Monitoraggio degli anticorpi PD-1-Blocking legati a cellule T derivate da una goccia di sangue periferico

Abbiamo sviluppato un semplice saggio di citometria di flusso per valutare il legame degli anticorpi di blocco PD-1 alle cellule T, richiedendo solo una goccia di sangue periferico da pazienti oncologici.

Gli inibitori dei checkpoint immunitari, tra cui gli anticorpi che bloccano la PD-1, hanno migliorato significativamente gli esiti del trattamento in vari tipi di cancro. L'efficacia farmacologica di queste immunoterapie è di lunga durata, estendendosi anche oltre l'interruzione delle loro iniezioni, a causa di persistenti concentrazioni ematiche. Qui abbiamo sviluppato un semplice saggio di citometria di flusso per valutare lo stato di legame delle cellule T degli anticorpi che bloccano il PD-1 nivolumab e pembrolizumab. Come un test del glucosio, questo saggio richiede solo una singola goccia di sangue periferico. La visualizzazione del legame degli anticorpi sulle cellule T è più affidabile della misurazione delle concentrazioni ematiche degli anticorpi. Inoltre, se necessario, possiamo potenzialmente analizzare molti marcatori immunitari distintivi correlati alle cellule T legati agli anticorpi che bloccano la PD-1. Quindi, questa è una strategia semplice e minimamente invasiva per analizzare l'effetto farmacologico degli anticorpi che bloccano la PD-1 nei pazienti oncologici.

Gli anticorpi PD-1-bloccanti sono diventati la scelta standard per il trattamento di vari tipi di cancro, tra cui il cancro polmonare non a piccole cellule (NSCLC)^1,2,3^,4. Essi mostrano un notevole effetto terapeutico in un sottoinsieme di pazienti oncologici che non hanno risposto alle chemioterapie citotossiche convenzionali. Tuttavia, gli inibitori del checkpoint immunitario (ICI), che includono anticorpi che bloccano la PD-1, possono causare uno spettro unico e distinto di eventi avversi, dorati eventi avversi legati al sistema immunitario (irAE)⁵. Anche se gli irAE possono colpire quasi tutti i tessuti, sono più comunemente osservati nel tratto gastrointestinale, ghiandole endocrine, pelle, e fegato, e possono causare prurito, eruzione cutanea, nausea, diarrea, e disturbi della tiroide^6,7. In generale, la maggior parte degli irsia appare entro 1 o 2 mesi dopo l'avvio delle ICI. Tuttavia, in alcuni casi, possono verificarsi dopo 1 anno dopo l'inizio del trattamento o anche dopo la cessazione del trattamento^6,7. Essi causano anche vari sintomi che possono essere difficili da discriminare da altre patologie. Pertanto, può essere difficile diagnosticare tempestivamente gli iraE e trattarli in modo appropriato. Gli irAE possono colpire tutti i tessuti e la loro insorgenza è fortemente influenzata dalle cellule immunitarie circolanti, in particolare le cellule T legate agli anticorpi che bloccano la PD-1. Pertanto, un metodo semplice e minimamente invasivo per monitorare le cellule T mirate agli anticorpi è importante negli ambienti clinici.

Qui, abbiamo sviluppato un semplice metodo per valutare il legame di anticorpi che bloccano PD-1 alle cellule T utilizzando una goccia di sangue intero periferico da pazienti oncologici che hanno ricevuto nivolumab o pembrolizumab. Utilizzando questo approccio, siamo stati in grado di monitorare ciascuno dei seguenti elementi: 1) la durata del legame degli anticorpi alle cellule T, 2) l'occupazione delle molecole di PD-1 delle cellule T da parte di anticorpi terapeutici e 3) lo stato di attivazione e le caratteristiche immunologiche delle cellule T. Questo metodo è una modifica di una tecnica precedentemente^{segnalata 8}. La quantità di sangue necessaria è quasi la stessa di quella necessaria per un test del glucosio, e l'approccio non richiede l'arricchimento delle cellule mononucleari o la co-cultura con anticorpi che bloccano la PD-1. Abbiamo confermato che questo metodo può essere eseguito anche utilizzando campioni congelati, tra cui cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) e cellule da effusione plerica, effusione pericardiale, liquido di lavanda bronchoalveolar e liquido cerebrospinale, suggerendo che questa strategia può essere utile nel contesto di uno studio multicentrico. Questo metodo può facilitare la diagnosi precoce degli iraE e anche aiutare a determinare i trattamenti immunosoppressivi appropriati per controllare i loro sintomi e per identificare i tempi ottimali per avviare terapie successive dopo inibitori PD-1.

Il campionamento è stato eseguito durante le procedure cliniche di routine. Tutti i campioni umani sono stati ottenuti dopo il consenso informato è stato fornito dai soggetti, in conformità con la dichiarazione di Helsinki e con l'approvazione del comitato di revisione etica della Graduate School of Medicine, Università di Osaka, Giappone (15383 e 752).

1. Preparazione e colorazione del campione di sangue intero

1. Raccogliere campioni interi di sangue in tubi di raccolta del sangue contenenti etilene diamine tetra-acetico acido (EDTA).
   NOTA: La raccolta del sangue può essere eseguita utilizzando un ago normale o una lancetta di sangue.
2. Trasferire 20 - L di campioni di sangue intero a 5 mL di tubi di citometria a flusso di polistirolo rotondo.
   NOTA: Per ridurre l'associazione non specifica delle cellule ai tubi, 1 mL di 2% siero bovino fetale (FBS) in salina tampina bufferizzata fosfato (PBS) viene aggiunto ai tubi e vortice per 10 s prima dell'applicazione ai campioni.
3. Aggiungere in PBS 20 -L del 2% Di FBS.
4. Aggiungete 10 l di reagente di blocco FcR specifico per l'uomo. Mescolare bene e incubare per 15 min a temperatura ambiente.
5. Aggiungere 500 l di l'isola del globulo rosso. Mescolare bene e incubare per 10 min a temperatura ambiente.
6. Aggiungete 4 mL di 2% FBS in PBS e abbassate le celle a 400 x g (1.500 giri/m) per 5 min a 4 gradi centigradi. Rimuovere supernatante per aspirazione.
7. Ripetere il processo di lavaggio e aspirazione descritto nel passaggio 1.6.
8. Sospendi di nuovo le cellule in 100 gradi l di 2% FBS in PBS e divise in due tubi da 50 a L ciascuno.
9. Aggiungere anticorpi dei marcatori di superficie (Tabella 1). Mescolare bene e incubare per 20 min a temperatura ambiente al buio.
   NOTA: durante la profilazione dello stato immunitario delle cellule T, il numero di marcatori può essere aumentato in base alla qualità della macchina della citometria di flusso.
10. Lavare i campioni 2x come descritto al punto 1.6.
11. Risospendere le celle in 200 - L del 2% FBS in PBS.

2. Analisi citometrica del flusso

1. Inserire tubi nel citometro di flusso e acquisire cellule, fondamentalmente seguendo il protocollo raccomandato⁹.
2. Registrare 10.000 eventi come porta del linfocito (Figura 1A) ed esportare i dati di flusso come file .fcs per l'analisi.
3. Aprire i file nel software di analisi. Visualizzare le celle in un grafico a dispersione in avanti (FSC) (A) rispetto a dispersione laterale (SSC) (A) e linfociti gate (Figura 1A).
4. Dopo aver selezionato le celle singole utilizzando FSC (H) vs FSC (W) e SSC (H) vs SSC (W) (W)(Figura 1B) e averle visualizzate su un grafico CD3 vs CD8 o CD3 rispetto a CD4, gate le cellule T CD8 e le celle T CD4, rispettivamente (Figura 1C).
5. Dopo aver selezionato le celle gated e averle visualizzate su un grafico PD-1 rispetto a quello umano IgG4, identificare le celle CD8 e T legate agli anticorpi PD-1 in base al controllo isotipo (Figura 1D).

La strategia di gating e l'analisi della citometria di flusso (Figura 1) sono in grado di rilevare il legame degli anticorpi PD-1-bloccante alle cellule T ottenute da una goccia di sangue periferico del paziente NSCLC. Prima che l'anticorpo pd-1-blocco venga somministrato, non sono presenti cellule T CD8 o CD4 umane- positive e l'espressione PD-1 può essere confermata da un anticorpo di rilevamento PD-1 (EH12.1)(Figura 2A). Dopo la somministrazione di nivolumab o pembrolizumab, l'IgG4 (nivolumab, pembrolizumab) può essere rilevato sulle cellule T da anticorpi anti-IgG4 (HP6025), mentre l'anticorpo di rilevamento PD-1 EH12.1 non riconosce alcuna legatura PD-1 sulle cellule T perché gli anticorpi terapeutici PD-1 E.disturbh2.1 leganti. Ciò significa che stiamo misurando indirettamente il legame terapeutico dell'anticorpo di blocco PD-1 in base alla mancanza di legame di anticorpo di rilevamento PD-1. I dati rappresentativi mostrano i diversi stati di rilegatura dell'anticorpo di blocco PD-1 (Figura 2A). Nivolumab e pembrolizumab legame e l'occupazione di PD-1 sulle cellule T diminuiscono nel tempo¹⁰, e c'è rilegatura parziale (PB), che viene mostrato nell'area a doppio positivo, e infine completa perdita di legame (LB) (Figura 2B).

Figura 1: Strategia di gating rappresentativa per valutare il legame degli anticorpi PD-1 alle cellule T da una goccia di sangue periferico. (A) Trama FSC (A) vs SSC (A) trama e gating di linfociti. (B) Le doppiette sono escluse dai cancelli intorno alla popolazione di cellule principali su appezzamenti di LOTti di FSC (H) vs FSC (W) e SSC (H) vs SSC (W). (C) CD3 contro CD8 stampa (superiore) e CD3 vs CD4 trama (inferiore) e gating di cellule T CD8 e cellule T CD4, rispettivamente. (D) PD-1 vs human IgG4 trama e rilevamento del legame di nivolumab (un anticorpo PD-1-blocco) alle cellule T CD8 e CD4. I punti arancioni e i punti neri indicano rispettivamente l'anticorpo anti-IgG4 e la colorazione del controllo isotipo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Analisi della citometria di flusso rappresentativa che indica la modifica dello stato vincolante degli anticorpi che bloccano il PD-1. (A) La colorazione del PD-1 e dell'Ig4 umano nei cellule T CD8 provenienti dal sangue del paziente pretrattato dall'ICI è stata valutata dalla citometria di flusso (a sinistra). Dieci microlitri di sangue pretrattato sono stati trattati con diluizione seriale di nivolumab per 15 min e sono stati completati i passaggi da 1,4 a 1,10 del protocollo. La rilegatura completa (CB) (rosso), la rilegatura parziale (PB) (blu) e la perdita di rilegatura (LB) (verde) sono definite dai gate indicati. (B) Lo stato del legame dell'anticorpo PD-1 alle cellule T CD8 è stato analizzato nei punti di follow-up, come indicato, nei pazienti NSCLC che hanno interrotto il nivolumab e il pembrolizumab. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Anticorpi utilizzati nell'analisi citometrica del flusso.

In questo articolo, riportiamo un metodo utilizzando un citometro di flusso per rilevare PD-1-bloccando gli anticorpi legati alle cellule T derivate da una goccia di sangue periferico, che abbiamo originariamente sviluppato per il rilevamento nivolumab¹⁰. Anche se questa tecnica è molto semplice e facile da eseguire, due punti importanti devono essere annotati per ottenere risultati accurati. Uno è che per rilevare le molecole PD-1, dovrebbe essere utilizzato un anticorpo appropriato che compete con nivolumab e pembrolizumab. Questo problema è stato valutato in uno studio precedente¹¹. L'altro è che la lisi RBC deve essere eseguita accuratamente prima della colorazione superficiale. Finché viene stabilito un controllo isotipo per ogni analisi per determinare la porta del cluster IgG4-positivo, la frequenza non è influenzata. Tuttavia, con questo protocollo, quando la lisi RBC è insufficiente possono esserci riduzioni sia del conteggio delle cellule T nel cancello dei linfociti che dell'intensità di ogni marcatore di superficie. Inoltre, il passaggio di lisi RBC deve essere eseguito prima della colorazione superficiale, altrimenti l'anticorpo anti-IgG4 (HP6025) non funziona correttamente.

La limitazione di questo metodo è che la popolazione di cellule T legate agli anticorpi di blocco PD-1 includono specifici cloni di cellule T responsabili di effetti terapeutici e irAE; tuttavia, le frequenze di questi cloni specifici tra la popolazione anticorpale sono piuttosto basse. Pertanto, dobbiamo ancora arricchire l'obiettivo specifico utilizzando alcuni marcatori, ad esempio CD39¹². Un'altra limitazione è che l'intensità di fluorescenza di IgG4 non è alta in alcuni casi, il che rende difficile determinare lo stato di legame (cioè PB e LB).

Altri studi hanno monitorato gli anticorpi terapeutici PD-1 nel sangue per valutare la farmacocinezia. Misurare la concentrazione di plasma di nivolumab o pembrolizumab è essenziale per determinare come la quantità residua di questi anticorpi nel sangue correla con il tempo. Tuttavia, in precedenza abbiamo riferito che la concentrazione di nivolumab non è completamente correlata con il legame residuo alle cellule T¹⁰. Rispetto alla misurazione della concentrazione di anticorpi plasmatici¹³, il nostro metodo può essere più appropriato per valutare il legame residuo degli anticorpi anti-PD-1 alle cellule T. Il metodo originale di monitoraggio del legame nivolumab alle cellule T nel sangue richiedeva incubazione con nivolumab⁸con etichetta a fluorescenza. Abbiamo semplificato questo approccio e siamo riusciti a ridurre sostanzialmente il tempo di analisi e la quantità di sangue necessaria per l'analisi.

Le cellule congelate possono anche essere analizzate utilizzando questo saggio, suggerendo che questo metodo è una buona misura per gli studi multicentrici. L'utilità di questo approccio sarà ulteriormente migliorata combinando lo stato di legame di monitoraggio con altri marcatori immunologici, come Ki-67, delle cellule T legate agli anticorpi che bloccano la PD-1^{1 .} Studi futuri dovrebbero utilizzare il nostro metodo in combinazione con il sequenziamento dell'RNA unicellulare e il sequenziamento del recettore delle cellule T per cercare di identificare e caratterizzare i sottoinsiemi specifici di cellule T che sono legati agli anticorpi di blocco DELLA PD-1 e sono responsabili degli irAE.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a S.K. dalla Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (JP17K16045) e dall'Agenzia Giapponese per la Ricerca e lo Sviluppo Medicina (JP18cm0106335 e 19cm0106310).