监测PD-1-阻断抗体绑定到T细胞派生从外周血滴

我们开发了一个简单的流式细胞测定法，用于评估PD-1阻滞抗体与T细胞的结合，只需要癌症患者的一滴外周血。

免疫检查点抑制剂，包括PD-1-阻断抗体，显著改善了各类癌症的治疗效果。这些免疫疗法的药理疗效是长期的，甚至延伸到停止注射，由于持续的血液浓度。在这里，我们开发了一个简单的流式细胞测定法，以评估PD-1-阻断抗体nivolumab和pembrolizumab的T细胞结合状态。与葡萄糖测试一样，这种检测只需要一滴外周血。可视化抗体结合T细胞比测量抗体血液浓度更可靠。此外，如有必要，我们可以分析与PD-1-阻断抗体结合的T细胞上的许多独特的免疫相关标记。因此，这是一种简单和微创的策略，用于分析PD-1-阻断抗体在癌症患者中的药理作用。

PD-1+阻断抗体已成为治疗各种癌症的标准选择，包括非小细胞肺癌（NSCLC）1、2、3、4。在一部分没有对常规细胞毒性化疗有反应的癌症患者中，它们显示出显著的治疗效果。然而，免疫检查点抑制剂（ICI），包括PD-1-阻断抗体，可以引起独特和不同的不良事件，称为免疫相关不良事件（irAEs）5。虽然irAEs可以影响几乎所有的组织，它们最常观察到在胃肠道，内分泌腺，皮肤和肝脏，他们可能导致瘙痒，皮疹，恶心，腹泻和甲状腺疾病^6，7。一般来说，大多数 IrAEs 在 ICIs 启动后的 1 到 2 个月内出现。然而，在某些情况下，它们可能发生在开始治疗后1年，甚至在治疗停止^6，7之后。它们也会导致各种症状，可能难以区别于其他疾病。因此，要及时诊断irAEs并对其进行适当治疗可能具有挑战性。irAE 可以影响所有组织，其发病受到循环免疫细胞的强烈影响，尤其是与 PD-1 和阻断抗体结合的 T 细胞。因此，在临床环境中，一种简单和微创的方法来监测抗体靶向T细胞非常重要。

在这里，我们开发了一个简单的方法，用接受尼沃卢巴或皮布吕祖马的癌症患者的一滴外周全血来评估PD-1-阻断抗体与T细胞的结合。使用这种方法，我们能够监测以下各项:1）抗体与T细胞结合的持续时间，2）治疗抗体占用T细胞PD-1分子，3）T细胞的活化状态和免疫特征。此方法是对以前报告的技术⁸的修改。所需的血液量与葡萄糖测试所需的血液量几乎相同，该方法不需要单核细胞富集或与PD-1-阻断抗体共同培养。我们确认这种方法也可以使用冷冻样品进行，包括外周血单核细胞（PBMC）和来自胸腔输液、心包液、支气管输液和脑脊液的细胞，这表明这种策略在多中心研究的背景下可能有用。这种方法可能有助于irAE的早期诊断，也有助于确定适当的免疫抑制治疗，以控制其症状，并确定在PD-1抑制剂后启动后续治疗的最佳时间。

采样是在常规临床过程中进行的。根据《赫尔辛基宣言》，并经日本大阪大学医学院伦理审查委员会批准（15383和752），所有人类样本都是在知情同意后取得的。

1. 全血样制备和染色

1. 将全血样本收集到含有乙烯二胺四乙酸（EDTA）的血液收集管中。
   注:血收集可以使用常规针头或血柳刀进行。
2. 将20μL全血样品转移到5mL圆底聚苯乙烯流细胞测定管。
   注:为了减少细胞与管的非特异性结合，在将磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的1 mL 2%胎儿牛血清（FBS）加入管中，在样品应用前涡旋10小时。
3. 在 PBS 中加入 20 μL 的 2% FBS。
4. 加入10μL的人特异性FcR阻断试剂。混合良好，在室温下孵育15分钟。
5. 加入500μL红细胞分瓶缓冲液。混合良好，在室温下孵育10分钟。
6. 在PBS中加入4 mL 2%FBS，在4°C下以400 x g（1，500 rpm）旋转细胞5分钟。通过吸入去除上清液。
7. 重复步骤 1.6 中描述的洗涤和吸入过程。
8. 在PBS中重新悬浮在100μL的2%FBS中的细胞，并分成两个管，每个50μL。
9. 添加表面标记抗体 （表 1）.混合良好，在黑暗中室温下孵育20分钟。
   注:在分析T细胞免疫状态时，可以根据流式细胞测量机的质量增加标记的数量。
10. 如步骤 1.6 所述，将样品洗涤 2 倍。
11. 在PBS中重新悬浮200μL的2%FBS中的细胞。

2. 流量细胞学分析

1. 将管插入流式细胞仪并获取细胞，基本上遵循建议的协议^9。
2. 将 10，000 个事件记录为淋巴细胞门（图 1A），并将导出流数据记录为 .fcs 文件进行分析。
3. 在分析软件中打开文件。在正向散射 （FSC） （A） 与侧散射 （SSC） （A） 绘图和门淋巴细胞（图 1A） 上可视化细胞。
4. 使用 FSC （H） vs. FSC （W） 和 SSC （H） vs. SSC （W） （图 1B） 选择单个单元并将其显示在 CD3 与 CD8 或 CD3 与 CD4 图后，分别将 CD8 T 单元和 CD4 T 单元（图 1C） 显示。
5. 选择封闭细胞并将其显示在PD-1与人类IgG4图上后，根据等型对照识别PD-1+阻断抗体结合CD8和CD4 T细胞（图1D）。

门控策略和流式细胞测定分析 （图 1） 可以检测从一滴 NSCLC 患者外周血获得的 PD-1 阻滞抗体结合到 T 细胞。在施用PD-1-阻断抗体之前，不存在人类IgG4阳性CD8或CD4 T细胞，PD-1表达可以通过PD-1+检测抗体（EH12.1）（图2A）确认。在尼沃卢马布或pembrolizumab分用后，IgG4（尼沃卢马布，pembrolizumab）可以通过抗IgG4抗体（HP6025）在T细胞上检测到，而PD-1+检测抗体EH12.1在T细胞上无法识别任何PD-1，因为治疗性PD-1抗体干扰EH12.1结合。这意味着，我们基于PD-1检测抗体缺乏结合，间接测量PD-1-阻断抗体的治疗结合。代表性数据显示PD-1-阻断抗体的不同结合状态（图2A）。Nivolumab 和 pembrolizumab 结合和 PD-1 在 T 细胞上的占用率随时间推后¹⁰减少，并且存在部分结合 （PB），显示在双正区中，最后完全失去结合 （LB） （图 2B）。

图1:代表浇注策略，评估PD-1-阻断抗体结合到T细胞从一滴外周血。（A） FSC （A） vs. SSC （A） 淋巴细胞的图解和门控。（B） 通过绘制 FSC （H） 与 FSC （W） 和 SSC （H） vs. SSC （W） 图上的主细胞群的图形来绘制门来排除双细胞。（C） CD3 vs. CD8 图（上部）和 CD3 与 CD4 图（下）和 CD8 T 单元和 CD4 T 单元的浇注。（D） PD-1 与人类 IgG4 图解和检测尼沃卢马布 （PD-1+阻断抗体） 与 CD8 和 CD4 T 细胞结合。橙色点和黑点分别表示抗IgG4抗体和等型控制染色。请点击此处查看此图的较大版本。

图2:代表性流式细胞测定分析，表明PD-1-阻断抗体结合状态的变化。（A） 在ICI预处理的患者血液中的CD8 T细胞中，PD-1和人IgG4的染色是通过流动细胞学（左）进行评估的。对10微升预处理的血液进行连续稀释15分钟，完成协议步骤1.4至1.10。完全绑定 （CB） （红色）、部分绑定 （PB） （蓝色） 和绑定丢失 （LB） （绿色） 由指示的门定义。（B） PD-1-阻断抗体结合CD8 T细胞的状态在后续时间点进行分析，如所示，在NSCLC患者中，停止使用尼沃卢马布和彭布罗利祖马布。请点击此处查看此图的较大版本。

表1:用于流式细胞测定分析的抗体。

在本文中，我们报道了一种使用流动细胞计检测PD-1-阻断抗体的方法，抗体与从一滴外周血衍生的T细胞结合，我们最初开发用于nivolumab检测^10。虽然此技术非常简单且易于执行，但为了获得准确的结果，应注意两个要点。其一是检测PD-1分子，应使用与尼沃卢马布和皮布吕祖马布竞争的适当抗体。这个问题在先前的研究¹¹中进行了评估。另一种是，在表面染色之前，应彻底进行RBC莱沙。只要为每个测定建立等型控制，以确定 IgG4 阳性聚类的栅极，频率就不受影响。然而，使用此协议，当RBC解压不足时，淋巴细胞门中的T细胞计数和每个表面标记的强度可能都有减少。此外，在表面染色之前必须执行 RBC 解毒步骤，否则抗 IgG4 抗体 （HP6025） 不能正常工作。

该方法的局限性是，与PD-1-阻断抗体结合的T细胞群包括负责治疗效果的特定T细胞克隆和irAEs;然而，这些特定克隆在抗体结合的人群中的频率相当低。因此，我们仍然需要使用某些标记来丰富特定目标，例如CD39^12。另一个限制是IgG4的荧光强度在某些情况下不高，这使得很难确定结合状态（即PB和LB）。

其他研究监测了血液中的治疗性PD-1抗体，以评估药代动力学。测量尼沃卢马布或皮布吕祖马布的血浆浓度对于确定血液中这些抗体的残留量与时间的关系至关重要。然而，我们以前报告说，尼沃卢马布的浓度并不完全与残余结合T细胞^10。与血浆抗体浓度¹³的测量相比，该方法可能更适合于评估抗PD-1抗体与T细胞的残留结合。监测与血液中T细胞结合的原始方法需要用荧光标记的nivolumab⁸孵育。我们简化了这种方法，并成功地大大减少了分析所需的测定时间和血液量。

冷冻细胞也可以使用此测定进行分析，表明这种方法非常适合多中心研究。通过将监测结合状态与其他免疫标记物（如 Ki-67）与PD-1-阻断抗体¹⁰结合的T细胞，进一步提高这种方法的实用性。未来的研究应该将我们的方法与单细胞RNA测序和T细胞受体测序相结合，试图识别和描述与PD-1-阻断抗体结合并负责iAEs的T细胞的特定子集。

作者没有什么可透露的。

这项工作得到了日本科学促进协会（JP17K16045）和日本医学研究发展厅（JP18cm0106335和19cm0106310）对S.K.的资助。