Avaliação do perfil metabólico das células de leucemia primária

Aqui nós apresentamos um protocolo para análise de seu estado metabólico e o isolamento de células leucêmicas da medula óssea de pacientes de leucemia. Avaliação do perfil metabólico das células de leucemia primária poderia contribuir para melhor caracterizar a demanda de células primárias e poderia levar a medicina mais personalizada.

A exigência metabólica das células cancerosas pode influenciar negativamente, sobrevivência e a eficácia do tratamento. Hoje em dia, orientação farmacêutica das vias metabólicas é testado em muitos tipos de tumores. Assim, a caracterização de configuração metabólica de célula de câncer é inevitável fim de direcionar o caminho correto para melhorar o resultado global dos pacientes. Infelizmente, na maioria dos tipos de câncer, as células malignas são muito difíceis de obter em números mais altos e a biópsia do tecido é necessária. A leucemia é uma exceção, onde um número suficiente de células leucêmicas pode ser isolado da medula óssea. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de células leucêmicas da medula óssea de pacientes de leucemia e posterior análise de seu estado metabólico, usando o analisador de fluxo extracelular. Células leucêmicas são isoladas pelo gradiente de densidade, que não afeta a sua viabilidade. O próximo passo de cultivo ajuda a regenerar, assim, o estado metabólico medido é o estado das células em condições ideais. Este protocolo permite alcançar resultados consistentes, bem padronizados, que poderiam ser usados para a terapia personalizada.

O perfil metabólico é uma das principais características das células e bioenergética alterada são consideradas uma das marcas de câncer^1,2,3. Além disso, alterações na configuração da metabólica poderiam ser usadas no tratamento de câncer pela segmentação vias de transdução de sinal ou maquinaria enzimática de células de câncer a^4,5,6. Conhecendo a predisposição metabólica das células cancerosas é, assim, uma vantagem e pode ajudar a melhorar a terapia atual.

Há uma abundância de métodos já estabelecidos que pode avaliar a atividade metabólica das células em cultura. Em relação a glicólise, a absorção de glicose pode ser medida pela rotulagem radioactiva, usando 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) ou níveis de lactato extracelular mensurados enzimaticamente^7,8. Taxa de oxidação de ácidos graxos é outro parâmetro metabólico medido por desvendar rotulado palmitato^9,10. Taxa de consumo de oxigênio é um método utilizado para determinar a actividade mitocondrial em células^11,12, juntamente com a membrana mitocondrial potencial avaliação^13,14, ATP/ADP (adenosina 5 '-trifosfato/adenosina 5 '-difosfato) relação medição¹⁵ ou total intracelular ATP medição¹⁶. Sinalização de caminhos conhecidos por regulam processos metabólicos pode ser determinada por quantificações de proteínas e pode melhorar a compreensão das medições metabólicas^17,18,19.

No entanto, todos esses métodos medem apenas uma ou, no melhor cenário, alguns parâmetros metabólicos em uma amostra simultaneamente. Importante, medição simultânea da taxa de consumo de oxigênio (OCR) e taxa de acidificação do extracelular (ECAR) pode ser alcançada através da análise de fluxo extracelular por, por exemplo, cavalos-marinhos XFp Analyzer. OCR é um indicador da respiração mitocondrial e ECAR resulta principalmente da glicólise (que não podemos ignorar o CO₂ produção possivelmente elevando ECAR de células com atividade alta fosforilação oxidativa)²⁰. Até agora, vários tipos de células têm sido estudados usando estes analisadores^21,22,23.

Aqui descrevemos o protocolo para a análise de fluxo extracelular primário blastos (células de leucemia derivadas o estágio imaturo hematopoiético) de pacientes de leucemia. O melhor de nosso conhecimento, um protocolo específico para explosões primários não está disponível ainda.

Todas as amostras foram obtidas com o informed consent dos pais ou responsáveis das crianças e a aprovação do Comité de ética da Universidade Charles em Praga, República Checa, o estudo não. NV15-28848A.

1. preparação dos reagentes

1. Prepare 500 mL de PBS pela dissolução de 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄, 1,47 milímetros KH₂PO₄, em ddH₂O. ajustar o pH para 7,4 com HCl. esterilize em autoclave.
2. Preparar 100 mL de meio RPMI: meio RPMI-1640 com L-alanil-glutamina suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 μg/mL).
3. Prepare 50 mL de 0.1 M NaHCO₃ em água destilada. Ajustar o pH a 8.1, filtro esterilizar (0,22 μm) e armazenar a 4 ° C.
   Nota: Para duas placas de analisador de fluxo 8 poços extracelular, prepare 250 μL de 0,1 M NaHCO₃ pH 8.1.
4. Prepare-se 1 mL de 2 M-D-glicose em água destilada. Filtro de esterilizar (0,22 μm) e armazenar a-20 ° C.
5. Prepare-se 100 μL de 1mm oligomicina A em etanol. Filtro de esterilizar (0,22 μm) e armazenar a-20 ° C.
6. Prepare 250 μL de 1 M 2-deoxy-D-glicose (2-DG) no mínimo DMEM (médio modificado águia de Dulbecco). Aquecer a 37 ° C e ajustar o pH para 7,4 (realizar a medição do pH a 37 ° C). Filtro de esterilizar (0,22 μm) e armazenar a-20 ° C.
7. Prepare-se 100 μL de 1 mM FCCP (carbonila cianeto-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) em DMSO. Filtro de esterilizar (0,22 μm) e armazenar a-20 ° C.
8. Prepare-se 100 μL de 1 mM a rotenona em etanol. Filtro de esterilizar (0,22 μm) e armazenar a-20 ° C.
9. Prepare-se 100 μL de 1 mg/mL Antimycin A em etanol. Filtro de esterilizar (0,22 μm) e armazenar a-20 ° C.
10. Antes do uso, prepare-se 10 mL de meio de teste de estresse de glicólise. Quente DMEM mínimo a 37 ° C em banho-maria e ajustar o pH para 7,4 (realizar a medição do pH a 37 ° C).
11. Antes da utilização, prepare-se 10 mL de meio de teste de estresse celular Mito com BSA. Suplemento DMEM mínima com 2 mM L-glutamina, 10 mM D-glicose, 1 mM HEPES (pH 7,4), piruvato de 1 mM e 0,1% de BSA (albumina de soro bovino). Aquecer a 37 ° C em banho-maria e ajustar o pH para 7,4 (realizar a medição do pH a 37 ° C).
12. Antes da utilização, prepare-se 10 mL de meio de teste de estresse celular Mito sem BSA. Completar o mínimo DMEM com 2 mM L-glutamina, 10 mM D-glicose, 1 mM HEPES (pH 7,4) e piruvato de 1 mM. Aquecer o meio de teste de estresse celular Mito sem BSA a 37 ° C em banho-maria e ajustar o pH para 7,4 (realizar a medição do pH a 37 ° C).
    Nota: BSA é adicionado ao meio de teste de estresse de célula Mito porque as células respondem melhor à Compararia quando o meio é suplementado com BSA (diferentes condições foram testadas). Meio de teste de estresse celular Mito sem BSA é usado para carregar os portos, como o fabricante não recomenda o uso de BSA a médio.

2. isolamento de células mononucleares da medula óssea

Nota: Idealmente, a medição do estado metabólico das células de leucemia primária deve começar imediatamente após o isolamento de coleção e célula da medula óssea. No entanto, dados relevantes, poderiam ser também obtidos células isoladas após o transporte de outra hematologia centra-se na República Checa. Execute todas as etapas sub em uma capa de cultura de tecido estéril.

1. PBS e o meio de gradiente de densidade à temperatura de aquecimento.
2. Dilua a amostra de medula óssea do paciente de leucemia com PBS, na proporção de 1:1. Certifique-se que a amostra contém pelo menos 80% de blastos leucêmicas.
3. Determine a porcentagem de blastos por citometria de fluxo, usando marcadores de CD específicos para caracterização de imunofenótipo de tipos de células. Após a separação de gradiente de densidade, detecta o ácido nucleico eventos positivos com um corante nuclear a fim de estabelecer a contagem total de células.
4. Em seguida, determinar usando marcadores CD específicos para cada tipo de leucemia de células de leucemia: B-ALL (CD19, CD45), T-ALL (CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, CD99) e AML (CD45, CD33 e marcadores específicos mieloides)²⁴. Divida o número de células de leucemia positivos para marcadores específicos do CD por todas as células nucleares para determinar a porcentagem de blastos de leucemia.
   Nota: A medula óssea tem que ser recolhidos para os tubos com anticoagulantes.
5. Com cuidado a camada 6 mL da amostra diluída da medula óssea acima de 6 mL do meio de gradiente de densidade em um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar a 400 x g, durante 35 min a 4 ° C, em um rotor balançando-balde sem o freio.
   Nota: O maior volume da amostra pode ser dividido em alíquotas mais ou tubo cónico de 50 mL pode ser usado com a maior quantidade de meio de gradiente de densidade.
6. Com uma pipeta Pasteur, transferi com cuidado a camada de interfase, que consiste de células mononucleares (Figura 1) para um novo tubo cónico de 50 mL com 5 mL de PBS. Centrifugar a 400 × g por 10 min a 4 ° C, em um rotor balançando-balde.
   Nota: Transferi todas as camadas de células mononucleares em um tubo cônico único 50 mL com 5 mL de PBS.
7. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 2 mL de PBS estéril. Conte as células usando um hemocytometer.
   Nota: O número de células de leucemia em 1 mL de aspirado de medula óssea difere significativamente entre os pacientes de²⁵.

3. durante a noite cultivo de células mononucleares

Nota: Execute todas as etapas sub em uma capa de cultura de tecido estéril.

1. Prepare duas T75 frascos com 20 mL de RPMI. A cada balão, adicione 30 x 10⁶ isolado de células mononucleares. Incubar as células com o balão de pé para 16 – 24 h a 5% de CO₂ e 37 ° C.

4. preparação das placas de revestimento adesivo de célula

1. Casaco de duas placas de analisador de fluxo 8 poços extracelular.
   Nota: Execute o revestimento em uma capa de cultura de tecido estéril.
2. Adicionar 2.2 μL de adesivo de célula (densidade: 2,54 mg/ml) para 250 μL de 0,1 M NaHCO₃, pH 8.1 e pipeta imediatamente 12,5 μL da solução em cada poço.
   Nota: Soluções estoque adesivo celular pode diferem em sua densidade, ajustar o volume adicionado ao NaHCO₃ conformemente.
3. Deixe as placas sentar no capô para cerca de 20 min, em seguida, Aspire o adesivo de célula e lavar cada um bem duas vezes usando 200 μL de água estéril. Deixe descansar no bairro com a tampa aberta até poços estão secos.
4. Use as placas imediatamente ou salvar até 1 semana a 4 ° C com o aro envolvido na película de parafina para evitar a condensação. Certifique-se de que as placas estão aquecidas à temperatura ambiente (por cerca de 20 min) no bairro antes da semeadura das células.

5. hidratação do cartucho de Sensor

Nota: Hidrate duas recargas de analisador de fluxo 8 poços extracelular.

1. Separe a placa do utilitário e o cartucho do sensor. Coloque o cartucho de sensor de cabeça para baixo sobre a bancada de laboratório.
2. Encha cada um bem da placa utilitário com 200 µ l de calibrant. Encha cada fosso ao redor do exterior dos poços com 400 μL de calibrant.
3. Retorne o cartucho do sensor na placa de utilitário que agora contém o calibrant.
4. Coloque o conjunto de cartucho em uma umidificado, não-CO₂, incubadora 37 ° C durante a noite.
5. Ligar o analisador de fluxo extracelular e deixá-lo aquecido a 37 ° C durante a noite.

6. semeadura de células na célula placas com revestimento adesivo

Nota: Para teste de stress de glicólise, use meio de teste de estresse de glicólise. Para o teste de stress do Mito de célula, use meio de teste de estresse celular Mito com BSA.

1. Células de sementes para o teste de estresse de glicólise e o teste de estresse celular Mito em placas separadas. Para cada teste, use células de um balão com cultura durante a noite.
2. Centrifugar as células a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Ressuspender as células em 1 mL de meio adequado e contá-los.
3. Adicione 4 x 10⁶ de células vivas para o volume final de 400 μL (meio adequado de uso).
4. Placa 50 μL da suspensão celular em poços B-G. Certifique-se de 500.000 células são semeadas em um poço.
   Nota: É fundamental propagar exatamente 500.000 células por bem como nenhuma outra normalização é executada. Dessa forma, os resultados de diferentes pacientes podem ser comparados. O número ideal de repetições é seis, como é descrito aqui. Não é recomendado usar menos repetições desde as células primárias às vezes se comportam erroneamente.
5. Adicione 180 µ l de meio adequado para poços A e H (esses poços servirá como uma correção de fundo).
6. Centrifugue a placa a 400 x g durante 5 min à temperatura ambiente com freio definido como 1.
7. Adicione 130 μL de meio adequado para poços B-G em duas placas de analisador de fluxo 8 poços extracelular lentamente e com cuidado. Visualmente, confirmam que as células são estàvel adere ao fundo dos poços por visualização ao microscópio.
8. Coloque o prato em um umidificado, não-CO₂, incubadora 37 ° C por 30 min.

7. carregamento do cartucho de Sensor

1. Para o teste de estresse de glicólise, prepare 250 μL de glicose de 100 mM, 20 μM oligomicina e 1 M 2-DG, tudo no meio de teste de estresse de glicólise.
2. Para o teste de estresse celular Mito, preparar 250 μL de cada um da oligomicina de 20 μM, 15 μM Compararia, 30 μM Compararia e uma mistura de 10 μM rotenona e 10 μg/ml A Antimycin, tudo em meio de teste de estresse celular Mito sem BSA.
   Nota: Injetar duas concentrações de Compararia um ensaio é recomendado uma vez que não há material suficiente dos pacientes para a titulação Compararia. No entanto, as concentrações devem ser determinadas pelo pesquisador.
3. Carrega os compostos para as portas apropriadas do injector do cartucho como segue (tabela 1):

8. Configurando o programa

1. Para o teste de estresse de glicólise, configurar o programa conforme descrito na tabela 2.
2. Para o teste de estresse celular Mito, configurar o programa conforme descrito na tabela 3.
3. Inicie o programa. Substitua a placa de calibrant com a placa de ensaio (quando solicitado).

9. avaliação e interpretação dos resultados

1. Nos resultados do teste de estresse de glicólise, subtrai o menor valor ECAR após injeção 2-DG, de todos os outros valores ECAR.
   Nota: Este valor mais baixo representa a acidificação não-glicolíticas. Normalmente, o valor mais baixo é de medição 4^th .
2. Calcule a acidificação Basal, glicólise, glicólise máxima e glicolítico reserva parâmetros de função glicolítico (Figura 2A). Depois de subtrair o menor valor ECAR, calcular acidificação Basal como um meio de ECAR desde os primeiros pontos de três medição (omitir o primeiro valor ECAR se difere significativamente dos outros dois), calcular a glicólise como um meio de ECAR da medição de três pontos após a injeção de glicose e calcular máxima glicólise como média de ECAR de medição três pontos após oligomicina uma injeção. Calcular Glycolytic reserva como glicólise máxima menos a glicólise.
   Nota: Como alternativa, glicólise máxima utilize para cálculo, o valor mais alto de ECAR de três pontos medidos.
3. Nos resultados do teste de estresse de célula Mito, subtrai o valor mais baixo de OCR após injeção de rotenona/Antimycin A partir de todos os outros valores de OCR.
4. Calcule a respiração Basal, produção de ATP, respiração máxima e parâmetros de capacidade não utilizada da função mitocondrial (Figura 2B). Depois de subtrair o menor valor de OCR, calcule respiração Basal como um meio de OCR dos pontos de três medição primeiros.
   Nota: Respiração máxima é o valor mais alto de OCR após injeção Compararia.
5. Para cálculo de produção de ATP, subtrai a média dos três pontos de medição OCR após Oligomycin A injeção da respiração Basal. Calcule a capacidade não utilizada como a respiração máxima menos a respiração Basal.
   Nota: Sempre Calcule a respiração máxima do valor máximo do OCR, independentemente da concentração Compararia usado.

A Figura 3 mostra as curvas depois de teste de estresse de glicólise e medições de teste de estresse Mito de células leucêmicas blastos do BCP-ALL (B-precursor aguda linfoblástica leucemia) e pacientes LMA (leucemia mieloide aguda). O cálculo dos parâmetros metabólicos destas medidas também é indicado. 500.000 células por poço foram semeadas e todas as medições foram feitas em hexaplicates.

No teste de estresse da glicólise, o meio basal só é usado, para que as células são privadas de nutrientes. O primeiro parâmetro obtido é a acidificação Basal, que deve refletir a quantidade de glicose armazenada nas células. Após a primeira injeção, ECAR é aumentou desde que as células utilizam a glicose e podem fermentar para lactato. A oligomicina na segunda injeção inibe a ATP sintase e direciona, portanto, as células que produzem ATP principalmente via glicólise. Isso deve causar ainda mais elevação de ECAR. Injeção de 2-DG completamente inibe a glicólise e ECAR gotas.

No teste de estresse de Mito de célula, um suplementado com glutamina e glicose são utilizados, para que as células não são privadas de todos os nutrientes e o parâmetro de respiração Basal reflete seu estado metabólico basal. Após a primeira injeção com Oligomycin A, células inibem a respiração mitocondrial em alternar para a glicólise que é representado como um decréscimo de OCR. FCCP (a segunda e a terceira injeção), por outro lado, desacopla a produção de ATP da respiração, para que as células estão a consumir oxigênio a uma taxa máxima e a ascensão de OCR para o valor mais alto. A última injecção de rotenona e Antimycin A mistura completamente inibe a respiração mitocondrial e OCR é reduzida perto de zero.

Figura 1: centrifugação gradiente de densidade da amostra da medula óssea. Células mononucleares enriquecidas para células leucêmicas são separadas por meio de gradiente de densidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: contorno da glicólise stress test e teste de estresse celular Mito (A) exemplar resultado de teste de estresse de glicólise. (B) exemplar resultado de teste de estresse do Mito de célula. Parâmetros são indicados dentro das curvas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: análise de fluxo extracelular de explosões leucêmicas do BCP (A, B) e o paciente AML (B, C). (A e C) resultados de teste de estresse de glicólise. Por favor, note que o primeiro ponto de medição pode ser significativamente diferente do resto e deve ser excluído da análise nesse caso. (B e D) resultados de teste de estresse celular Mito. Parâmetros são indicados dentro das curvas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Volumes compostos.

Tabela 2: Programa para teste de stress de glicólise.

Tabela 3: Programa para teste de stress do Mito de célula.

O protocolo acima descrita permite a medição da atividade metabólica avaliada por valores de OCR e ECAR no primários leucêmicas explosões derivadas de pacientes com leucemia linfoblástica aguda (LLA) ou leucemia mieloide aguda (LMA). A vantagem de medição utilizando um analisador de fluxo extracelular é que permite a detecção de perfil metabólico no tempo real nas células vivas. Essencialmente, cada passo no protocolo fornecido pode ser ajustado dependendo do tipo de célula, um planeja estudar. Aqui, vamos discutir os parâmetros mais importantes que poderiam afetar os resultados e poderiam fornecer menos de valores ótimos.

O primeiro passo para otimização foi uma comparação dos dados obtidos do vs materiais frescos, congelado material. A capacidade de medir a atividade metabólica do material congelado permitiria estudos retrospectivos das amostras dos pacientes, armazenados no banco de nitrogênio líquido. No caso de todas as amostras, fomos capazes de detectar atividade metabólica consistente somente a partir do material fresco, Considerando que as células de LMA foram medidas também depois de congelamento com óptimos resultados.

O segundo passo para otimização é o cultivo de explosões leucêmicas primários. Nós testamos a atividade metabólica das células direto após a separação de gradiente de densidade (sem cultivo) ou cultivo durante a noite. Mesmo que as células após a separação de gradiente de densidade pareciam viável e vital sob um microscópio, sua atividade metabólica foi prejudicada. Em geral ECAR e OCR valores eram inferiores, e também, após a injeção, valores de OCR ou ECAR não respondeu otimamente como fizeram em células cultivadas.

Cultivo em diferentes condições também pode influenciar os resultados. Usar o suplemento de Selenito de sódio do insulin transferrina (ITS) é considerado uma boa prática quando cultivo primário de explosões de⁸, mas este suplemento interfere com a atividade metabólica das células. Durante o teste de estresse celular Mito, leucêmicas explosões cultivadas com ITS não respondeu a Oligomycin A (OCR deve diminuir para calcular vinculados ao ATP respiração). Nós também tentamos co cultivar as células com as células-tronco mesenquimais (MSC), mas neste caso, valores de OCR e ECAR foram mais baixos comparados com as células cultivadas sem MSCs. Em resumo, cultivando primários blastos de pacientes de leucemia em RPMI médio com 10% FBS é a melhor opção.

Pacientes adequados para a caracterização do seu perfil metabólico devem cumprir determinados critérios que, no limite de uma mão o número de amostras analisadas, mas por outro lado, irão produzir resultados relevantes. Nós medimos a função metabólica de pacientes com alta celularidade (para uma medição temos semeado 500.000 células / por poços em hexaplicate) e apenas amostras com 80 e uma percentagem mais elevada de leucêmicas explosões puderam ser medidas para evitar a detecção de inespecíficos atividade metabólica de outros tipos de células presentes na suspensão.

Um dos passos cruciais na análise dos dados é a normalização, para que os parâmetros metabólicos entre diferentes amostras leucêmicas poderiam ser comparados. De acordo com nossos experimentos anteriores realizados com linhas de células leucêmicas, encontramos que a normalização para o número das células dá os melhores resultados. O número específico de células por poço precisa ser determinado pelo pesquisador e depende do tamanho e atividade metabólica das células testadas.

Os autores não têm nada para divulgar.

Gostaríamos de agradecer a centros de Hematologia pediátrica Checa. Este trabalho foi apoiado por Grant do Ministério da saúde (NV15-28848A), pelo Ministério da saúde da República Checa, University Hospital Motol, Praga, República Checa 00064203 e pelo Ministério da educação, da juventude e desportos NPU eu nr. LO1604.