adeguata discriminazione delle braccia HR e LR e che i topi dimostrino la stessa preferenza per il braccio HR.
10. Test della barriera del labirinto Y
    1. Sessione di prova di barriera da 10 cm
       1. Posizionare la barriera di 10 cm a metà del braccio HR nel labirinto Y.
       2. Inizia con più prove a scelta forzata per entrambe le braccia. I topi resistenti all'arrampicata sulla barriera possono essere spinti con un lungo e sottile pezzo di plexiglas.
          NOTA: Per esperienza, consigliamo almeno 2 prove a scelta forzata per i bracci HR e LR all'inizio di ogni sessione ad una nuova altezza di barriera. Si consiglia di registrare le prove in cui è necessario richiedere al mouse di scavalcare la barriera se necessario. I topi generalmente imparano a scavalcare la barriera dei 10 cm, che non è così alta che non possono stare in piedi e vedere su di essa, entro le prove 1-2. La barriera dovrà essere posizionata sull'altro lato per i topi con il braccio opposto come braccio HR designato.
       3. Posizionare ogni mouse nella casella di avvio, rimuovere il divisore e lasciare che il mouse attraversi il labirinto e selezionare un braccio per 10 prove a scelta libera contenenti la barriera di 10 cm nel braccio HR.
       4. Se il mouse sceglie il lato HR, si scavalcare la barriera al fine di ottenere la maggiore ricompensa, i 4 pellet. In caso contrario, selezionerà il braccio LR e semplicemente attraversare il pavimento del labirinto per la ricompensa minore, 2 pellet.
       5. Registrare il braccio selezionato e la latenza per selezionare un braccio e raggiungere la coppa di pellet per tutte le prove. Allo stesso modo ruotare 4-6 topi totali per ciclo, per mantenere un intervallo di prova inter-prova di 5 minuti.
          NOTA: Spruzzare il 70% di etanolo nel labirinto Y e asciugare in modo coerente e tra ogni topo.
    2. Sessione di prova di barriera da 15 cm
       1. Il giorno seguente completa tutti i passaggi elencati come sopra (passo 1.10.1), ma con la barriera alta 15 cm nel braccio HR.
    3. Sessione di prova di barriera da 20 cm
       1. Il giorno successivo completare tutti i passaggi elencati come sopra (passo 1.10.1), ma con la barriera di 20 cm di altezza nel braccio HR.
          NOTA: Per esperienza, per l'altezza della barriera di 20 cm la maggior parte dei topi SDS suscettibili o CORT Sperimentale (e anche diversi topi di controllo) sposterà le loro risposte al braccio LR, in quanto non sono abbastanza motivati da scavalcare l'alta barriera di 20 cm. Inoltre, potrebbe essere necessario utilizzare adattatori in plexiglas per evitare che i topi si aggrezzino dalla cima di questa barriera sui bordi delle pareti del labirinto Y. Si ssiglia di costruire un labirinto Y più alto, in quanto diventa più difficile per lo sperimentatore riempire i pellet in ogni tazza e rimuovere i topi dopo ogni prova.
    4. Sessione di test di discriminazione ricompensa
       1. Per garantire che sia i topi di controllo che i topi sperimentali siano a leva adeguate e simili di discriminazione della ricompensa, condurre una sessione di test di discriminazione.
       2. Seguire tutti i passaggi precedenti (passaggio 1.10.1) ma posizionare una barriera di 10 cm nel braccio LR. Ora, entrambi i bracci contengono barriere di 10 cm, e i topi dovranno scavalcare sia per ottenere la ricompensa di 4 o 2 pellet.
       3. Registrare la latenza e la selezione del braccio per tutte le 10 prove.
          NOTA: Poiché i topi dovranno spendere lo stesso sforzo per ottenere una delle due ricompense, i topi dovrebbero selezionare il braccio HR nella maggior parte delle prove. Per esaminare le latenze per selezionare il braccio HR e LR, calcolare una latenza media del braccio HR e una latenza media del braccio LR per ogni singolo mouse. Quindi, confrontare la latenza per selezionare entrambi i bracci utilizzando un ANOVA misto a due metodi, con SDS (Control, SDS-Susceptible, SDS-Resilient) come fattore tra soggetti e braccio (braccio HR, braccio LR) come fattore interno.Then, compare latency to select both arms using a two-way mixed ANOVA, with SDS (Control, SDS-Susceptible, SDS-Resilient) as the between-subjects factor, and arm (HR arm, LR arm) as the within-subjects factor.

2. Stress cronico da sconfitta sociale non discriminatoria (CNSDS)

1. Schermo per un comportamento aggressivo nei mouse CD-1
   1. Mettere un topo maschio e una femmina C57BL/6J nella gabbia di ogni CD-1 per 180 s o fino a quando il CD-1 attacca entrambi i topi. Questi topi C57BL6/J non hanno bisogno di essere ingenui e non saranno utilizzati in altri esperimenti. Durante questa fase di screening dell'aggressore, non cohouse topi C57BL/6J con topi CD-1.
      1. Latenza record per attaccare entrambi i mouse C57BL/6J per ogni CD-1.
      2. Seleziona tutti gli aggressori CD-1 che attaccano i topi maschi e femmine C57BL/6J entro 60 secondi in sessioni consecutive su un totale di 3 sessioni di screening. Altri possono essere utilizzati per il co-housing in gabbie per la casa.
         NOTA: Un importante avvertimento della sconfitta sociale è la presenza di ferite come conseguenza dell'aggressione fisica. Ogni topo nelle fasi di screening e di screening deve essere controllato per le ferite e trattato con disinfettante cloro-esano se sono presenti piccole lesioni cutanee. Qualsiasi topo con una ferita superiore a 1 cm deve essere rimosso dall'esperimento.
2. Assegnare i topi ai gruppi di controllo e sperimentali.
   1. Raccogliere tutti i topi adulti C57BL/6J maschi e femmine ingenui, così come gli allevatori di CD-1 maschi in pensione, così come i maschi CD-1 da utilizzare nel co-housing.
      1. Assegnare casualmente topi adulti maschi e femmine C57BL/6J per controllare o condizioni sperimentali. Ogni maschio e ogni femmina saranno accoppiati per tutte le sessioni di sconfitta sociale nel gruppo sperimentale CNSDS. Maschi e femmine nel gruppo di controllo CNSDS ruoteranno ogni giorno.
      2. Assegnare i maschi CD-1 da utilizzare nelle sessioni di sconfitta sociale o essere co-alloggiati con i maschi e le femmine sperimentali dopo ogni sessione, che si alterneranno ogni giorno per ogni coppia di topi maschi e femmine C57BL/6J.
3. Stress cronico da sconfitta sociale non discriminatorio (CNSDS)
   1. Portare tutti i topi in una sala dedicata alla sconfitta sociale, compresi tutti i maschi CD-1, i topi C57BL/6J di controllo CNSDS e i topi C57BL/6J sperimentali del CNSDS.
      1. Allineare 4-6 gabbie di maschi CD-1 con maschi e femmine C57BL/6J con gabbie CD-1 nella parte anteriore e gabbie C57BL/6J dietro.
      2. Indicare con tag ID gabbia quale mouse viene attaccato e poi co-ospitato con quale CD-1 per garantire l'organizzazione di tutti i topi.
         NOTA: Dopo aver inizializzato gli esperimenti il primo giorno, i topi possono essere ruotati per le restanti 9 sessioni di sconfitta in modo che ogni coppia maschile e femminile C57BL/6J venga ruotata di una gabbia a sinistra per ogni sessione. Ciò consente una nuova interazione con i nuovi CD-1 in ogni sessione.
   2. Procedura di gruppo sperimentale CNSDS
      1. Mettere un maschio adulto e una femmina adulta C57BL / 6J topo nella gabbia di casa di ogni maschio aggressore CD-1 per una sessione di sconfitta sociale di 5 minuti.
      2. Registrare la latenza di attacco e la frequenza di attacco per i topi sperimentali C57BL/6J sia maschili che femminili.
      3. Dopo 5 minuti, rimuovere il topo maschio C57BL/6J e mettere in gabbia di cd-1 maschio co-ospitato, separati da una chiara, barriera plexiglas perforata. Separare l'attacco CD-1 e il topo C57BL/6J femmina con una barriera di plexiglas chiara e perforata simile. Si alternano se il topo C57BL/6J maschio o femmina è alloggiato con l'aggressore CD-1 ogni giorno.
         NOTA: Dopo ogni interazione giornaliera di 5 minuti ogni topo sarà valutato per le lesioni e le ferite trattate se inferiore a 1 cm. Qualsiasi ferita più grande di 1 cm comporterà la rimozione e l'eutanasia immediata del topo. Così, sia i topi sperimentali maschi che femmine sono co-alloggiati con l'aggressore CD-1 per 5 giorni e con il romanzo CD-1 non utilizzato nella sessione di attacco per i restanti 5 giorni. Le barriere chiare e perforate in plexiglas impediscono l'interazione fisica, ma consentono un contatto sensoriale con l'aggressore del CD-1 nelle 24 ore tra una sessione e l'altra. La lavaggio vaginale può essere eseguito su tutti i topi femmine circa 30 minuti dopo la sconfitta ogni giorno come descritto in precedenza²⁸.
   3. Procedura del gruppo di controllo CNSDS
      1. Posizionare una femmina di controllo nella gabbia di casa di un mouse C57BL/6J maschio di controllo.
      2. Dopo 5 minuti, separare i topi e posizionare un divisore di plexiglas chiaro e perforato tra i topi.
      3. Riportare i topi nella stanza della colonia e posizionarli su uno scaffale separato come gabbie sperimentali CNSDS. Nella stanza della colonia abbiamo scaffali designati dove i topi stressati sono alloggiati separatamente dagli altri topi nella stanza della colonia. Inoltre, gli effetti possono essere visti nei topi non stressati se hanno assistito all'aggressione in corso, come si vede nei paradigmi di sconfitta sociale per procura³⁰
      4. Si noti qualsiasi attacco o comportamento di montaggio durante ogni interazione di controllo.
   4. I topi maschi e femmine di controllo saranno introdotti in un nuovo conspecifico nei giorni successivi, come si fa nei tradizionali gruppi di controllo dello stress della sconfitta sociale. Completa 10 giorni consecutivi di sessioni di controllo e sperimentali cnSDS.
      1. Dopo aver completato la sessione 10^{th e} final Control o Experimental CNSDS, co-house tutti i topi e mantenere questo co-housing durante tutti i test comportamentali. Ogni gabbia sarà composta da 2 topi separati su entrambi i lati del divisore di plexiglass per consentire l'esposizione sensoriale. I topi di controllo sono alloggiati con altri topi di controllo del sesso opposto, mentre i topi sperimentali sono co-alloggiati con topi sperimentali di sesso opposto.
      2. Ogni femmina Control C57BL/6J è co-ospitata con il maschio Control C57BL/6J con cui ha interagito nella^10a sessione, con un chiaro divisore di plexiglass inserito nella gabbia per separare i due topi.
      3. Circa 24 ore dopo la sessione di sconfitta finale eseguire un test di interazione sociale standard per determinare se CNSDS riduce il comportamento sociale con un nuovo mouse CD-1 rispetto al controllo, e per stratificare i topi "resilienti" o "suscettibili" allo stress^24,29.
   5. Testare il controllo CNSDS e i topi maschi e femmine sperimentali in altri comportamenti, tra cui l'attività barriera del labirinto Y, e stratificare il gruppo CNSDS in gruppi CNSDS-Resilient e CNSDS-Susceptible.
4. Test di interazione sociale
   1. Configurazione iniziale per il test di interazione sociale
      1. 24 ore dopo l'ultima sessione di sconfitta del CNSDS, condurre un test di interazione sociale.
      2. Porta tutti i topi control e Experimental accoppiati, così come un nuovo maschio CD-1 non utilizzato nel paradigma CNSDS, in una stanza comportamentale separata per eseguire un test di interazione sociale.
      3. Impostare una camera standard a campo aperto (75 cm x 75 cm) sotto una telecamera di registrazione collegata a un software di monitoraggio comportamentale (ad esempio, EthoVision) in esecuzione su un computer dedicato.
      4. Impostare un nuovo esperimento con una zona di interazione sociale di 24 cm x 24 cm che circonda un contenitore di interazione (piccolo contenitore di plexiglas perforato di circa 10 cm x 10 cm x 10 cm) che orerà il romanzo CD-1 lungo una parete del campo aperto, nel secondo di 2 prove consecutive da 2,5 minuti. Così, una zona di interazione 7 cm di larghezza circonda il contenitore che ospita il nuovo mouse CD-1.
   2. Esecuzione di un mouse nel test di interazione sociale
      1. Posizionare ogni mouse in un angolo lontano del campo aperto per una prova di 2,5 minuti senza CD-1 presente e avviare il programma software di registrazione.
         NOTA: tenere presente che il contenitore di interazione deve essere posizionato al centro di una parete del campo aperto e non contiene alcun mouse CD-1 per questa prima prova.
      2. Dopo 2,5 minuti, rimuovere il mouse nella sua gabbia di casa. Pulire il campo aperto con il 70% di etanolo.
      3. Posizionare il nuovo maschio CD-1 in un secondo cubo di plexiglas perforato lungo il centro di una parete del campo aperto.
      4. Ancora una volta, posizionare il mouse in un angolo del campo aperto per una seconda prova di 2,5 minuti, ora con il CD-1 presente, e avviare il programma software di registrazione.
      5. Rimuovere il mouse e rimilo nella sua gabbia di casa. Rimuovere il CD-1 e rimilo nella sua gabbia di casa. Pulire il campo aperto con il 70% di etanolo.
   3. Eseguire il controllo CNSDS rimanente e topi sperimentali e calcolare il rapporto di interazione.
      1. Ripetere questa procedura con tutti gli altri topi per quantificare il tempo trascorso nella zona di interazione sia nello studio 1 che nella prova 2 per ogni controllo CNSDS e mouse sperimentale.
      2. Per calcolare un rapporto di interazione, confrontare il tempo trascorso nella zona di interazione sociale nella prova 2 (CD-1 presente) rispetto allo studio 1 (CD-1 assente), utilizzando la seguente equazione:
         Rapporto di interazione (tempo nella zona di interazione nella prova 2)/(tempo nella zona di interazione nella prova 1)
   4. Stratificare i topi come "CNSDS-Resilient" o "CNSDS-Susceptible". I topi resilienti hanno un rapporto di interazione di > 1,0, mentre i topi sensibili hanno un rapporto di interazione di <
      1. Nelle successive misure comportamentali come l'attività di barriera del labirinto Y o altri test di comportamento, suddividere i topi sperimentali CNSDS in questi fenotipi sensibili al CNSDS e al CNSDS.
      2. Così, per le femmine, anOVA unifacirsi possono essere condotti tra CNSDS Control, CNSDS Experimental-Resilient, e CNSDS Experimental-Susceptible gruppi, con confronti post-hoc per determinare le differenze tra i gruppi, se del caso.
      3. Per i confronti di differenza di sesso, condurre ANOVA a due senso con CNSDS (Controllo, Resiliente, Suscettibile) e Sesso (Maschio, Femmina) come fattori tra soggetti. Utilizzare i confronti post-hoc, se appropriato.

Il CORT cronico è stato somministrato per 4 settimane seguito dall'addestramento e dai test sulla barriera del labirinto Y (Figura 1A). In una coorte separata, il paradigma SDS di 10 giorni è stato seguito allo stesso modo da formazione e test nell'attività di barriera del labirinto Y (Figura 1C), per determinare l'effetto di questi paradigmi di stress cronico sul comportamento di scelta correlato allo sforzo nei topi maschi. CorT cronico e SDS hanno ridotto il peso corporeo medio rispetto ai topi vehicle e ai topi SDS Control, come determinato dai test t( Tabella1). Questi topi hanno anche consumato meno tempo medio di chow di laboratorio in gabbia durante i test (Tabella 1).

Nella coorte CORT, un ANOVA misto con CORT come fattore tra soggetti e settimana come fattore all'interno dei soggetti indica che i topi somministrati a Vehicle e CORT hanno consumato un volume simile di liquido in 4 settimane di trattamento più 3 settimane di test comportamentali (7 settimane totali)(Figura 1B). Nella coorte SDS, i maschi di controllo e sperimentale hanno completato 10 giorni del protocollo SDS e sono stati valutati per la suscettibilità al protocollo SDS utilizzando un test di interazione sociale in cui il tempo trascorso interagendo con un nuovo maschio CD-1 è stato confrontato con il tempo nella zona di interazione senza il CD-1^{presente 24}. Un ANOVA univo ha indicato che SDS produce un fenotipo maladaptivo nei topi suscettibili (60%), rispetto ai topi resilienti (40%) o Mouse di controllo non esposti a SDS (Figura 1D). In particolare, i topi SDS-Susceptible mostrano una riduzione del tempo trascorso nella zona di interazione contenente un nuovo mouse CD-1, rispetto ai mouse SDS-Resilient e Control.

Quindi, abbiamo addestrato entrambe le coorti CORT (Experimental and Control mice) e SDS (Susceptible and Control) nell'attività Y-laze barrier (Figura 2A). Abbiamo misurato il numero di prove che i topi di controllo e sperimentale avrebbero speso per scalare una barriera per una ricompensa di 4 pellet, contro la scelta dell'altro braccio del labirinto Y che conteneva solo 2 pellet ma non presentava alcuna barriera da scalare. Per SDS, un ANOVA misto a due metodi, con SDS (Control, SDS-Susceptible, SDS-Resilient) come fattore tra soggetti e braccio (braccio HR, braccio LR) come fattore interno ai soggetti è stato utilizzato per esaminare la risposta sforzosa nel labirinto Y. Per CORT cronica, un ANOVA misto a due senso, con somministrazione CORT (Veicolo, CORT) come fattore tra soggetti e braccio (HR, braccio, braccio LR) come fattore interno. Sia corT cronico e SDS ha prodotto uno spostamento nella risposta sforzo quando l'altezza della barriera è aumentata a 15 cm e a 20 cm (Figura 2B e Figura 2C). Nessuno dei due si è spostato quando solo una barriera di 10 cm era nel braccio HR. Inoltre, in una sessione di discriminazione ricompensa dopo il test, tutti i topi hanno risposto in modo simile per il braccio HR quando una barriera di 10 cm è stata posta in entrambi i bracci HR e LR. Infine, gli ANOVA a due corsie con CORT o SDS come fattore tra soggetti e braccio HR o LR come fattore interno rivelano che la latenza del braccio HR e LR con la barriera di 15 cm non è stata influenzata dall'amministrazione CORT ed è stata simile per entrambi i gruppi con bracci LR e HR(Figura 3). Così, CORT cronico e SDS robustamente spostare sforzo risposta nel compito barriera Y-labirinto nei topi maschi.

È importante sottolineare che, se il CORT cronico o SDS compromettono l'apprendimento dell'attività di barriera del labirinto Y (Figura 4), questi topi potrebbero non riuscire a raggiungere il criterio nelle sessioni di allenamento a scelta libera, influenzando la successiva interpretazione dei risultati delle barriere. Pertanto, mostriamo risultati rappresentativi potenzialmente negativi che mostrano questa differenza, valutati utilizzando campioni indipendenti separati t-test (Figura 4).

La procedura CNSDS produce un fenotipo maladaptivo robusto sia nei topi suscettibili C57BL/6J maschili che femminili (Figura 5A). Un'attività di interazione sociale viene utilizzata per stratificare i topi in resilienti (38,3%) e suscettibile (61,7%) popolazioni (Figura 5B), che possono essere ulteriormente suddivise per sesso (maschi: 43,3% resilienti, 56,7% suscettibili; femmine: 36,7% resilienti, 63,3% suscettibili), utilizzando ANOVa univi tra CNSDS Control, CNSDS Experimental-Resilient e CNSDS Experimental-Susceptible groups. Mentre questo paradigma modificato produce effetti maladaptive simili a SDS nei comportamenti di^{prevenzione 28}, deve ancora essere implementato in combinazione con test comportamentali relativi alla ricompensa e alla motivazione rilevanti traslazionalmente, come l'attività di barriera del labirinto Y. È essenziale che studi futuri valutino gli effetti di fattori di stress come il CNSDS su comportamenti traslazionali rilevanti come il compito della barriera del labirinto Y sia nei maschi che nelle femmine.

Tabella 1: Peso corporeo e quantità di cibo fornito quotidianamente. I topi con veicolo e CORT, così come i topi Control e SDS sono stati pesati settimanalmente e la quantità di cibo somministrato è stata registrata. Peso corporeo medio (g) attraverso il test del labirinto Y, e il cibo medio (g) dato sono indicati.

Figura 1: SDS induce un fenotipo depressivo caratterizzato da un'interazione meno sociale.
(A) Schematico che rappresenta la sequenza temporale per i protocolli di barriera CORT e Y-laze. (B) Dati rappresentativi che mostrano il volume consumato (mL/g/giorno) nei topi con veicolo e corT. (C) Schematico che rappresenta la sequenza temporale per i protocolli di barriera SDS e Y-laze. (D) In un test di interazione sociale rappresentativo, i topi SDS Susceptible mostrano un tempo ridotto trascorso interagendo con un nuovo mouse rispetto ai topi SDS Resilient o Control. Le barre sono mediate: SEM. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: CORT e SDS si spostano in modo semplice in un'attività di barriera del labirinto Y.
(A) Sequenza temporale dell'attività barriera del labirinto Y per CORT e SDS. (B) CorT cronico riduce la selezione del braccio HR a 15cm e 20cm altezze barriera. Questa cifra è stata modificata da Dieterich et al. 2020²¹. (C) Risultati rappresentativi che dimostrano che i topi SDS-Susceptible riducono la selezione del braccio HR ad altezze di barriera di 15 cm e 20 cm, rispetto ai topi control o SDS-Resilient. Le barre sono mediate: SEM. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: La latenza del labirinto Y non è influenzata da CORT cronico.
CorT cronico non influisce sulla latenza per selezionare i bracci LR o HR nel labirinto Y. Inoltre, sia i topi Vehicle che CORT selezionano il braccio LR o HR con latenze simili. Questa cifra viene ristampata da Dieterich et al. 2020²¹. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: CorT cronico e SDS compromette la selezione del braccio HR a scelta libera.
I risultati rappresentativi mostrano che i topi esposti a CORT o SDS cronici riducono il numero di selezioni di braccio ad alta ricompensa rispetto ai topi di controllo nell'allenamento a scelta libera, complicando l'interpretazione dei risultati e/o ritardando o impedendo la transizione ai test di barriera. Le barre sono mediate: SEM. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Stratificazione dei topi maschi e femmine esposti al CNSDS in popolazioni sensibili e resilienti.
(A) Schematico del paradigma sperimentale e di controllo cnSDS. Questa cifra è ristampata da Yohn et al. 2019²⁸. (B) CNSDS produce una robusta stratificazione dei topi CNSDS-Resilient (RES) e CNSDS-Susceptible (SUS). Questa cifra è ristampata da Yohn et al. 2019²⁸. Le barre sono la media : SEM. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Mentre il paradigma CORT cronico fornisce una dose corT costante nell'acqua potabile, per esperienza ci può essere una certa variabilità nella quantità consumata dai topi. Inoltre, il consumo può essere valutato solo per la gabbia totale e una media presa in base al numero di topi nella gabbia. Inoltre, la fuoriuscita può verificarsi quando si pesano le bottiglie, si trasferiano i topi per il test di comportamento o quando si cambia in una gabbia fresca. Tuttavia, il monitoraggio del consumo di veicoli e CORT è ancora fattibile e accurato in tutte le settimane di test di trattamento e comportamento. Consigliamo vivamente di passare a una bottiglia fresca contenente veicolo o CORT una volta alla settimana, oltre a mantenere i tempi impostati per pesare e scambiare bottiglie. Ad esempio, il passaggio alle bottiglie fresche durante la pesatura e la ricarica delle bottiglie può essere fatto il lunedì, quindi pesare e riempire tutte le bottiglie fatte di nuovo il giovedì o il venerdì. Allo stesso modo, è meglio pesare tutti i topi alla stessa ora in un giorno designato ogni settimana. Infine, è importante sottolineare che questo paradigma CORT smussa la produzione endogena di corticosterone dall'asse HPA. Pertanto, i topi devono rimanere su CORT durante i test comportamentali fino a quando non vengono sacrificati. Se i topi vengono tolti di CORT, allora possono soffrire di una crisi addisoniana di insufficienza surrenale acuta. Le procedure alternative hanno utilizzato un'esposizione CORT di 2-3 settimane, seguita dallo svezzamento progressivo fuori dal CORT e quindi da una finestra di test del comportamento di circa 3-4 settimane quando i livelli CORT endogeni tornano alla^{normalità 17,19}.

Nell'attività barriera del labirinto Y, è fondamentale iniziare l'assuedazione e la formazione del labirinto immediatamente dopo il protocollo SDS (Figura 2A). Un potenziale avvertimento di questa linea temporale sperimentale è che i topi sono addestrati seguendo la manipolazione piuttosto che in anticipo, dove potrebbero essere equamente divisi in base alle prestazioni di allenamento. Tuttavia, nella nostra esperienza di formazione prima contro dopo l'amministrazione CORT non influisce in modo significativo sul comportamento^{strumentale 16}. Tutti i topi sono addestrati a fondo e raggiungono il criterio (>70% selezione del braccio HR nelle sessioni a scelta libera) prima di passare ai test di barriera. I topi dovrebbero prima essere adeguatamente assunte al labirinto, quindi diventa un apparato familiare, come abbiamo trovato questo aiuta nella fase di allenamento successiva. Quando si allena ogni mouse, è fondamentale mantenere i bracci di ricompensa alta e bassa progettati per ogni singolo mouse, in modo che un mouse non attraversi un braccio aspettando 4 pellet e trovando 2, o viceversa. Si consiglia di tenere sia cartacee che digitali copie di file di dati grezzi di grandi dimensioni che indicano i bracci ad alta e bassa ricompensa controbilanciati per tutti i mouse Control e SDS.

Non crediamo che ci sia una differenza nelle prestazioni del labirinto a causa delle specifiche esatte della forma del labirinto (Y-laze versus T-maze), e crediamo che i ricercatori potrebbero utilizzare sia in esperimenti comportamentali di scelta legati allo sforzo. Inoltre, in precedenza abbiamo segnalato un leggero aumento nella selezione del braccio HR a 15 cm rispetto ai 10 cm nei topi somministrati dal^{veicolo 21}. Tuttavia, i ricercatori dovrebbero aspettarsi una selezione del braccio HR simile o ridotta in quanto l'altezza della barriera aumenta oltre i 15 cm, poiché i topi barriera di 20 cm raramente selezionano il braccio HR²¹.

Inoltre, è importante utilizzare uno spray al 70% per pulire il labirinto e rimuovere gli odori residui dopo ogni sessione. Si consiglia inoltre di eseguire i topi in modo coerente in modo che ci sia un intervallo di prova relativamente costante per tutti i topi. Suggeriamo di andare in bicicletta circa 4-6 topi alla volta, il che dovrebbe dare un intervallo di circa 5 minuti. Infine, nell'ultima sessione di libera scelta e in tutte le sessioni di test di barriera, è importante registrare la latenza per selezionare entrambi i braccio in tutte le prove. Inoltre, i topi riescono occasionalmente a saltare in cima alle pareti di plexiglas, o più frequentemente dalla cima delle barriere. Consigliamo adattatori a parete in plexiglas più alti lungo i lati del labirinto, se ciò si verifica. Questi possono essere semplicemente pezzi rettangolari di plexiglas (larghezza di 20 cm, lunghezza di 80 cm). Segnamo qualsiasi prova in cui un mouse non riesce a selezionare un braccio entro 60 secondi o seleziona un braccio ma non mangia i pellet di cibo come una prova omessa. Infine, sia CORT cronica e SDS può diminuire il peso corporeo che influisce sulla quantità di cibo consumato attraverso settimane di test²¹. I ricercatori dovrebbero pesare regolarmente i topi e regolare la quantità di cibo somministrato nella gabbia di casa per mantenere i topi a circa il 90% del loro peso corporeo di alimentazione libera.

Qui si discute anche di un paradigma recentemente sviluppato, lo stress cronico di sconfitta sociale non discriminatoria (CNSDS) (Figura 5A), per indurre popolazioni sensibili allo stress e resilienti nei topi maschi e femmine (Figura 5B). Il paradigma CNSDS può essere utilizzato da ricercatori preclinici interessati a disturbi dello stress o dell'umore. Nel paradigma CNSDS è fondamentale che le femmine sperimentali siano attaccate almeno una volta per sessione. In quasi tutte le sessioni di sconfitta sociale i maschi sperimentali vengono attaccati più volte. Ogni aggressore CD-1 deve essere rigorosamente proiettato con topi C57BL/6J maschi e femmine prima di iniziare il protocollo CNSDS, oltre a registrare tutti gli attacchi in ogni sessione. Mentre descriviamo una condizione di doppio controllo sessuale nella metodologia CNSDS in cui un maschio e una femmina interagiscono, può essere appropriato per alcuni includere un maschio aggiuntivo per queste interazioni di controllo, imitando così i due maschi e una femmina utilizzati nella procedura CNSDS. Questa procedura di controllo alternativa non influisce sul comportamento dei topi nei comportamenti di prevenzione²⁸. Inoltre, un test di interazione sociale dovrebbe essere implementato 24 ore dopo il protocollo di sconfitta di 10 giorni per garantire l'efficacia del metodo e per stratificare i topi maschi e femmine come resilienti o suscettibili al CNSDS²⁴.

Un problema nell'usare l'approccio storico di sottodividere i topi in popolazioni resilienti e suscettibili in base al test di interazione sociale è che non tutti i comportamenti avversi possono essere misurati con precisione utilizzando un software di video-tracking. I mouse "resilienti" con un punteggio di interazione >1 possono dimostrare un comportamento sottomesso intorno al contenitore che ospita il mouse CD1³¹. È importante che il settore sviluppi un software che tilichi meglio tali microcomitori. Strumenti come la semplice analisi comportamentale (SimBA³²), che è stato sviluppato dal laboratorio d'oro per consentire classificatori comportamentali per comportamenti sociali complessi nei roditori, può rivelarsi utile a questo proposito.

Durante il protocollo CNSDS può verificarsi un certo montaggio. Anche se non abbiamo osservato alcuna gravidanza in questo paradigma, i ricercatori dovrebbero essere consapevoli di questa possibilità.

Un'altra limitazione dei protocolli di sconfitta sociale, tra cui CNSDS, è la finestra di tempo riferito limitato per indagare gli effetti di stress sul comportamento dopo aver completato le sessioni di sconfitta sociale. Così, abbiamo adattato i protocolli di barriera del labirinto esistenti per adattare tutte le sessioni di assuvazione, formazione e test in un lasso di tempo di 30 giorni. Tuttavia, questo può accelerare la formazione complessiva per alcuni topi, che possono lottare per raggiungere il 70% criterio per la selezione del braccio ad alta ricompensa necessaria per completare le sessioni di libera scelta (Figura 4). Inoltre, ci sono giorni limitati disponibili per completare qualsiasi altro test comportamentale senza una pianificazione adeguata. Tuttavia, studi recenti indicano che lo stress da sconfitta sociale può produrre impatti più persistenti sul cervello e sul comportamento. Studi del laboratorio Diczek mostrano che 10 giorni di stress da sconfitta sociale possono aumentare il consumo volontario di alcol nei topi della durata di almeno 4^{settimane 31,33}. I protocolli di sconfitta sociale utilizzano sessioni di sconfitta che durano da 5 a 10 minuti. Usiamo esposizioni di 5 minuti per CNSDS per diminuire la probabilità di lesioni nei topi sperimentali C57BL/6J²⁸. Il protocollo CNSDS produce risultati comparabili nelle femmine al protocollo di sconfitta sociale sviluppato da Newmann e colleghi, in cui i topi femminili C57BL/6J sono esposti ai topi svizzeri residenti Weber²⁸. Simile al CNSDS, questa variazione del protocollo di sconfitta sociale utilizza 10 giorni di interazioni 5 minuti per indurre un fenotipo di stress cronico.

Questi metodi possono essere utilizzati per esaminare come lo stress cronico influisce sull'elaborazione della ricompensa e sulla motivazione nei topi. Sia l'elaborazione della ricompensa, sia i soggetti femminili, sono storicamente poco studiati nel campo del disturbo dell'umore preclinico. Gli studi futuri dovrebbero determinare l'impatto dello stress cronico sulla motivazione della ricompensa maschile e femminile e stratificare i topi resilienti rispetto ai topi suscettibili (Figura 5B). Sarà importante sapere se questa stratificazione produce effetti diversi sulle prestazioni della barriera del labirinto Y, come si vede nei comportamenti di evitamento, come il campo aperto, il labirinto elevato e l'alimentazione soppressa dalle novità. Studi futuri possono combinare queste metodologie con altre tecniche, come l'optogenetica o la tecnologia DREADDS, per esaminare i circuiti neurali mediando la risposta allo stress o premiando la motivazione.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Gli autori ringraziano Thomas Grace per aver costruito labirinti Y, barriere e gabbie di sconfitta sociale. Gli autori ringraziano Jay Lee, Karina Stech e Prachi Srivastava per l'assistenza nella raccolta dei dati. Questo lavoro è stato finanziato da NIMH Grant R01 MH112861 (BAS).