Bewertung der metabolischen Wirkungen des isokalorischen 2:1 Intermittierendes Fasten bei Mäusen

Der aktuelle Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für isokalorisches 2:1 intermittierendes Fasten zum Schutz und zur Behandlung vor Fettleibigkeit und gestörtem Glukosestoffwechsel bei Wildtyp- und Ob-/Ob-Mäusen.

Intermittierendes Fasten (IF), eine diätetische Intervention mit periodischer Energieeinschränkung, wurde als zahlreiche Vorteile und gegen metabolische Anomalien. Bisher wurden verschiedene Arten von IF-Modellen mit unterschiedlichen Fasten- und Fütterungszeiten dokumentiert. Die Interpretation der Ergebnisse ist jedoch eine Herausforderung, da viele dieser Modelle multifaktorielle Beiträge aus Zeit- und Kalorienrestriktionsstrategien beinhalten. Beispielsweise kann das alternative Tagesfastenmodell, das häufig als Nagetier-IF-Therapie verwendet wird, zu einer Unterfütterung führen, was darauf hindeutet, dass der nutzende Gesundheitsnutzen dieser Intervention wahrscheinlich sowohl über Kalorienrestriktions- als auch über Fasten-Refeeding-Zyklen vermittelt wird. Kürzlich wurde erfolgreich nachgewiesen, dass 2:1 IF, bestehend aus 1 Fastentag und 2 Tagen Fütterung, Schutz vor ernährungsbedingter Fettleibigkeit und metabolischen Verbesserungen bieten kann, ohne dass die Gesamtkalorienaufnahme reduziert wird. Hier wird ein Protokoll dieser isokalorischen 2:1 IF Intervention bei Mäusen vorgestellt. Ebenfalls beschrieben ist ein Paarfütterungsprotokoll (PF), das erforderlich ist, um ein Mausmodell mit verändertem Essverhalten, wie Hyperphagie, zu untersuchen. Mit dem 2:1 IF-Regime wird gezeigt, dass isokalorisches IF zu einer reduzierten Körpergewichtszunahme, einer verbesserten Glukosehomöostase und einem erhöhten Energieaufwand führt. Daher kann dieses Regime nützlich sein, um die gesundheitlichen Auswirkungen von IF auf verschiedene Krankheitszustände zu untersuchen.

Moderner Lebensstil ist mit längerer täglicher Nahrungsaufnahmezeit und kürzeren Fastenzeiten^{verbunden 1}. Dies trägt zur aktuellen globalen Fettleibigkeitsepidemie bei, mit metabolischen Nachteilen beim Menschen. Fasten wurde in der gesamten Geschichte der Menschheit praktiziert, und seine vielfältigen gesundheitlichen Vorteile umfassen längere Lebensdauer, reduzierte oxidative Schäden, und optimierte Energie Homöostase^2,3. Unter mehreren Möglichkeiten, Fasten zu praktizieren, periodische Energieentzug, als intermittierendes Fasten (IF) bezeichnet, ist eine beliebte Diätmethode, die von der allgemeinen Bevölkerung aufgrund seiner einfachen und einfachen Therapie weit verbreitet ist. Jüngste Studien in präklinischen und klinischen Modellen haben gezeigt, dass IF gesundheitliche Vorteile bieten kann, die mit verlängertem Fasten und Kalorienrestriktion vergleichbar sind, was darauf hindeutet, dass IF eine potenzielle therapeutische Strategie für Adipositas und Stoffwechselerkrankungen sein kann^2,3,4,5.

IF-Therapien variieren in Bezug auf Fastendauer und -häufigkeit. Alternatives Tagesfasten (d.h. 1 Tag Fütterung/1 Tag Fasten; 1:1 IF) war das am häufigsten verwendete IF-Regime bei Nagetieren, um seine positiven gesundheitlichen Auswirkungen auf Fettleibigkeit, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, neurodegenerative Erkrankungen usw. zu untersuchen.^2,3. Wie jedoch in früheren Studien^6,7und weiter mechanistisch in unserer Energieaufnahmeanalyse bestätigt, ergibt^sich8 , 1:1 IF-Ergebnisse in unterfütterung (80 %) aufgrund fehlender ausreichender Fütterungszeit, um den Energieverlust auszugleichen. Dies macht es unklar, ob die gesundheitlichen Vorteile von 1:1 IF durch Kalorienrestriktion oder Veränderung der Essgewohnheiten vermittelt werden. Daher wurde ein neues IF-Regime entwickelt, das hier gezeigt wird, bestehend aus einem 2-tägigen Fütterungs-/1-Tages-Fastenmuster (2:1 IF), das Mäusen genügend Zeit gibt, um die Nahrungsaufnahme zu kompensieren (99 %) und Körpergewicht. Diese Mäuse werden dann mit einer Ad libitum (AL)-Gruppe verglichen. Dieses Regime ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen von isokalorischem IF in Ermangelung einer Kalorienreduktion bei Wildtypmäusen.

Im Gegensatz dazu ist die AL-Fütterung in einem Mausmodell, das ein verändertes Fütterungsverhalten aufweist, möglicherweise keine richtige Kontrollbedingung, um die Auswirkungen von 2:1 IF zu vergleichen und zu untersuchen. Da beispielsweise Ob-/Ob-Mäuse (ein häufig verwendetes genetisches Modell für Adipositas) eine Hyperphagie aufgrund des Mangels an Leptin regulierenden Appetit und Sättigung aufweisen, weisen diejenigen mit 2:1 IF eine um 20 % reduzierte Kalorienaufnahme im Vergleich zu Ob/Ob-Mäusen mit AL-Fütterung auf. Um die Auswirkungen von IF bei ob/ob-Mäusen richtig zu untersuchen und zu vergleichen, muss daher eine Paarfütterungsgruppe als geeignete Kontrolle eingesetzt werden.

Insgesamt wird ein umfassendes Protokoll zur Durchführung isokalorischer 2:1 IF bereitgestellt, einschließlich der Verwendung einer Paarzuführung. Es wird weiter gezeigt, dass isokalorische 2:1 IF schützt Mäuse vor fettbedingter Ernährung-induzierte Fettleibigkeit und/oder metabolische Dysfunktion bei Wildtyp und Ob/ob Mäuse. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die positiven gesundheitlichen Auswirkungen von 2:1 IF auf verschiedene pathologische Erkrankungen einschließlich neurologischer Erkrankungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Krebs zu untersuchen.

Alle Methoden und Protokolle hier wurden von Animal Care Committees in The Animal Care and Veterinary Service (ACVS) der University of Ottawa und dem Centre for Phenogenomics (TCP) genehmigt und entsprechen den Standards des Canadian Council on Animal Care. Es sei darauf hingewiesen, dass alle hier beschriebenen Verfahren unter institutioneller und staatlicher Genehmigung sowie von Mitarbeitern durchgeführt werden sollten, die technisch kompetent sind. Alle Mäuse wurden in standardbelüfteten Käfigen in temperatur- und feuchtigkeitskontrollierten Räumen mit 12 h/12 h Licht-/Dunkelzyklen (21–22 °C, 30 %–60 % Luftfeuchtigkeit für normales Gehäuse) und freiem Zugang zu Wasser untergebracht. Männliche C57BL/6J und Ob/Ob-Mäuse wurden aus dem Jackson Laboratory gewonnen.

1. 2:1 Isokalorisches IF-Regime

1. Für magere und diätinduzierte Adipositas-Maus-Modelle, bereiten Sie entweder eine normale Ernährung (17% Fett, ND) oder fettreiche Ernährung (45% Fett, HFD).
   HINWEIS: 60% HFD kann verwendet werden, um schwere Diät-induzierte Fettleibigkeit zu induzieren; Aufgrund der Weichheit des Lebensmittelpellets ist es jedoch relativ schwierig, die tägliche Nahrungsaufnahme genau zu messen. Ein automatisiertes kontinuierliches Messsystem kann die Vielseitigkeit für verschiedene Arten von Diäten verbessern.
2. Messen Sie das Grundgewicht und die Körperzusammensetzung jeder Maus im Alter von 7 Wochen mit einer Skala bzw. EchoMRI.
   HINWEIS: Siehe Abschnitt 3 für die Messung der Körperzusammensetzung.
3. Basierend auf den Ergebnissen des Körpergewichts und der Körperzusammensetzung teilen Sie 7 Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse nach dem Zufallsprinzip und zu gleichen Gleichen in zwei Gruppen auf: ad libitum (AL) und intermittierende Fastengruppen (IF).
4. Platzieren Sie zwei bis drei Mäuse pro Käfig und sorgen Sie für freien Zugang zu Trinkwasser.
   HINWEIS: Die Anzahl der Mäuse pro Käfig kann das Verhalten der Nahrungsaufnahme beeinflussen. Es wird empfohlen, während der Studie in allen Gruppen eine gleiche Anzahl von Mäusen pro Käfig beizubehalten.
5. Geben Sie 1 Woche Der akklimatisieren für die neue Käfigumgebung und Ernährung, bevor Sie mit dem IF-Regime beginnen.
6. Fastenzeit: Um 12:00 Uhr Mäuse in einen sauberen Käfig mit frischer Bettwäsche bringen. Fügen Sie keine Lebensmittel für die IF-Gruppe hinzu, während Sie der AL-Gruppe eine gewogene Menge an Lebensmitteln zur Verfügung stellen.
   HINWEIS: Für jeden Fastenzyklus ist es wichtig, Käfige für AL- und IF-Gruppen zu ändern, um sicherzustellen, dass beide Gruppen der gleichen Bearbeitungszeit ausgesetzt sind.
7. Messen Sie nach 24 h die Gewichte von Mäusen in beiden Gruppen und die übrig gebliebenen Lebensmittel in AL-Käfigen.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, das Gewicht der Lebensmittelkrümel auf dem Futtertrichter und boden des Käfigs, vor allem bei der Verwendung von HFD, wie Mäuse oft entfernen kleine Pellets oder Fragmente von Lebensmitteln aus dem Trichter und halten sie in der Nähe von Nsternanden. Die durchschnittliche Energieaufnahme pro Maus am Ende jedes 2:1-Zyklus (3 Tage) beträgt etwa 35 kcal, was 10 g für eine normale Ernährung (3,3 kcal/g) und 7 g für HFD (4,73 kcal/g) entspricht.
8. Fütterungszeit: Eine gewogene Menge an Nahrung um 12:00 Uhr für AL- und IF-Gruppen bereitstellen.
9. Nach 48 h der Bereitstellung der Nahrung, messen Sie das Gewicht der übrig gebliebenen Nahrung und Mäuse.
10. Wiederholen Sie die Schritte 1.6–1.10 für die Dauer der Studie (z.B. 16 Wochen).

2. Pair-Feeding (PF) Kontrollgruppe

HINWEIS: Für ein IF-Experiment, bei dem ein verändertes Fütterungsverhalten in einem Mausmodell beobachtet wird (z.B. Hyperphagie bei ob/ob-Mäusen), ist es notwendig, eine Paarfütterungsgruppe als Kontrolle für einen korrekten kalorienunabhängigen Vergleich mit IF zu haben.

1. Für die PF-Kontrollgruppe den Versuchszeitplan so staffeln, dass der PF-Gruppe die gleiche Menge an Lebensmitteln angeboten wird, die von der IF-Gruppe verbraucht wird (Abbildung 2).
2. Messen Sie die Menge der von der IF-Gruppe verbrauchten Lebensmittel über einen Zeitraum von 2 Tagen nach der Fütterung.
3. Teilen Sie diese Menge an konsumierten Lebensmitteln in der IF-Gruppe gleichmäßig in drei Proportionen auf und geben Sie sie täglich um 12:00 Uhr an die PF-Gruppe weiter.
   HINWEIS: Die tägliche Bereitstellung einer gleichen Menge an Nahrungsmitteln ist von entscheidender Bedeutung. Im Falle von Mäusen mit Hyperphagie, wenn die Paar gefüttert Mäuse mit einer Menge an Nahrung weniger als ihr freiwilliger Verzehr auf einmal zur Verfügung gestellt werden, werden sie wahrscheinlich alle bereitgestellten Nahrung konsumieren und effektiv fasten. Dies kann dann einen ordnungsgemäßen Vergleich mit IF-behandelten Mäusen verhindern und das Ergebnis verwirren.
4. Wiederholen Sie die Schritte 2.1–2.3 für die Dauer der Studie.

3. Körperzusammensetzungsanalyse

HINWEIS: Da langfristiges IF das Körpergewicht bei Mäusen beeinflusst, kann die Körperzusammensetzung in geeigneten Zyklen (z. B. alle 3 oder 4 Zyklen) mit einem Körperzusammensetzungsanalysator gemessen werden, um Fett und magere Masse in lebenden, nicht anästhesierten Mäusen zu quantifizieren.

1. Schalten Sie den Körperzusammensetzungsanalysator ein.
   HINWEIS: Bevor Sie das Programm starten, lassen Sie die Maschine für mindestens 2-3 h eingeschaltet, um sich aufzuwärmen.
2. Führen Sie einen Systemtest am Körperzusammensetzungsanalysator durch, um dessen Messgenauigkeit zu testen. Kalibrieren Sie das System bei Bedarf mit Rapsöl- und Wasserproben.
3. Messen Sie das Körpergewicht jeder Maus.
4. Legen Sie die Maus in einen kleinen tierischen zylindrischen Halter.
5. Setzen Sie ein Trennzeichen ein, um die physische Bewegung der Maus während der Messung einzuschränken, und legen Sie den Halter in den Körperzusammensetzungsanalysator.
6. Führen Sie das Scanprogramm aus.
   HINWEIS: Die Analyse dauert etwa 90 bis 120 s.
7. Entfernen Sie nach der Messung den Halter aus dem Gerät und bringen Sie die Maus zurück in den Käfig.
   HINWEIS: Ein detaillierteres Protokoll finden Sie in einer früheren Publikation⁹.

4. Glukose- und Insulintoleranztests

1. Für den Glukosetoleranztest (GTT) das Körpergewicht und die Körperzusammensetzung jeder Maus messen, bevor sie dem Fasten ausgesetzt werden, und markieren Sie den Schwanz mit einem permanenten Marker für eine einfache und schnelle Indizierung.
2. Legen Sie Mäuse um 19:00 Uhr in neue Käfige ohne Nahrung für das Fasten über Nacht.
   HINWEIS: Nachtfasten ist das Standardprotokoll, aber aufgrund der Mausphysiologie (z.B. erhöhte Glukoseauslastung nach längerem Fasten^10,11) kann ein kürzeres Fasten (ca. 6 h) wie für ITT beschrieben verwendet werden.
3. Nach dem Fasten 14-16 h (9:00 Uhr am nächsten Morgen), messen Körpergewicht und Körperzusammensetzung jeder Maus und berechnen die Menge der Glukose-Dosierung basierend auf dem Körpergewicht.
   HINWEIS: Um eine Überschätzung der Glukose-Intoleranz bei übergewichtigen Mäusen zu vermeiden, kann die aus der Körperzusammensetzungsanalyse gewonnene magere Masse zur Berechnung der Glukosedosis^12,13verwendet werden.
4. Schneiden Sie für jede Maus die Schwanzspitze (0,5–1,0 mm) mit einer sauberen chirurgischen Schere. Nachdem Sie den ersten Tropfen Blut abgewischt haben, ziehen Sie einen frischen Tropfen Blut aus dem Schwanz und messen Sie den Blutzuckerspiegel des Basistempos mit dem Glukometer.
   HINWEIS: Für jede Blutzuckermessung während GTT oder ITT ist kein zusätzliches Schwanzschneiden erforderlich. Die Wunde kann durch Abschleifen mit Gaze erfrischt werden, um einen Tropfen Blut zu ziehen.
5. Mäuse einer intraperitonealen (i.p.) Glukoseinjektion (1 mg/g Körpergewicht) unterziehen.
   HINWEIS: Basierend auf dem Ziel eines Experiments (z.B. bei der Untersuchung von Incretin-Effekten) kann die orale Verabreichung von Glukose durch orale Gavage durchgeführt werden. Das Protokoll für orale GTT (OGTT) kann in einer anderen Studie gefunden werden¹⁴.
6. Messen Sie den Blutzucker aus dem Schwanz bei 0, 5, 15, 30, 60 und 120 min nach der Glukoseinjektion.
7. Nach Abschluss des GTT, bieten eine ausreichende Menge an Nahrung.
8. Für den Insulintoleranztest (ITT) Lebensmittel um 9:00 Uhr entfernen.
   HINWEIS: Da sowohl GTT als auch ITT stressauslösende Erfahrungen für Mäuse sind, die den Blutzuckerspiegel erhöhen und die Physiologie verändern können, wird empfohlen, ITT durchzuführen, nachdem sie nach dem GTT-Experiment mindestens 2–3 Tage Erholung sanieren.
9. Messen Sie nach dem Fasten für 6 h (15:00 Uhr) den Ausgangsblutzucker aus dem Schwanz, wie in Schritt 4.4 beschrieben.
10. Mäusen eine i.p. Injektion von Insulin (0,65 mU/g Körpergewicht) unterziehen.
11. Messen Sie den Blutzucker aus dem Schwanz bei 0, 15, 30, 60, 90 und 120 min postinsulinierte Injektion.
12. Nach Abschluss von ITT, bieten Eine ausreichende Menge an Lebensmitteln.

5. Indirekte Kalorimmetrie

HINWEIS: Der Energiestoffwechsel von IF-behandelten Mäusen kann durch indirekte Kalorimetrie über einen einzigen IF-Zyklus weiter untersucht werden. Dabei wird der Sauerstoffverbrauch (VO₂), die Kohlendioxidproduktion (VCO₂), das Atemaustauschverhältnis (RER) und die Wärme (kcal/h) gemessen.

1. Schalten Sie die Leistung des indirekten Kalorimetersystems mindestens 2 h ein, bevor Sie das Experiment ausführen.
   HINWEIS: Dieses System-Warm-up ist wichtig für die genaue Messung.
2. Bereiten Sie Käfige mit sauberer Bettwäsche vor, füllen Sie Wasserflaschen und fügen Sie die vorgewogene Menge an Chow zu den Lebensmitteltrichtern hinzu.
3. Überprüfen Sie den Zustand der Drierite und Kalk Soda. Wenn ein Farbindikator des Drierites rosa erscheint, was darauf hinweist, dass die Drierite eine hohe Menge an Feuchtigkeit absorbiert hat, ist es notwendig, zu ersetzen oder oben mit frischem Drierite.
4. Kalibrieren Sie das System mit einem Gas mit der spezifischen Zusammensetzung (0,5%_CO2, 20,5% O₂).
5. Messen Sie das Körpergewicht und die Körperzusammensetzung jeder Maus, die verwendet wird, um VO_2- und VCO_2-Daten zu normalisieren.
6. Legen Sie vorsichtig eine Maus pro Käfig.
7. Montieren Sie Stoffwechselkäfige, legen Sie sie in die temperaturgeregelte Umgebungskammer und verbinden Sie sie mit Gasleitungen und Aktivitätssensorkabeln.
8. Nachdem Sie das Experimentprofil durch Hinzufügen geeigneter experimenteller Parameter mithilfe der Software eingerichtet haben, führen Sie das Programm zur Messung aus. Der Zweck der ersten Tagesmessung ist es, eine Phase der Akklimatisierung zu bieten und den Basisenergiestoffwechsel zu messen.
9. Um 12:00 Uhr am nächsten Tag, unterziehen Mäuse zu 24 h Fasten, indem Sie Nahrung und Krümel aus dem Trichter und Boden des Käfigs entfernen. Bei Bedarf durch saubere Bettwäsche ersetzen.
10. Nach 24 h die vorgewogene Menge an Chow in den Futtertrichter für die Nachfütterungszeit geben.
11. Messen Sie weiterhin für die nächsten 48 h. Überprüfen Sie regelmäßig, ob das System ohne Hardware- oder Softwareunterbrechung läuft.
12. Beenden Sie nach Abschluss der Messung das Programm und bringen Sie die Mäuse zurück in ihre ursprünglichen Käfige. Messen Sie die Menge der übrig gebliebenen Lebensmittel, um die Nahrungsaufnahme zu untersuchen.
13. Das detaillierte Protokoll für die indirekte Kalorimetrie finden Sie in einer früheren Studie⁹.

Abbildung 1 zeigt die Fütterungsanalysen nach 24 h Fasten und den Vergleich zwischen 1:1 und 2:1 intermittierendem Fasten. Eine 24-Stunden-Fastenzeit führte zu einer Verringerung des Körpergewichts um 10 %, die nach 2 Tagen Wiederfütterung vollständig wiederhergestellt wurde (Abbildung 1A). Eine 24 h Fastenzeit induzierte Hyperphagie während der folgenden 2 Tage der Nachfütterung (Abbildung 1B). Dennoch ergab der Vergleich der Energieaufnahme zwischen 1:1 alternativem Fasten und 2:1 intermittierendem Fasten, dass der 1. Tag der Nachfütterungszeit in 1:1 IF nicht ausreichte (80%) um den Kalorienverlust durch Fasten zu kompensieren, im Vergleich zur AL-Bedingung (Abbildung 1C). Auf der anderen Seite wurden 99% der Energieaufnahme während 2 Tagen der Nachfütterung in 2:1 IF vollständig kompensiert. Dieses Regime ermöglicht die Untersuchung der Wirkungen von isokalorischem IF, die unabhängig von der Kalorienaufnahmedifferenz sind.

Abbildung 2 zeigt eine schematische Zeitachse für die isokalorischen 2:1 IF- und PF-Schemata. Um die Unterschiede in der Kalorienzufuhr zu minimieren, wurde durch eine Beobachtung im alternativen Tagesfasten^6,7, dieses Protokoll ein neues IF-Regime mit 2-Tages-Fütterung und 1 Tag Fastenzeiten (2:1 IF)⁸, die die Untersuchung der gesundheitlichen Auswirkungen von isokalorischen IF bei Wild-Typ-Mäusen ermöglicht. Bei Ob-/Ob-Mäusen, die ein hyperphagisches Verhalten zeigten, zeigten 2:1 IF-behandelte Ob-/Ob-Mäuse jedoch eine Verringerung der Kalorienaufnahme um 21 %, verglichen mit ob/ob AL-Mäusen¹⁵. Da dies einen ordnungsgemäßen kalorischunabhängigen Vergleich verhindert, wurde eine PF-Kontrollgruppe verwendet, die die gleiche Kalorienaufnahme wie IF-behandelte Ob-/Ob-Mäuse aufrechterhielt. Kurz gesagt, die Gesamtmenge der Nahrung, die während 2 Tage der Fütterung in 2:1 IF-Mäusen verbraucht wurde, wurde gleichmäßig in drei Tagesmengen aufgeteilt, die dann der PF-Gruppe zur Verfügung gestellt wurden.

Für einen umfassenden Überblick über die metabolischen Ergebnisse von 2:1 IF haben wir die Auswirkungen von AL, IF und PF in Körpergewicht, Nahrungsaufnahme und Körperzusammensetzung in Wild-Typ- und ob/ob-Mäusen unter normaler Ernährung (ND) und HFD verglichen. Im Vergleich zu AL führte die IF-Behandlung zu einem geringeren Anstieg des Körpergewichts bei ND- und HFD-gefütterten WT-Mäusen ohne signifikante Unterschiede in der Nahrungsaufnahme(Abbildung 3A,B). Die Analyse der Körperzusammensetzung ergab, dass IF die Fettmasse ohne Veränderungen der mageren Masse bei Wildmäusen spezifisch reduzierte (Abbildung 3C). Es ist möglich, dass eine leicht, wenn auch nicht signifikant, geringere akkumulierte Energieaufnahme über 16 Wochen des IF-Programms zu einer reduzierten Körpergewichtszunahme von IF-Tieren führen könnte. If-Experiment mit dem Paarfütterungsschema bestätigte jedoch, dass die verringerte Körpergewichtszunahme durch IF nicht auf eine veränderte Energieaufnahme zurückzuführen war (Abbildung 3D,E). Im Gegensatz zu Wildtieren war das Körpergewicht von Ob/ob-Mäusen, die IF (Ob-IF) unterworfen waren, niedriger als das von Ob-AL-Mäusen(Abbildung 3G). Dies ist auf Hyperphagie (übermäßige Sessien) von Ob/Ob-Mäusen zurückzuführen, was zu einer leicht höheren (21%) Nahrungsaufnahme bei AL-Mäusen im Vergleich zu MIT IF behandelten Tieren (Abbildung 3H). Um die metabolische Wirkung von IF gezielt kalorisch-unabhängig zu untersuchen, wurde daher eine Paarfütterungskontrollgruppe eingesetzt. Im Gegensatz zu Wildtypmäusen⁸waren Ob-PF-Mäuse jedoch im Vergleich zu Ob-IF-Mäusen bei Körpergewichten und Körperzusammensetzung¹⁵ (Abbildung 3I) nicht zu unterscheiden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Leptin wahrscheinlich in isokalorische IF-vermittelte Körpergewichtsreduktion bei Mäusen verwickelt ist.

Der wichtigste metabolische Nutzen, der von isokalorischer IF verliehen wird, ist die verbesserte Glukosehomöostase. Wie in Abbildung 4A,B,C,Ddargestellt, zeigten HFD-IF-Mäuse eine signifikante Verbesserung der Glukosehomöostase. GTT zeigte, dass Blutzucker bei MIT IF behandelten Mäusen schneller gecleart wird, während ITT eine höhere Insulinempfindlichkeit bei HFD-IF-Mäusen zeigte als bei HFD-AL- oder HFD-PF-Mäusen. Unerwartet erweisenurrungen zeigten Ob-IF-Tiere trotz der Fehler bei der IF-vermittelten Gewichtsreduktion eine deutlich verbesserte Glukosebehandlung mit kleineren Glukoseexkursionen in GTT im Vergleich zu Ob-PF-Mäusen (Abbildung 4E), während die Insulinempfindlichkeit zwischen Ob-IF- und Ob-PF-Mäusen nicht zu unterscheiden war (Abbildung 4F). Diese verbesserte Glukosehomöostase bei Ob-IF-Mäusen wird wahrscheinlich durch Erhöhungen des Plasmaspiegels von Glucagon-ähnlichem Peptid-1 (GLP-1) und glukosestimulierter Insulinsekretion (Daten nicht gezeigt)^{vermittelt 15}. Insgesamt zeigten wir mit diesem 2:1 IF-Protokoll und der richtigen kalorienunabhängigen PF-Kontrolle die metabolischen Vorteile von isokalorischem IF bei Wildtyp- und Ob-/Ob-Mäusen.

Eine der metabolischen Wirkungen von IF bei Wildtypmäusen ist ein höherer Gesamt-O2-Verbrauch, der zur Schätzung des Energieverbrauchs verwendet wird (Abbildung 5 A,B). Diese Erhöhung des O_2-Verbrauchs wurde nur während der Fütterungszeit bei IF-Mäusen festgestellt, aber nicht während der Fastenzeit, im Vergleich zu AL-Mäusen. Der erhöhte Energieverbrauch wurde weitgehend durch Fettthermogenese vermittelt, wie z. B. das Bräunen von weißen Fettgeweben und die Aktivierung von braunem Fettgewebe (Daten nicht gezeigt)^8,16. Die IF-vermittelte Adipo-Thermogenese würde vermutlich erklären, wie Wildtyp-Mäuse, die IF ausgesetzt waren, die reduzierte Körpergewichtszunahme ohne Unterschied in der Nahrungsaufnahme zeigten, im Vergleich zu AL-Mäusen. Auf der anderen Seite konnte IF den_O2-Verbrauch bei Ob-/Ob-Mäusen nicht erhöhen (Abbildung 5C-D), und führte sogar zu einer Verringerung des Energieverbrauchs während der Fastenzeit. Konsequenterweise wurde die IF-induzierte Adipo-Thermogenese bei Ob-Mäusen vollständig abgeschafft (Daten nicht gezeigt). Diese Daten deuten auf eine mögliche Einschränkung von IF hin, da es für Personen mit unterschiedlichem genetischen und ökologischen Hintergrund unterschiedlich funktionieren kann.

Abbildung 1: Fütterungsanalysen nach 24 h Fasten und Vergleich zwischen 1:1 und 2:1 IF. (A) Tägliche Körpergewichtsänderungen von Mäusen vor und nach 24 h Fasten (n = 10). (B) Tägliche Energieaufnahme vor und nach 24 h Fasten (n = 5 Käfige; 2 Mäuse pro Käfig). (C) Vergleich der Energieaufnahme zwischen abwechselnden Tagesfasten (d.h. 1 Tag Fütterung/1 Tag Fasten, 1:1 IF) und 2:1 intermittierendem Fasten (d. h. 2 Tage Fütterung/1 Tag Fasten). In der 1:1 IF-Therapie wurden während des folgenden 1 Tages der Nahrungsaufnahme nur 80 % der Nahrungsaufnahme kompensiert, verglichen mit der Nahrungsaufnahme über 2 Tage der Fütterung. Auf der anderen Seite wurde 99% der Energieaufnahme erreicht, wenn 2 Tage der Refeeding gegeben wurden, verglichen mit der über 3 Tage der Fütterung. Die Daten werden als Mittelwert -SEM ausgedrückt. Diese Figur wurde mit Genehmigung von Kim et al.⁸reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Schematische Darstellung des isokalorischen 2:1 IF-Regimes. Bei der PF-Kontrolle wird die Menge der Nahrung, die während der 2 Tage der Fütterung von IF-behandelten Mäusen verzehrt wird, in drei gleiche Portionen aufgeteilt, die dann pf-Mäusen während des nächsten Zyklus täglich zur Verfügung gestellt werden. AL = ad libitum; PF = Paarfütterung. Ein Teil dieser Figur wurde mit Genehmigung von Kim et al.⁸reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Vergleich der Auswirkungen von AL, IF und PF auf körpergewichtige, Nahrungsaufnahme und Körperzusammensetzung zwischen Wildtyp- und Ob-/Ob-Mäusen. (A,B,C) Körpergewicht, Nahrungsaufnahme und Körperzusammensetzung bei AL- oder IF-behandelten Wildtypmäusen unter normaler Ernährung (ND) oder fettarmer Ernährung (HFD) während 16 Wochen IF-Therapie. Die Daten werden als Mittelwert -SEM ausgedrückt. (ND-AL: n = 7; ND-IF: n = 8; HFD-AL: n = 7; und HFD-IF: n = 8); ein- oder zweiwegig ANOVA mit Student-Newman-Keuls Post-hoc-Analyse; **p < 0,01 vs. HFD-AL. (D,E,F) Körpergewicht, Nahrungsaufnahme und Körperzusammensetzung in PF vs. IF-Mäusen, die während 12 Wochen IF-Therapie mit fettarmer Ernährung (HFD) gefüttert werden. (PF: n = 6 und IF: n = 6); zweischwanzungepaarter Schüler t-Test; *p < 0,05 vs. HFD-PF; NS = nicht signifikant. (G,H,I) Körpergewicht, Nahrungsaufnahme und Körperzusammensetzung in AL-, PF- oder IF-behandelten Ob-/Ob-Mäusen, die mit normalem Chow gefüttert werden (Ob-AL: n = 4; Ob-PF: n = 7; Ob-IF: n = 6); Ob-AL vs. Ob-PF: *p < 0.05; Ob-AL vs. Ob-IF: *p < 0.05; Ob-PF vs.. Ob-IF. Die Panels A–F wurden mit Genehmigung von Kim et al.⁸reproduziert. Panels G–I wurden mit Genehmigung von Kim et al.¹⁵reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Verbesserte Glukosehomöostase durch IF sowohl bei Wildtyp- als auch bei Ob-/Ob-Mäusen. (A,B) Intraperitoneale GTT und ITT bei HFD-AL und HFD-IF Wildtypmäusen nach 16 Wochen IF-Therapie. Der Einset zeigt die Fläche unter Kurve (AUC); *p < 0.05 vs. HFD-AL. (C,D) GTT und ITT in HFD-PF im Vergleich zu HFD-IF Wildtypmäusen nach 12 Wochen IF-Therapie. Der Einset zeigt AUC; *p < 0.05 vs. HFD-PF. (E,F) GTT und ITT in Ob-IF im Vergleich zu Ob-PF-Mäusen nach 16 Wochen IF-Therapie. Der Einset zeigt AUC (*p < 0.05 vs. Ob-PF). Die Panels A-D wurden mit Genehmigung von Kim et al.⁸reproduziert. Die Panels E und F wurden mit Genehmigung von Kim et al.¹⁵reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Analyse des Energieverbrauchs bei IF-behandelten Wildtyp- und Ob-/Ob-Mäusen. (A) Spuren des_{O2-Verbrauchs} während eines Zyklus von 2:1 IF bei Wildmäusen (d.h. 1 Tag Fasten, gefolgt von 2 Tagen Fütterung). (B) Durchschnitt des O_2-Verbrauchs pro Stunde während des Fastens, der Fütterung und eines Zyklus von 2:1 IF. Die Daten werden als Mittelwert -SEM (HFD-AL: n = 6; und HFD-IF: n = 12) ausgedrückt; *p < 0,05 vs. HFD-AL. (C)_O2 Verbrauchsspuren von Ob/Ob-Mäusen während eines Zyklus von 2:1 IF. (D) Durchschnitt des O_2-Verbrauchs pro Stunde während des Fastens, der Fütterung und eines Zyklus von 2:1 IF (Ob-PF: n = 7; Ob-IF: n = 6); *p < 0,05 vs. Ob-PF. Panel B wurde mit Genehmigung von Kim et al.⁸reproduziert. Die Panels C und D wurden mit Genehmigung von Kim et al.¹⁵reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Es ist gut dokumentiert, dass IF positive auswirkungen auf verschiedene Krankheiten bei Mensch und^Tier8^{,15,16,17,18,19}. Seine zugrunde liegenden Mechanismen, wie Autophagie und Darmmikrobiom, wurden vor kurzem aufgeklärt. Das vorgestellte Protokoll beschreibt ein isokalorisches 2:1 IF-Regime bei Mäusen zur Untersuchung kalorienunabhängiger metabolischer Vorteile von IF gegen ernährungsbedingte Fettleibigkeit und damit verbundene metabolische Dysfunktion. Im Gegensatz zum alternativen Tagesfastenprotokoll (1:1 IF), das zu einer Verringerung der Gesamtkalorienaufnahme^6,7führt, was 1 weitere Tage der Nachfütterung in der 2:1 IF-Therapie ermöglicht, die Aufrechterhaltung eines isokalorischen Zustandes bei Wildmäusen.

Zusätzlich, im Vergleich zu 1:1 IF, kann das 2:1 IF-Regime möglichen Fasten-vermittelten Stress oder Torpor bei Mäusen²⁰ reduzieren und ist auch vergleichbar mit einer beliebten Diätmethode, der 5:2-Diät². Obwohl seine Auswirkungen nicht getestet wurden, kann das Regime durch zusätzliche Tage der Nachfütterung (z. B. 3:1 oder 4:1 IF) modifiziert werden. Darüber hinaus kann dieses vorgestellte Protokoll leicht an eine stündliche, so genannte zeitbeschränkte Fütterung (TRF) angepasst werden, bei der der Zugang zu Lebensmitteln während der aktiven Phase²¹auf 8 h pro Tag begrenzt ist, die bekanntermaßen ein isokalorisches Diätschema erreicht und metabolische Vorteile gegen HFD-induzierte Fettleibigkeit und Diabetes^19,21,22bietet.

Wie in der Fütterungsanalyse gezeigt (Abbildung 1B), nimmt das hyperphagische Verhalten unmittelbar nach 24 h Fasten bei Wildtypmäusen allmählich ab, was isokalorisches IF ermöglicht. Dieser isokalorische Zustand kann jedoch bei ob/ob-Mäusen nicht erreicht werden, da ihnen Leptin-Signalisierungs-vermittelte Sättigung und Energiestoffwechsel fehlen, was zu einem kontinuierlichen hyperphagischen Phänotyp^23,24führt. Daher wird empfohlen, vor der Durchführung eines IF-Experiments das Fütterungsverhalten des Mausmodells von Interesse zu untersuchen. Um die Auswirkungen von IF mit einem hyperphagischen Mausmodell zu untersuchen (z.B. ob/ob, db/db, Sim1^+/-, MC4R^-/-)^24,25,26, wie in diesem Protokoll beschrieben, ist die Verwendung einer Paarfütterungsgruppe als isokalorische experimentelle Kontrolle wichtig, um richtige Vergleiche anzustellen. Es erfordert auch eine sorgfältige Planung beim Testen eines Mausmodells mit einem hypophagischen Phänotyp (z.B. Melanin-haltiges Hormon KO-Mäuse)²⁷.

Ein wichtiger Faktor für IF-Studien ist die Gehäusetemperatur, die verschiedene physiologische und Verhaltensparameter bei Mäusen beeinflusst. Insbesondere die Kälteexposition (4–6 °C) erhöht die Energieaufnahme deutlich, um die Körperkerntemperatur²⁸zu halten. Im Gegensatz dazu wird bei thermoneutralen Bedingungen (30 °C), unter denen der Wärmegewinn durch Wärmeverlust ausgeglichen wird, der Rückgang des Lebensmittelverbrauchs deutlich reduziert⁸. In Bezug auf metabolische Ergebnisse induziert die Kälteexposition eine Adipo-Thermogenese, die durch einen thermoneutralen Zustand behindert wird. Daher wird erwartet, dass die Gehäusetemperatur die metabolischen Phänotypen von IF und das entsprechende Fütterungs-Fasten-Verhältnis beeinflusst, um isokalorisches IF zu erreichen.

Tatsächlich wurde bereits gezeigt, dass isokalorisches 2:1 IF unter thermoneutralen Bedingungen erreicht werden kann, was zu einer verbesserten metabolischen Gesundheit bei ernährungsinduzierter Fettleibigkeit und metabolischer Dysfunktion ohne Unterschiede in der Nahrungsaufnahme zwischen IF- und AL-Gruppen⁸führt. Isokalorisches IF ist jedoch möglicherweise nicht mit einem Verhältnis von 2:1 bei kalten Temperaturen erreichbar, da Mäuse unter Kaltexposition einen hyperphagischen Phänotyp aufweisen, der zu einer Unterfütterung in der IF-Gruppe führt. Da Kälteexposition und IF vergleichbare metabolische Ergebnisse und Mechanismen (d. h. Fettthermogenese und verbesserte Glukosehomöostase) zeigen, die zur Bekämpfung von Fettleibigkeit beitragen, besteht Interesse daran, diese beiden Interventionen zu kombinieren, um die metabolische Wirkung zu maximieren. Daher wird empfohlen, um dies richtig zu testen, die Durchführung der Fütterungsanalyse vor dem Ausführen eines IF-Experiments und die Verwendung einer Paarfütterungskontrollgruppe unter Kaltexposition.

Andere Faktoren, die die Ergebnisse von IF-Studien beeinflussen können, sind die Wohnungsdichte. Ähnlich wie in der vorherigen Studie, die einen geringeren Nahrungsverbrauch bei dichter untergebrachten Mäusen^{zeigte 29}, konsumierten Mäuse aus einem Käfig von fünf Deutlich weniger Nahrung als die aus einem Käfig von zwei (unveröffentlichte Ergebnisse). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Gehäusedichte die Umgebungstemperatur erheblich beeinflusst, da die Temperatur in einem Käfig mit fünf Mäusen 1–2 °C höher ist als die von ein bis zwei Mäusen³⁰. Obwohl diese Studie zu dem Schluss kam, dass die Wohnungsdichte die Nahrungsaufnahme nicht signifikant beeinflusst (5 Wochen lang untersucht), kann die Temperatur im Käfig, die von der Wohnungsdichte betroffen ist, in einer IF-Studie, die von der Wohnungsdichte betroffen ist, die Nahrungsaufnahme und den Energiestoffwechsel noch beeinflussen. Gemeinsam ist es wichtig, die gleiche Anzahl von Mäusen in einem Käfig unterzubringen und die Anzahl pro Käfig im Laufe einer Studie zu minimieren.

Zusammenfassend zeigt dieser Bericht ein einfaches und reproduzierbares Protokoll zum Testen isokalorischer 2:1 IF bei Mäusen. Obwohl sich die aktuelle Studie auf metabolische Vorteile von IF bei ernährungsbedingter Fettleibigkeit und metabolischer Dysfunktion konzentriert, kann sie leicht angepasst werden, um die schützende und therapeutische Wirkung von isokalorischem IF gegen andere Erkrankungen wie kardiovaskuläre und neurologischen Erkrankungen.

Die Autoren haben nichts zu verraten.

K.-H.K wurde von der Heart and Stroke Foundation of Canada Grant-in-Aid (G-18-0022213), der J. P. Bickell Foundation und dem Start-up-Fonds des University of Ottawa Heart Institute unterstützt; H.-K.S. wurde durch Stipendien der Canadian Institutes of Health Research (PJT-162083), Reuben und Helene Dennis Scholar und sun Life Financial New Investigator Award for Diabetes Research vom Banting & Best Diabetes Centre (BBDC) und Natural Sciences und Natural Sciences unterstützt. und Engineering Research Council (NSERC) kanada (RGPIN-2016-06610). R.Y.K. wurde durch ein Stipendium des University of Ottawa Cardiology Research Endowment Fund unterstützt. J.H.L. wurde durch das NSERC Doctoral Scholarship und Ontario Graduate Scholarship unterstützt. Y.O. wurde vom UOHI Endowed Graduate Award und dem Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology unterstützt.