Avaliação dos efeitos metabólicos do jejum intermitente isocalórico 2:1 em camundongos

O artigo atual descreve um protocolo detalhado para o jejum intermitente isocalístico 2:1 para proteger e tratar de encontro à obesidade e ao metabolismo danificado da glicose em ratos do selvagem-tipo e do ob/ob.

Jejum intermitente (IF), uma intervenção dietética envolvendo restrição energética periódica, tem sido considerado para fornecer inúmeros benefícios e neutralizar anormalidades metabólicas. Até agora, diferentes tipos de modelos de IF com durações variadas de jejum e períodos de alimentação foram documentados. No entanto, interpretar os resultados é um desafio, pois muitos desses modelos envolvem contribuições multifatoriais de estratégias de restrição de tempo e calorias. Por exemplo, o modelo de jejum de dia alternada, muitas vezes usado como um regime de roedores, pode resultar em subalimentação, sugerindo que os benefícios de saúde dessa intervenção são provavelmente mediados por meio de restrições calóricas e ciclos de realimentação em jejum. Recentemente, foi demonstrado com sucesso que 2:1 SE, compreendendo 1 dia de jejum seguido por 2 dias de alimentação, pode fornecer proteção contra a obesidade induzida pela dieta e melhorias metabólicas sem uma redução na ingestão calórica global. Apresentado aqui é um protocolo desta intervenção isocalórica 2:1 SE em camundongos. Também descrito é um protocolo de alimentação de pares (PF) necessário para examinar um modelo de mouse com comportamentos alimentares alterados, como hiperfagia. Usando o regime de 2:1 IF, demonstra-se que o isocaloric SE conduz ao ganho de peso de corpo reduzido, à homeostase melhorada da glicose, e à despesa de energia elevada. Assim, esse regime pode ser útil para investigar os impactos do IF na saúde em várias condições da doença.

O estilo de vida moderno está associado a maior tempo de ingestão diária de alimentos e períodos de jejum mais curtos^1. Isso contribui para a atual epidemia global de obesidade, com desvantagens metabólicas observadas em seres humanos. O jejum tem sido praticado ao longo da história humana, e seus diversos benefícios para a saúde incluem vida útil prolongada, danos oxidativos reduzidos e homeostase energética otimizada^2,3. Entre várias formas de praticar jejum, a privação de energia periódica, denominada jejum intermitente (IF), está um método dietético popular que é amplamente praticado pela população em geral devido ao seu regime fácil e simples. Estudos recentes em modelos pré-clínicos e clínicos têm demonstrado que a IF pode fornecer benefícios de saúde comparáveis ao jejum prolongado e restrição calórica, sugerindo que a SE pode ser uma potencial estratégia terapêutica para obesidade e doenças metabólicas^2,3,4,5.

Os regimes de IF variam em termos de duração e frequência de jejum. Jejum de dias alternados (ou seja, 1 dia de alimentação/1 dia de jejum; 1:1 SE) tem sido o regime de IF mais comumente usado em roedores para estudar seus impactos benéficos na saúde sobre obesidade, doenças cardiovasculares, doenças neurodegenerativas, etc.^2,3. No entanto, como mostrado em estudos anteriores^6,7, e ainda mecanicamente confirmado em nossa análise de ingestão de energia^8,1:1 SE resulta em subalimentação (~ 80%) devido à falta de tempo de alimentação suficiente para compensar a perda de energia. Isso deixa claro se os benefícios de saúde conferidos por 1:1 SE são mediados por restrição calórica ou modificação dos padrões alimentares. Portanto, um novo regime de IF foi desenvolvido e é mostrado aqui, composto por um padrão de jejum de 2 dias de alimentação/1 dia (2:1 IF), que fornece aos ratos tempo suficiente para compensar a ingestão de alimentos (~99%) e peso corporal. Estes ratos são comparados então a um grupo do libitum do anúncio (AL). Este regime permite o exame dos efeitos do isocaloric SE na ausência de redução calórica em ratos do selvagem-tipo.

Em contraste, em um modelo de camundongo que exibe comportamento alimentar alterado, alimentação AL pode não ser uma condição de controle adequada para comparar e examinar os efeitos de 2:1 SE. Por exemplo, uma vez que os camundongos ob/ob (um modelo genético comumente usado para obesidade) exibem hiperfagia devido à falta de leptina que regula o apetite e a saciedade, aqueles com exposição 2:1 IF ~20% reduziram a ingestão calórica em comparação com camundongos ob/ob com alimentação AL. Assim, para examinar corretamente e comparar os efeitos do IF em camundongos ob/ob, um grupo de alimentação de pares como um controle adequado precisa ser empregado.

No geral, um protocolo abrangente é fornecido para realizar isocaloric 2:1 IF, incluindo o uso de um controle de alimentação de pares. É ainda demonstrado que isocaloric 2:1 SE protege ratos de alta gordura dieta induzida obesidade e / ou disfunção metabólica em ambos os ratos do tipo selvagem e ob / ob. Este protocolo pode ser usado para examinar os impactos benéficos para a saúde de 2:1 SE em várias condições patológicas, incluindo distúrbios neurológicos, doenças cardiovasculares e câncer.

Todos os métodos e protocolos aqui foram aprovados pelos Comitês de Cuidados Com Animais no Serviço de Cuidados com Animais e Veterinários (ACVS) da Universidade de Ottawa e do Centro de Fenogenômica (TCP) e estão em conformidade com as normas do Conselho Canadense de Cuidados Com Animais. Note-se que todos os procedimentos aqui descritos devem ser realizados aprovação institucional e governamental, bem como por funcionários tecnicamente proficientes. Todos os camundongos foram alojados em gaiolas desabafadas padrão em salas de temperatura e umidade controladas com 12 h/12 h de luz/ ciclos escuros (21-22 °C, 30%-60% de umidade para habitação normal) e livre acesso à água. Camundongos c57BL/6J masculinos e ob/ob foram obtidos no Laboratório Jackson.

1. 2:1 Isocaloric IF Regime

1. Para modelos de camundongos de obesidade magras e dietéticas induzidas pela dieta, prepare uma dieta normal (17% de gordura, ND) ou dieta rica em gordura (45% de gordura, HFD).
   NOTA: 60% HFD pode ser usado para induzir a obesidade induzida pela dieta grave; no entanto, devido à suavidade da pelota alimentar, é relativamente difícil medir com precisão a ingestão diária de alimentos. Um sistema automatizado de medição contínua pode melhorar a versatilidade para vários tipos de dietas.
2. Medir o peso corporal de base e composição corporal de cada rato em 7 semanas de idade usando uma escala e EchoMRI, respectivamente.
   Nota: Consulte a seção 3 para medição da composição corporal.
3. Com base no peso corporal e nos resultados da composição corporal, os camundongos C57BL/6J masculinos de 7 semanas de idade em dois grupos: grupos ad libitum (AL) e jejum intermitente (IF).
4. Coloque dois a três camundongos por gaiola e garantir o livre acesso à água potável.
   Nota: O número de camundongos por gaiola pode afetar o comportamento de ingestão de alimentos. Recomenda-se manter um número igual de camundongos por gaiola em todos os grupos durante o estudo.
5. Fornecer 1 semana de aclimatação ao novo ambiente de gaiola e dieta antes de iniciar o regime de IF.
6. Período de jejum: mova os ratos para uma gaiola limpa com cama fresca às 12:00 PM. Não adicione alimentos para o grupo IF, enquanto fornece uma quantidade pesada de alimentos para o grupo AL.
   Nota: Para cada ciclo de jejum, é importante mudar gaiolas para grupos al e se para garantir que ambos os grupos estão expostos à mesma quantidade de tempo de manuseio.
7. Após 24 h, medir os pesos dos ratos em ambos os grupos e restos de alimentos em gaiolas AL.
   Nota: Certifique-se de incluir o peso das migalhas de alimentos no funil de alimentos e no fundo da gaiola, especialmente quando se usa HFD, como ratos muitas vezes remover pequenas pelotas ou fragmentos de alimentos do funil e mantê-los perto de locais de ninho. A ingestão média de energia por mouse no final de cada ciclo 2:1 (3 dias) é de cerca de 35 kcal, equivalente a ~ 10 g para uma dieta normal (3,3 kcal/g) e ~ 7 g para HFD (4,73 kcal/g).
8. Período de alimentação: fornecer uma quantidade de alimentos às 12:00 pm para ambos os grupos AL e SE.
9. Após 48 h de fornecer o alimento, medir o peso de restos de comida e ratos.
10. Repita os passos 1,6-1,10 para a duração do estudo (porexemplo, 16 semanas).

2. Grupo controle de alimentação dupla (PF)

Nota: Para um experimento if em que o comportamento de alimentação alterado é observado em um modelo de mouse (por exemplo, hiperfagia em camundongos ob/ob), é necessário ter um grupo de alimentação de pares como controle para comparação calórica independente adequada com a IF.

1. Para o grupo controle da PF, escalonar o cronograma de experimentos de tal forma que a mesma quantidade de alimentos consumidos pelo grupo IF é oferecido ao grupo PF(Figura 2).
2. Medir a quantidade de alimentos consumidos pelo grupo IF ao longo de 2 dias de período de realimentação.
3. Divida essa quantidade de alimentos consumidos no grupo IF igualmente em três proporções e forneça-o diariamente ao grupo PF às 12:00 PM.
   Nota: Fornecer uma quantidade igual de alimentos diariamente é fundamental. No caso dos ratos com hiperfagia, se os ratos emparelhados são fornecidos com uma quantidade de alimento menos do que seu consumo voluntário imediatamente, consumirão provavelmente todo o alimento fornecido e se tornarão jejum eficazmente. Isto pode então impedir a comparação apropriada aos ratos IF-tratados e confundir o resultado.
4. Repita os passos 2.1-2.3 para a duração do estudo.

3. Análise da composição corporal

Nota: Uma vez que o IF a longo prazo afeta o peso corporal em camundongos, a composição corporal pode ser medida em ciclos apropriados (por exemplo, a cada 3 ou 4 ciclos) usando um analisador de composição corporal para quantificar a gordura e a massa magra em camundongos vivos e não anestesiados.

1. Ligue o analisador de composição corporal.
   Nota: Antes de iniciar o programa, deixe a máquina por pelo menos 2-3 h para aquecer.
2. Executar um teste de sistema no analisador de composição corporal para testar sua precisão de medição. Se necessário, calibrar o sistema usando óleo de canola e amostras de água.
3. Medir o peso corporal de cada rato.
4. Coloque o rato em um pequeno suporte cilíndrico animal.
5. Insira um delimitador para restringir o movimento físico do mouse durante a medição e coloque o suporte no analisador de composição corporal.
6. Executar o programa de digitalização.
   Nota: São necessários aproximadamente 90 a 120 s para analisar.
7. Após a medição, retire o suporte do equipamento e traga o rato de volta à gaiola.
   Nota: Um protocolo mais detalhado pode ser encontrado em uma publicação anterior⁹.

4. Testes de tolerância à glicose e insulina

1. Para o teste de tolerância à glicose (GTT), medir o peso corporal e a composição corporal de cada rato antes de submeter ao jejum e marcar a cauda com um marcador permanente para uma indexação fácil e rápida.
2. Coloque ratos em novas gaiolas sem comida às 19:00 para jejum noturno.
   Nota: Jejum noturno é o protocolo padrão, mas devido à fisiologia do mouse (por exemplo, aumento da utilização da glicose após jejum prolongado^10,11), jejum mais curto (~ 6 h) pode ser usado como descrito para ITT.
3. Após o jejum 14-16 h (9:00 am na manhã seguinte), medir o peso corporal e composição corporal de cada rato e calcular a quantidade de dosagem de glicose com base no peso corporal.
   Nota: Para evitar a superestimação da intolerância à glicose em camundongos obesos, a massa magra obtida a partir da análise da composição corporal pode ser usada para calcular a dosagem de glicose^12,13.
4. Para cada rato, corte a ponta da cauda (0,5-1,0 mm) usando uma tesoura cirúrgica limpa. Depois de limpar a primeira gota de sangue, tirar uma gota fresca de sangue da cauda e medir o nível de glicose no sangue de jejum de base com os glicosímetroes.
   Nota: O corte adicional da cauda não é necessário para cada medida da glicose de sangue durante GTT ou ITT. A ferida pode ser refrescada por abrading-lo com gaze para tirar uma gota de sangue.
5. Sujeito a camundongos a injeção intraperitoneal (i.p.) de glicose (1 mg/g de peso corporal).
   Nota: Com base no objetivo de um experimento (porexemplo, examinando os efeitos da incretina), a administração oral da glicose pode ser realizada por gavage oral. O protocolo para GTT oral (OGTT) pode ser encontrado em outro estudo^14.
6. Medir a glicose no sangue da cauda em 0, 5, 15, 30, 60 e 120 min injeção pós-glicose.
7. Depois de terminar o GTT, fornecer uma quantidade suficiente de alimentos.
8. Para o teste de tolerância à insulina (ITT), retire os alimentos às 9h.
   Nota: Uma vez que tanto GTT e ITT são experiências indutoras de estresse para ratos que podem elevar os níveis de glicose no sangue e mudar a fisiologia, recomenda-se para realizar ITT depois de fornecer pelo menos 2-3 dias de recuperação após o experimento GTT.
9. Após o jejum por 6 h (15:00), medir a glicose no sangue de base da cauda, como descrito no passo 4.4.
10. Sujeito a injeção de insulina i.p. (0,65 mU/g de peso corporal).
11. Medir a glicose no sangue da cauda em 0, 15, 30, 60, 90 e 120 min injeção pós-insulina.
12. Depois de terminar itt, fornecer uma quantidade suficiente de alimentos.

5. Calorimetria indireta

Nota: O metabolismo energético de camundongos tratados com FI pode ser avaliado através da calómetria indireta ao longo de um único ciclo de IF. Isso medirá o consumo de oxigênio (VO_2),produção de dióxido de carbono (VCO_2),razão de troca respiratória (RER) e calor (kcal/h).

1. Ligue o poder do sistema de calorímetro indireto pelo menos 2 h antes de executar o experimento.
   Nota: Este aquecimento do sistema é importante para uma medição precisa.
2. Prepare gaiolas com cama limpa, encha garrafas de água e adicione a quantidade pré-pesada de comida para os funis de alimentos.
3. Verifique a condição do refrigerante de drierite e limão. Se um indicador de cor do Drierite aparece rosa, o que indica que o drierite absorveu uma alta quantidade de umidade, é necessário substituir ou cubra com drierite fresco.
4. Calibrar o sistema usando um gás com a composição específica (0,5% CO_2,20,5% O_2).
5. Medir o peso corporal e a composição corporal de cada rato, que será usado para normalizar os dados de VO₂ e VCO_2.
6. Coloque suavemente um rato por gaiola.
7. Monte gaiolas metabólicas, coloque-as na câmara de ambiente temperatura controlada e conecte-se a linhas de gás e cabo de sensor de atividade.
8. Após a configuração do perfil do experimento, adicionando parâmetros experimentais apropriados usando o software, executar o programa para medição. O objetivo da medição do primeiro dia é proporcionar um período de aclimatação e medir o metabolismo energético de base.
9. Às 12:00 do dia seguinte, sujeitam ratos a 24 h de jejum, removendo alimentos e migalhas do funil e do fundo da gaiola. Se necessário, substitua com o fundamento limpo.
10. Após 24 h, adicione a quantidade pré-pesada de ração para o funil de alimentos para o período de realimentação.
11. Continue a medir para os próximos 48 h. Verifique regularmente se o sistema está funcionando sem interrupção de hardware ou software.
12. Após ter terminado a medida, termine o programa e traga ratos de volta a suas gaiolas originais. Medir a quantidade de restos de alimentos para examinar a ingestão de alimentos.
13. O protocolo detalhado para a calorimetria indireta pode ser encontrado em um estudo anterior⁹.

A Figura 1 mostra as análises alimentares após o jejum de 24 h e a comparação entre 1:1 e 2:1 jejum intermitente. Um período de jejum de 24 h resultou em uma redução de ~ 10% no peso corporal, que foi totalmente recuperada após 2 dias de realimentação (Figura 1A). Um período de jejum de 24 h induzida hiperfagia durante os 2 dias subsequentes de realimentação (Figura 1B). No entanto, a comparação da ingestão de energia entre 1:1 jejum de dias alternativos e jejum intermitente 2:1 revelou que o 1 dia do período de realimentação em 1:1 IF não foi suficiente (~80%) para compensar a perda calórica pelo jejum, em comparação com a condição AL(Figura 1C). Por outro lado, 99% da ingestão de energia foi totalmente compensada durante 2 dias de realimentação em 2:1 IF. Este regime permite o exame dos efeitos do isocaloric SE que são independentes da diferença calórica da entrada.

A Figura 2 ilustra um cronograma esquemático para os regimes isocalóricos de 2:1 IF e PF. Para minimizar as diferenças na ingestão calórica, uma observação feita no jejum de dia alternada^6,7,este protocolo estabeleceu um novo regime de IF composto por 2 dias de alimentação e períodos de jejum de 1 dia (2:1 IF)⁸, o que possibilitou o exame dos efeitos à saúde do IF isocalórico em camundongos do tipo selvagem. No entanto, em camundongos ob/ob, que exibiram comportamento hiperfágico, 2:1 Camundongos ob/ob tratados por IF apresentaram uma redução de 21% na ingestão calórica, em comparação com camundongos ob/ob AL¹⁵. Uma vez que isso impede uma comparação calórica-independente adequada, um grupo de controle pf que manteve a mesma ingestão calórica como ratos ob/ob tratados pela IF foi usado. Resumidamente, a quantidade total de alimentos consumidos durante 2 dias de alimentação em 2:1 SE os ratos foram divididos igualmente em três quantidades diárias, em seguida, fornecido s o grupo PF.

Para uma visão abrangente sobre os resultados metabólicos de 2:1 IF, comparamos os efeitos de AL, IF e PF no peso corporal, ingestão de alimentos e composição corporal em ratos selvagens e ob/ob dieta normal (ND) e HFD. Em comparação com AL, se o tratamento levou a um aumento mais baixo do peso corporal em camundongos WT alimentados com ND e HFD sem diferenças significativas na ingestão de alimentos(Figura 3A,B). A análise da composição corporal revelou que se reduziu especificamente a massa gorda sem alterações na massa magra em camundongos do tipo selvagem (Figura 3C). É possível que uma ingestão de energia acumulada ligeiramente, embora não significativa, menor ao longo de 16 semanas do programa de IF possa resultar em redução do ganho de peso corporal dos animais if. No entanto, se experimento com o regime de alimentação de pares confirmou que a diminuição do ganho de peso corporal por IF não foi devido à ingestão de energia alterada(Figura 3D,E). Ao contrário dos animais do tipo selvagem, o peso corporal dos camundongos ob/ob submetidos a IF (Ob-IF) foi menor do que o dos camundongos Ob-AL (Figura 3G). Isto é devido à hiperfagia (alimentação excessiva) de camundongos ob/ob, levando a um pouco maior (21%) ingestão de alimentos em camundongos AL, em comparação com animais tratados pelo FI(Figura 3H). Portanto, para examinar especificamente o efeito metabólico do IF de forma calórica e independente, um grupo controle de alimentação de pares foi empregado. No entanto, ao contrário de ratos do tipo selvagem⁸, camundongos Ob-PF eram indistinguíveis em comparação com camundongos Ob-IF em pesos corporais e composição corporal¹⁵ (Figura 3I). Estes resultados sugerem que a leptina é implicada provavelmente na redução de peso de corpo IF-mediada isocaloric nos ratos.

O principal benefício metabólico conferido pelo isocaloric IF é a homeostase de glicose melhorada. Como mostrado na figura 4A, B, C, D,os ratos HFD-IF exibiram uma melhoria significativa na homeostase da glicose. GTT mostrou que a glicose no sangue é mais rapidamente apurada em ratos tratados com IF, enquanto ITT revelou maior sensibilidade à insulina em camundongos HFD-IF, em comparação com ratos HFD-AL ou HFD-PF. Inesperadamente, apesar das falhas na redução de peso mediada pelo FI, os animais Ob-IF apresentaram um manejo de glicose significativamente melhorado com excursões menores de glicose no GTT, em comparação com camundongos Ob-PF (Figura 4E),enquanto a sensibilidade à insulina era indistinguível entre camundongos Ob-IF e Ob-PF (Figura 4F). Esta homeostase de glicose melhorada em camundongos Ob-IF é provavelmente mediada por aumentos no nível de plasma de peptídeo glucagon-like-1 (GLP-1) e secreção de insulina estimulada por glicose (dados não mostrados)¹⁵. No geral, usando este protocolo 2:1 IF e controle de PF calórico-independente adequado, mostramos os benefícios metabólicos do ISocaloric IF em ratos selvagens e ob/ob.

Um dos efeitos metabólicos do IF em camundongos do tipo selvagem é o maior consumo total de O_2, usado para estimar o gasto energético(Figura 5A,B). Esta elevação no consumo O₂ foi encontrada apenas durante o período de alimentação em camundongos IF, mas não período de jejum, em comparação com camundongos AL. O aumento do gasto energético foi amplamente mediado pela termogênese adiposa, como o escureamento de tecidos adiposos brancos e a ativação do tecido adiposo marrom (dados não mostrados)^8,16. A termogênese adiposa mediada pelo IF explicaria presumivelmente como camundongos do tipo selvagem submetidos à IF exibiram o ganho de peso corporal reduzido sem diferença na ingestão de alimentos, em comparação com camundongos AL. Por outro lado, o IF não conseguiu aumentar o consumo de O₂ em camundongos ob/ob (Figura 5C-D),e até levou a uma redução no gasto energético durante o período de jejum. Consistentemente, a termogênese adiposa induzida pelo IF foi completamente abolida em camundongos ob/ob (dados não mostrados). Estes dados sugerem uma possível limitação do IF, uma vez que pode funcionar de forma diferente para indivíduos com diferentes origens genéticas e ambientais.

Figura 1: Análises de alimentação após jejum e comparação de 24 h entre 1:1 e 2:1 IF. (A) Mudanças diárias de peso corporal de camundongos antes e depois de 24 h de jejum (n = 10). (B) Ingestão diária de energia antes e depois de 24 h de jejum (n = 5 gaiolas; 2 ratos por gaiola). (C) Comparação da ingestão de energia entre o jejum de dias alternados (ouseja, 1 dia de alimentação/1 dia de jejum, 1:1 IF) e jejum intermitente de 2:1 (ou seja, 2 dias de alimentação/1 dia de jejum). No regime de 1:1 IF, apenas ~80% da ingestão de alimentos foi compensada durante o subsequente 1 dia de realimentação em comparação com a ingestão de alimentos ao longo de 2 dias de alimentação. Por outro lado, 99% da ingestão de energia foi alcançada quando foram dados 2 dias de realimentação, em comparação com os mais de 3 dias de alimentação. Os dados são expressos como média ± SEM. Esta figura foi reproduzida com permissão de Kim et al.⁸. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 2: Ilustração esquemática do regime isocalórico 2:1 IF. Para o controle da PF, a quantidade de alimentos consumidos durante os 2 dias de alimentação por camundongos tratados com IF é dividida em três porções iguais, que é então fornecida diariamente aos camundongos PF durante o próximo ciclo. AL = ad libitum; PF = alimentação par. Parte desta figura foi reproduzida com permissão de Kim et al.⁸. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 3: Comparação de efeitos AL, IF e PF sobre o peso corporal, ingestão de alimentos e composição corporal entre ratos selvagens e ob/ob. (A,B,C) Peso corporal, ingestão de alimentos e composição corporal em camundongos do tipo selvagem tratados pelo FI dieta normal (ND) ou dieta rica em gordura (HFD) durante 16 semanas de regime de IF. Os dados são expressos como média ± SEM. (ND-AL: n = 7; ND-IF: n = 8; HFD-AL: n = 7; e HFD-IF: n = 8); anova de sentido único com análise pós-hoc do estudante-Newman-Keuls; **p < 0,01 vs. HFD-AL. (D, E,F)Peso corporal, ingestão de alimentos e composição corporal na PF vs. RATOS SE alimentados com dieta rica em gordura (HFD) durante 12 semanas de regime de IF. (PF: n = 6 e IF: n = 6); teste t doestudante não emparelhado de duas caudas; *p < 0,05 vs. HFD-PF; NS = não é significativo. (G, H, I) Peso corporal, ingestão de alimentos e composição corporal em camundongos ob/ob tratados pelo IF alimentados com ração normal (Ob-AL: n = 4; Ob-PF: n = 7; Ob-IF: n = 6); Ob-AL vs. Ob-PF: *p < 0,05; Ob-AL vs. Ob-IF: *p < 0,05; Ob-PF vs. Ob-IF. Painéis A-F foram reproduzidos com permissão de Kim et al.⁸. Painéis G-I foram reproduzidos com permissão de Kim et al.¹⁵. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 4: Homeostase melhorada da glicose pelo IF em ratos do selvagem-tipo e do ob/ob. (A,B) Gtt intraperitoneal e ITT em camundongos HFD-AL e HFD-IF do tipo selvagem após 16 semanas de regime de IF. O inset mostra área abaixo da curva (AUC); *p < 0,05 vs. HFD-AL. (C,D)GTT e ITT em HFD-PF em comparação com ratos do tipo selvagem HFD-IF após 12 semanas de regime de IF. A inserção mostra AUC; *p < 0,05 vs. HFD-PF. (E,F)GTT e ITT em Ob-IF em comparação com camundongos Ob-PF após 16 semanas de regime de IF. A inserção mostra AUC (* p < 0,05 vs. Ob-PF). Painéis A-D foram reproduzidos com permissão de Kim et al.⁸. Painéis E e F foram reproduzidos com permissão de Kim et al.¹⁵. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 5: Análise do gasto energético em camundongos selvagens e ob/ob tratados com IF. (A) Traços de consumo O₂ durante um ciclo de 2:1 IF em ratos do tipo selvagem (ouseja, 1 dia de jejum seguido por 2 dias de alimentação). (B) Média de O₂ consumo por hora durante o jejum, alimentação e um ciclo de 2:1 IF. Os dados são expressos como média ± SEM (HFD-AL: n = 6; e HFD-IF: n = 12); *p < 0,05 vs. HFD-AL. (C) O₂ traços de consumo de camundongos ob / ob durante um ciclo de 2:1 IF. (D)Média de Consumo O₂ por hora durante jejum, alimentação e um ciclo de 2:1 IF (Ob-PF: n = 7; Ob-IF: n = 6); *p < 0,05 vs. Ob-PF. Painel B foi reproduzido com permissão de Kim et al.⁸. Painéis C e D foram reproduzidos com permissão de Kim et al.¹⁵. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Tem sido bem documentado que se fornece efeitos benéficos para a saúde em várias doenças em seres humanos e animais^{8,15,16,17,18,19}. Seus mecanismos subjacentes, como autofagia e microbioma intestinal, foram recentemente elucidados. O protocolo apresentado descreve um regime isocalórico de 2:1 SE em camundongos para investigar benefícios metabólicos independentes de calorias do IF contra a obesidade induzida pela dieta e disfunção metabólica associada. Ao contrário do protocolo de jejum de dia suplepor (1:1 IF) que resulta em uma redução na ingestão calórica global^6,7,proporcionando mais 1 dia de realimentação no regime de 2:1 IF permite a manutenção de uma condição isocalórica em camundongos do tipo selvagem.

Além disso, em comparação com 1:1 IF, o regime de 2:1 IF pode reduzir possível estresse mediado pelo jejum ou torpor em camundongos²⁰ e também é comparável a um método dietético popular, a dieta 5:2². Embora seus efeitos não tenham sido testados, o regime pode ser modificado fornecendo dias adicionais de realimentação (por exemplo, 3:1 ou 4:1 IF). Além disso, este protocolo apresentado pode ser facilmente ajustado a uma escala horária chamada alimentação com restrição de tempo (TRF), em que o acesso aos alimentos é limitado a 8 h por dia durante a fase ativa²¹, que é conhecido por alcançar um regime de dieta isocalórica e proporcionar benefícios metabólicos contra a obesidade induzida por HFD e diabetes^19,21,22.

Como mostrado na análise de alimentação (Figura 1B), comportamento hiperfágico imediatamente após 24 h de jejum diminui gradualmente em camundongos do tipo selvagem, o que permite o IF isocalórico. No entanto, esta condição isocalórica não pode ser alcançada em camundongos ob/ob, pois lhes falta saciedade mediada pela leptina e metabolismo energético, levando a um fenótipo hiperfágico contínuo^23,24. Portanto, antes de realizar um experimento if, recomenda-se examinar o comportamento alimentar do modelo de interesse do mouse. Para examinar os efeitos do IF usando um modelo de camundongo hiperfágico (por exemplo, ob/ob, db/db, Sim1^+/-, MC4R^-/-)^24,25,26,conforme descrito neste protocolo, o emprego de um grupo de alimentação par como controle experimental isocalórico é importante para fazer comparações adequadas. Ele também requer um planejamento cuidadoso ao testar um modelo de rato com um fenótipo hipofóbico (por exemplo, hormônio contendo melanina ratos KO)²⁷.

Um fator importante a considerar para estudos do IF é a temperatura da carcaça, que afeta vários parâmetros fisiológicos e comportáveis nos ratos. Particularmente, a exposição ao frio (4-6 °C) aumenta significativamente a ingestão de energia para manter a temperatura corporal do núcleo²⁸. Em contraste, em condições termoneutras (30 °C) as quais o ganho de calor é equilibrado pela perda de calor, as reduções no consumo de alimentos são marcadamente reduzidas^8. Com relação aos resultados metabólicos, a exposição ao frio induz termogênese adiposa, que é dificultada pela condição termoneutra. Portanto, espera-se que a temperatura da habitação influencia os fenótipos metabólicos de SE e alimentação adequada: relação de jejum para alcançar isocaloric IF.

Na verdade, já foi demonstrado anteriormente que isocaloric 2:1 SE pode ser alcançado em condições termoneutras, levando a uma melhor saúde metabólica na obesidade induzida pela dieta e disfunção metabólica sem diferenças na ingestão de alimentos entre se e al grupos⁸. No entanto, isocaloric SE pode não ser possível com 2:1 relação a temperaturas frias, porque os ratos exposição ao frio irá mostrar um fenótipo hiperfágico, o que leva à subalimentação no grupo IF. Desde a exposição ao frio e SE apresentam resultados e mecanismos metabólicos comparáveis (ou seja, termogênese adiposa e melhor homeostase de glicose) que ajudam a combater a obesidade, há interesse em combinar essas duas intervenções para maximizar o impacto metabólico. Portanto, para testar corretamente isso, a realização da análise de alimentação antes de executar um experimento if e utilizando um grupo de controle de alimentação de pares exposição ao frio são recomendados.

Outros fatores que podem afetar potencialmente os resultados dos estudos do IF incluem a densidade habitacional. Semelhante ao estudo anterior, que mostrou redução do consumo de alimentos em camundongos mais densamente alojados²⁹, ratos de uma gaiola de cinco consumiram significativamente menos alimentos do que aqueles de uma gaiola de dois (resultados inéditos). Além disso, tem sido demonstrado que a densidade da habitação afeta significativamente a temperatura ambiente, como a temperatura dentro de uma gaiola de habitação cinco ratos é de 1-2 ° C maior do que aqueles que abrigam um a dois ratos³⁰. Embora este estudo concluiu que a densidade da habitação não afetou significativamente a ingestão de alimentos (examinado por 5 semanas), em um estudo if com duração de 12-16 semanas, a temperatura dentro da gaiola afetada pela densidade da habitação ainda pode influenciar a ingestão de alimentos e metabolismo energético. Juntos, é importante manter o mesmo número de camundongos alojados em uma gaiola e minimizar a alteração do número por gaiola ao longo de um estudo.

Em resumo, este relatório mostra um protocolo simples e reproduzível para testar isocaloric 2:1 IF em camundongos. Embora o presente estudo seja focado em benefícios metabólicos do IF na obesidade induzida pela dieta e disfunção metabólica, ele pode ser facilmente adaptado para investigar os efeitos protetores e terapêuticos do ISocalórico IF contra outras condições, como e doenças neurológicas.

Os autores não têm nada a divulgar.

K.-H.K.K foi apoiado pela Fundação Coração e Acidente Vascular Cerebral do Canadá Grant-in-Aid (G-18-0022213), J. P. Bickell Foundation e da Universidade de Ottawa Heart Institute Start-up fundo; H.-K.S. foi apoiado por doações dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (PJT-162083), Reuben e Helene Dennis Scholar e Sun Life Financial New Investigator Award for Diabetes Research from Banting & Best Diabetes Centre (BBDC) and Natural Sciences e Engineering Research Council (NSERC) do Canadá (RGPIN-2016-06610). R.Y.K. foi apoiado por uma bolsa da Universidade de Ottawa Cardiology Research Endowment Fund. J.H.L. foi apoiado pela Bolsa de Doutorado NSERC e bolsa de pós-graduação de Ontário. Y.O. foi apoiado pelo UOHI Endowed Graduate Award e pela Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology.