Monitoramento de anticorpos bloqueadores pd-1 ligados a células T derivadas de uma gota de sangue periférico

Desenvolvemos um simples ensaio de citometria de fluxo para avaliar a ligação de anticorpos bloqueadores PD-1 às células T, exigindo apenas uma gota de sangue periférico de pacientes com câncer.

Os inibidores de checkpoint imunológico, incluindo anticorpos de bloqueio pd-1, melhoraram significativamente os resultados do tratamento em vários tipos de câncer. A eficácia farmacológica dessas imunoterapias é duradoura, estendendo-se até mesmo além da descontinuação de suas injeções, devido às persistentes concentrações sanguíneas. Aqui desenvolvemos um simples ensaio de citometria de fluxo para avaliar o status de ligação de células T dos anticorpos pd-1 de bloqueio nivolumab e pembrolizumabe. Como um teste de glicose, este ensaio requer apenas uma única gota de sangue periférico. Visualizar anticorpos ligados em células T é mais confiável do que medir concentrações sanguíneas de anticorpos. Além disso, se necessário, podemos potencialmente analisar muitos marcadores imunológicos distintos em células T ligadas a anticorpos bloqueadores PD-1. Assim, trata-se de uma estratégia simples e minimamente invasiva para analisar o efeito farmacológico dos anticorpos bloqueadores de PD-1 em pacientes com câncer.

Os anticorpos de bloqueio pd-1 tornaram-se a escolha padrão para o tratamento de vários tipos de câncer, incluindo câncer de pulmão não-pequeno celular (NSCLC)^1,2,3,4. Eles mostram um notável efeito terapêutico em um subconjunto de pacientes com câncer que não responderam às quimioterapias citotóxicas convencionais. No entanto, os inibidores de ponto de verificação imunológica (ICIs), que incluem anticorpos pd-1-bloqueio, podem causar um espectro único e distinto de eventos adversos, denominados eventos adversos relacionados à imunológica (irAEs)⁵. Embora os irAEs possam afetar quase todos os tecidos, eles são mais comumente observados no trato gastrointestinal, glândulas endócrinas, pele e fígado, e podem causar distúrbios pruritos, erupção cutânea, náusea, diarreia e tireoide^6,7. Em geral, a maioria dos irAEs aparecem dentro de 1 a 2 meses após o início das ICIs. No entanto, em alguns casos, eles podem ocorrer mais de 1 ano após o início do tratamento ou mesmo após a cessação do tratamento^6,7. Eles também causam vários sintomas que podem ser difíceis de discriminar outras patologias. Assim, pode ser desafiador diagnosticar prontamente os irAEs e tratá-los adequadamente. os irAEs podem afetar todos os tecidos, e seu início é fortemente influenciado pelas células imunes circulantes, especialmente as células T ligadas a anticorpos bloqueadores PD-1. Portanto, um método simples e minimamente invasivo para monitorar células T direcionadas a anticorpos é importante em ambientes clínicos.

Aqui, desenvolvemos um método simples para avaliar a vinculação de anticorpos pd-1 a células T usando uma gota de sangue inteiro periférico de pacientes com câncer que receberam nivolumab ou pembrolizumabe. Usando essa abordagem, pudemos monitorar cada um dos seguintes: 1) a duração da ligação de anticorpos às células T, 2) a ocupação de moléculas de PD-1 por anticorpos terapêuticos e 3) o status de ativação e características imunológicas das células T. Este método é uma modificação de uma técnica⁸relatada anteriormente . A quantidade de sangue necessária é quase a mesma necessária para um teste de glicose, e a abordagem não requer enriquecimento mononuclear celular ou co-culturing com anticorpos pd-1-bloqueio. Confirmamos que esse método também pode ser realizado utilizando amostras congeladas, incluindo células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) e células de derrame pleural, derrame pericárdico, fluido de lavage broncoaveolar e fluido cerebrorraquidiano, sugerindo que essa estratégia pode ser útil no contexto de um estudo multicêntrico. Esse método pode facilitar o diagnóstico precoce dos irAEs, e também ajudar a determinar os tratamentos imunossupressores adequados para controlar seus sintomas e identificar os horários ideais para iniciar terapias subsequentes após inibidores de PD-1.

A amostragem foi realizada durante os procedimentos clínicos de rotina. Todas as amostras humanas foram obtidas após o consentimento informado foi fornecido pelos sujeitos, de acordo com a Declaração de Helsinque e com a aprovação do conselho de revisão ética da Faculdade de Pós-Graduação em Medicina, Universidade de Osaka, Japão (15383 e 752).

1. Preparação e coloração de amostras de sangue inteiro

1. Colete amostras de sangue inteiras em tubos de coleta de sangue contendo ácido tetraástico de diamina de etileno (EDTA).
   NOTA: A coleta de sangue pode ser realizada usando uma agulha normal ou uma lança de sangue.
2. Transfira 20 μL de amostras de sangue inteiro para tubos de citomete trimeteno de poliestireno de 5 mL.
   NOTA: Para reduzir a ligação não específica das células aos tubos, 1 mL de 2% de soro bovino fetal (FBS) em soro amortecido com fosfato (PBS) é adicionado em tubos e vórtices por 10 s antes da aplicação às amostras.
3. Adicione 20 μL de 2% de FBS em PBS.
4. Adicione 10 μL de reagente de bloqueio fcr específico para humanos. Misture bem e incuba por 15 min à temperatura ambiente.
5. Adicione 500 μL de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Misture bem e incuba por 10 min à temperatura ambiente.
6. Adicione 4 mL de 2% de FBS em PBS e gire células para baixo a 400 x g (1.500 rpm) por 5 min a 4 °C. Remova supernatant por aspiração.
7. Repita o processo de lavagem e aspiração descrito na etapa 1.6.
8. Resuspender as células em 100 μL de 2% de FBS em PBS e dividir em dois tubos de 50 μL cada.
9. Adicione anticorpos de marcador de superfície(Tabela 1). Misture bem e incuba rastou por 20 min à temperatura ambiente no escuro.
   NOTA: Ao traçar o perfil da célula T, o número de marcadores pode ser aumentado com base na qualidade da máquina de citometria de fluxo.
10. Lave amostras 2x como descrito na etapa 1.6.
11. Resuspender as células em 200 μL de 2% de FBS na PBS.

2. Análise Citométrica de fluxo

1. Insira tubos no citometro de fluxo e adquira células, basicamente seguindo o protocolo recomendado⁹.
2. Registre 10.000 eventos como o portão linfócito (Figura 1A) e dados de fluxo de exportação como arquivos .fcs para análise.
3. Abra arquivos no software de análise. Visualize as células em uma dispersão para frente (FSC) (A) vs. dispersão lateral (SSC) (A) e linfócitos de portão(Figura 1A).
4. Depois de selecionar células individuais usando fSC (H) vs. FSC (W) e SSC (H) vs. SSC(W)( Figura 1B) e exibi-las em um cd3 vs. CD8 ou cd3 ou cd4 gráfico, portão das células CD8 T e células CD4 T, respectivamente (Figura 1C).
5. Depois de selecionar as células fechadas e exibi-las em um enredo PD-1 vs. IgG4 humano, identifique as células CD8 e CD4 T ligadas ao Corpo de PD-1 com base no controle do isotipo(Figura1D).

A estratégia de gating e a análise de citometria de fluxo(Figura 1)podem detectar a ligação de anticorpos PD-1 a células T obtidas a partir de uma queda de sangue periférico do paciente NSCLC. Antes que o anticorpo de bloqueio PD-1 seja administrado, nenhuma célula de CD8 ou CD4 Positivo humana está presente, e a expressão PD-1 pode ser confirmada por um anticorpo PD-1 -detecting (EH12.1) (Figura 2A). Após a administração nivolumab ou pembrolizumabe, igG4 (nivolumab, pembrolizumab) pode ser detectado em células T por anticorpo anti-IgG4 (HP6025) enquanto o anticorpo PD-1-detecting EH12.1 não reconhece qualquer PD-1 em células T porque os anticorpos PD-1 terapêuticos perturbam a ligação EH12.1. Isso significa que estamos medindo indiretamente a ligação terapêutica do anticorpo PD-1-blocking com base na falta de ligação do anticorpo PD-1- detectando. Dados representativos mostram os diferentes status de vinculação do anticorpo bloqueador PD-1(Figura 2A). Nivolumab e pembrolizumabe de ligação e ocupação de PD-1 em células T diminuem ao longo do tempo¹⁰, e há ligação parcial (PB), que é mostrada na área duplamente positiva, e finalmente perda completa de ligação (LB) (Figura 2B).

Figura 1: Estratégia representativa de gating para avaliar pd-1- bloqueando anticorpos ligados a células T a partir de uma gota de sangue periférico. (A)FSC (A) vs. SSC (A) enredo e gating de linfócitos. (B) Os doublets são excluídos por portões de desenho ao redor da população celular principal em parcelas de FSC (H) vs. FSC (W) e SSC (H) vs. SSC (W). (C) CD3 vs. CD8 plot (superior) e CD3 vs. CD4 plot (inferior) e gating de células CD8 T e células CD4 T, respectivamente. (D) PD-1 vs. plano IgG4 humano e detecção da ligação de nivolumab (um anticorpo PD-1-blocking) às células CD8 e CD4 T. Pontos laranjas e pontos pretos indicam anticorpo anti-IgG4 e coloração de controle isotipo, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 2: Análise representativa de citometria de fluxo indicando a mudança no status de vinculação dos anticorpos bloqueadores PD-1. (A) A coloração do PD-1 e do IgG4 humano em células CD8 T do sangue do paciente pré-tratamento ici foi avaliada por citometria de fluxo (esquerda). Dez microlitros de sangue pré-tratado foram tratados com diluição em série de nivolumab por 15 minutos, e foram concluídas as etapas 1,4 a 1,10 do protocolo. A ligação completa (CB) (vermelha), a ligação parcial (PB) (azul) e a perda de ligação (LB) (verde) são definidas pelos portões indicados. (B) O status de anticorpo bloqueador PD-1 ligado às células CD8 T foi analisado nos pontos de tempo de seguimento, como indicado, em pacientes da NSCLC que descontinuaram nivolumab e pembrolizumabe. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Tabela 1: Anticorpos utilizados na análise citométrica de fluxo.

Neste artigo, relatamos um método usando um címetro de fluxo para detectar anticorpos bloqueadores PD-1 ligados a células T derivadas de uma gota de sangue periférico, que originalmente desenvolvemos para detecção de nivolumab¹⁰. Embora essa técnica seja muito simples e fácil de executar, dois pontos importantes devem ser notados para obter resultados precisos. Uma delas é que para detectar moléculas PD-1, deve-se usar um anticorpo apropriado que compete com nivolumab e pembrolizumabe. Essa questão foi avaliada em estudo anterior¹¹. A outra é que a lise RBC deve ser realizada minuciosamente antes da coloração da superfície. Enquanto um controle isotipo for estabelecido para cada ensaio determinar o portão do cluster igG4-positivo, a frequência não é afetada. No entanto, com este protocolo, quando a lise RBC é insuficiente pode haver reduções tanto da contagem de células T no portão linfócito quanto da intensidade de cada marcador de superfície. Além disso, a etapa de lise RBC deve ser realizada antes da coloração da superfície, caso contrário o anticorpo anti-IgG4 (HP6025) não funciona corretamente.

A limitação desse método é que a população de células T ligadas aos anticorpos bloqueadores PD-1 inclua clones específicos de células T responsáveis por efeitos terapêuticos e irAEs; no entanto, as frequências desses clones específicos entre a população ligada a anticorpos são bastante baixas. Portanto, ainda precisamos enriquecer o alvo específico usando certos marcadores, por exemplo, CD39¹². Outra limitação é que a intensidade da fluorescência do IgG4 não é alta em alguns casos, o que dificulta a determinação do status de ligação (ou seja, PB e LB).

Outros estudos têm monitorado anticorpos terapêuticos PD-1 no sangue para avaliar farmacocinética. Medir a concentração plasmática de nivolumab ou pembrolizumabe é essencial para determinar como a quantidade residual desses anticorpos no sangue se correlaciona com o tempo. No entanto, notificamos anteriormente que a concentração de nivolumab não se correlaciona completamente com a ligação residual às células T¹⁰. Comparado com a medição da concentração de anticorpos plasmáticos^13,nosso método pode ser mais apropriado para avaliar a ligação residual de anticorpos anti-PD-1 às células T. O método original de monitoramento da ligação nivolumab às células T no sangue exigiuincubação com nivolumab 8 rotulado sem fluorescência. Simplificamos essa abordagem e conseguimos reduzir substancialmente o tempo de ensaio e a quantidade de sangue necessária para análise.

Células congeladas também podem ser analisadas usando este ensaio, sugerindo que este método é um bom ajuste para estudos multicêntricos. A utilidade dessa abordagem será reforçada ainda mais combinando o status de ligação de monitoramento com outros marcadores imunológicos, como o Ki-67, das células T ligadas aos anticorpos pd-1 de bloqueio¹⁰. Estudos futuros devem usar nosso método em conjunto com sequenciamento de RNA de célulaúnica e sequenciamento de receptorde células T para tentar identificar e caracterizar os subconjuntos específicos das células T que estão vinculados a anticorpos de bloqueio PD-1 e são responsáveis pelos irAEs.

Os autores não têm nada para divulgar.

Este trabalho foi apoiado por subsídios para S.K. da Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (JP17K16045) e pela Agência japonesa de Pesquisa e Desenvolvimento Médico (JP18cm0106335 e 19cm0106310).