Method Article
כאן אנו מציגים פרוטוקול בידודו של תאים לוקמיה במח העצם חולי לוקמיה וניתוח של מדינתם מטבולית. הערכה של פרופיל מטבולי של תאי סרטן ראשוני יכול לעזור כדי לאפיין טוב יותר את הביקוש של ראשי תאים, עלול להוביל רפואה אישית יותר.
הדרישה המטבולית של תאים סרטניים יכולים להשפיע באופן שלילי על הישרדות, יעילות הטיפול. כיום, פילוח התרופות של מסלולים מטבוליים נבחנה סוגים רבים של גידולים. לפיכך, אפיון של סרטן תאים ההתקנה מטבולית בלתי נמנע כדי למקד את השביל הנכון כדי לשפר את התוצאה הכוללת של חולים. למרבה הצער, ברוב סוגי סרטן, שהתאים הממאירים הם די קשה להשיג במספרים גבוהים יותר, נדרשת ביופסיה רקמות. לוקמיה היא יוצאת דופן, שבו מספר מספיק של תאים לוקמיה ניתן לבודד ממח העצם. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט בידודו של תאים לוקמיה במח העצם חולי לוקמיה וניתוח הבאים של מצב מטבולי שלהם באמצעות מנתח השטף חוץ-תאית. תאים לוקמיה מבודדות על-ידי מעבר הצבע צפיפות, אשר אינה משפיעה על יכולת הקיום שלהם. השלב הבא בטיפוח מסייעת להם להתחדש, ובכך המדינה מטבולית נמדד מצבו של תאים בתנאים אופטימליים. פרוטוקול זה מאפשר בהשגת תוצאות עקביות, מתוקננת היטב, אשר יכול לשמש עבור הטיפול אישית.
פרופיל מטבולי הוא אחד המאפיינים העיקריים של תאים, ביואנרגיה שינו עכשיו נחשבים לאחד גולת הכותרת של סרטן1,2,3. יתר על כן, שינויים בהגדרת מטבולית יכול לשמש לטיפול בסרטן על ידי מיקוד האות התמרה חושית מסלולים או מכונות אנזימטי של סרטן תאים4,5,6. בידיעה חילוף לנטייה של תאים סרטניים ולכן יש יתרון והוא יכול לעזור לשפר את הטיפול הנוכחי.
ישנן הרבה שיטות שכבר פועלת אשר יכול להעריך את הפעילות המטבולית של תאים בתרבות. לגבי גליקוליזה, ספיגת הגלוקוז נמדד על ידי תיוג רדיואקטיבי, באמצעות 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) או רמת חומצת החלב חוץ-תאית נמדד enzymatically7,8. קצב חמצון חומצות שומן הינו פרמטר נוסף מטבולית נמדדת פלמיתד שכותרתו isotopically9,10. קצב צריכת החמצן היא שיטה נפוץ לקביעת פעילות מיטוכונדריאלי בתאים11,12, יחד עם ממברנה מיטוכונדריאלי פוטנציאליים הערכה13,14, ATP/ADP (אדנוזין יונקות-טריפוספט/אדנוזין יונקות-diphosphate) יחס מידה15 או סך תאיים ATP מידה16. איתות המסלולים הידועים כדי לווסת את תהליכי חילוף החומרים יכול להיקבע על ידי חלבון quantifications, יכול לשפר את ההבנה של מדידות מטבולית17,18,19.
אולם, כל השיטות האלה למדוד רק אחת או, בתרחיש הטוב ביותר, מספר פרמטרים מטבולית אחד לטעום בו זמנית. חשוב, בו זמנית מדידה של קצב צריכת החמצן (OCR) וקצב חוץ-תאית acidification (ECAR) יכולה להיות מושגת על ידי הניתוח השטף חוץ-תאית על ידי, לדוגמה, סוסון ים XFp מנתח. OCR הוא מחוון של הנשימה מיטוכונדריאלי, ECAR היא בעיקר התוצאה של גליקוליזה (אי אפשר להתעלם CO2 הפקה ואולי היא מרוממת ECAR של תאים עם פעילות גבוהה זרחון חמצוני)20. עד כה, סוגי תאים שונים נחקרו באמצעות אלה מנתחי21,22,23.
כאן נתאר הפרוטוקול עבור ניתוח חוץ-תאית השטף של תקיעות הראשי (תאים לוקמיה נגזר מן השלב hematopoietic ילדותי) של חולי לוקמיה. לפי מיטב ידיעתנו, פרוטוקול ספציפי עבור תקיעות הראשי אינו זמין עדיין.
כל הדגימות התקבלו עם informed consent של הילדים ההורים או האפוטרופסים ואישור הוועדה האתית של אוניברסיטת קארל ב פראג, צ'כיה, המחקר אין. NV15-28848A.
1. הכנת נוגדנים
2. בידוד של תאים תאי מח עצם
הערה: באופן אידיאלי, מדידה של מצב מטבולי של תאי סרטן ראשוני צריך להתחיל מיד לאחר בידוד אוסף של תאים במח העצם. יחד עם זאת, הנתונים הרלוונטיים יכול להשיג גם תאים מבודדים לאחר תחבורה אחרים המטולוגיה מרכזי ברפובליקה הצ'כית. ביצוע כל שלבי משנה ברדס תרביות רקמה סטרילי.
3. טיפוח לילה תאי תאי
הערה: ביצוע כל שלבי משנה ברדס תרביות רקמה סטרילי.
4. הכנת צלחות מצופה דבק תא
5. הידרציה של חיישן מחסנית
הערה: מימה שתי מחסניות מנתח השטף 8-ובכן חוץ-תאית.
6. זריעת תאי צלחות מצופה דבק תא
הערה: עבור בדיקת המאמץ גליקוליזה, השתמש גליקוליזה בדיקת המאמץ בינונית. לבדיקה מתח התא Mito, השתמש תא Mito בדיקת המאמץ בינונית עם BSA.
7. טעינת הדיו חיישן
8. הגדרת התוכנית
9. הערכה ופרשנות של תוצאות
איור 3 מראה את העקומות לאחר בדיקת המאמץ גליקוליזה ומדידות בדיקת המאמץ תא Mito ותקיעה לוקמיה BCP-כל (B-cell קודמן לוקמיה לימפובלסטית חריפה), חולים AML (לוקמיה מיאלואידית חריפה). חישוב פרמטרים מטבולית של מדידות אלה גם מצוינת. תאים 500,000 לכל טוב היו נזרע, כל המדידות נעשו בו hexaplicates.
במבחן הלחץ גליקוליזה, משמש המדיום רק הבסיס, כך התאים הם משוללי של חומרים מזינים. הפרמטר הראשון שהתקבל הוא acidification הבסיס, אשר אמור לשקף את כמות הגלוקוז המאוחסנים בתאים. לאחר הזריקה הראשונה, ECAR הוא גדל מאז תאים לנצל את הגלוקוז, שעלולים להחמיץ את זה בלי חולצה. Oligomycin A הזריקה השנייה מעכב ATP-סינתאז, ובכך ומכוונת את התאים לייצר ATP בעיקר דרך גליקוליזה. זה אמור לגרום בהמשך העלאת רמת ECAR. הזרקה של 2-DG מעכב לחלוטין גליקוליזה וטיפות ECAR.
במבחן מתח התא Mito, משמשים מדיום בתוספת גלוטמין, גלוקוז, כך התאים הם לא משוללי כל החומרים המזינים הפרמטר נשימה הבסיס משקף מצב מטבולי הבסיס שלהם. לאחר הזריקה הראשונה עם Oligomycin, התאים לעכב נשימה מיטוכונדריאלי, לעבור גליקוליזה אשר מיוצג כ ירידה של OCR. FCCP (הזריקה השנייה והשלישית), לעומת זאת, uncouples ATP הפקה של נשימה, כך התאים עכשיו צורכים חמצן קצב מקסימלי, OCR עלייה לערך הגבוה ביותר שלו. הזריקה האחרונה של תערובת Rotenone, Antimycin A מעכב לחלוטין מיטוכונדריאלי נשימה וירידה OCR הוא קרוב לאפס.
איור 1: צפיפות צנטריפוגה הדרגתי של המדגם מח עצם. תאי תאי מועשר עבור תאים לוקמיה מופרדים באמצעות צפיפות בינונית הדרגתיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: חלוקה של בדיקת המאמץ גליקוליזה, כשהילדים מתח Mito תא (א) למופת תוצאת בדיקת המאמץ גליקוליזה. (B) למופת תוצאת בדיקת המאמץ תא Mito. פרמטרים מסומנים בתוך העקומות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ניתוח חוץ-תאית השטף של תקיעות לוקמיה של BCP-כל (A, B), החולה AML (B, C). (A ו- C) תוצאות בדיקת המאמץ גליקוליזה. אנא שימו לב כי נקודת המדידה הראשונה יכול להיות שונה באופן משמעותי משאר, לא להיות כלולים מניתוח במקרה הזה. (B ו- D) תוצאות בדיקת המאמץ תא Mito. פרמטרים מסומנים בתוך העקומות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
יציאה | בדיקת המאמץ גליקוליזה | בדיקת המאמץ mito תא | ||
לטעון ליציאה | הריכוז הסופי של הבארות | לטעון ליציאה | הריכוז הסופי של הבארות | |
A | 20 μL של גלוקוז 100 מ מ | גלוקוז 10 מ מ | 20 μL של μM 20 Oligomycin A | Oligomycin 2 μM A |
B | ΜL 22 של μM 20 Oligomycin A | Oligomycin 2 μM A | 22 μL של 15 μM FCCP | 1.5 ΜM FCCP |
C | 25 μL של 1 מ' 2-די. ג'י | 100 מ מ 2-DG | 25 μL של 30 μM FCCP | 4.5 ΜM FCCP |
D | X | 25 μL של 10 μM Rotenone, μg/ml 10 Antimycin A | 1 μM Rotenone, μg/ml 1 Antimycin A |
טבלה 1: במתחם כרכים.
שלב | הגדרות |
כיול | אוטומטי |
Equilibration | אוטומטי |
מידה בסיסית | שלוש פעמים: לערבב – 3 דקות, רגע – 0 דקות, מדידה – 3 דקות |
הזרקה של ה-port A | הזרקה |
מדידה | שלוש פעמים: לערבב – 3 דקות, רגע – 0 דקות, מדידה – 3 דקות |
הזרקה של הנמל B | הזרקה |
מדידה | שלוש פעמים: לערבב – 3 דקות, רגע – 0 דקות, מדידה – 3 דקות |
הזרקה של הנמל C | הזרקה |
מדידה | ארבע פעמים: לערבב – 3 דקות, רגע – 0 דקות, מדידה – 3 דקות |
טבלה 2: תוכנית עבור בדיקת המאמץ גליקוליזה.
שלב | הגדרות |
כיול | אוטומטי |
Equilibration | אוטומטי |
מידה בסיסית | שלוש פעמים: לערבב – 3 דקות, רגע – 0 דקות, מדידה – 3 דקות |
הזרקה של ה-port A | הזרקה |
מדידה | שלוש פעמים: לערבב – 3 דקות, רגע – 0 דקות, מדידה – 3 דקות |
הזרקה של הנמל B | הזרקה |
מדידה | שלוש פעמים: לערבב – 3 דקות, רגע – 0 דקות, מדידה – 3 דקות |
הזרקה של הנמל C | הזרקה |
מדידה | שלוש פעמים: לערבב – 3 דקות, רגע – 0 דקות, מדידה – 3 דקות |
הזרקה של הנמל D | הזרקה |
מדידה | שלוש פעמים: לערבב – 3 דקות, רגע – 0 דקות, מדידה – 3 דקות |
טבלה 3: תוכנית לבדיקת מתח התא Mito.
הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר מדידת פעילות חילוף החומרים מוערך על ידי ערכים OCR, ECAR העיקרית בפיצוצים לוקמיה נגזר חולים עם לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL) או לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). היתרון של מדידה באמצעות מנתח השטף חוץ-תאית הוא שהם מאפשרים זיהוי פרופיל מטבולי בזמן אמת בתאים חיים. בעיקרו של דבר, כל צעד בפרוטוקול שסופקו יכולה להיות מכוונת בהתאם לסוג התא אחד מתכננת ללמוד. כאן נדון את הפרמטרים החשובים ביותר אשר יכול להשפיע על התוצאות, יכול לספק פחות ערכים אופטימלית.
הצעד הראשון לקראת אופטימיזציה הייתה השוואה של נתונים המתקבלים לעומת חומרים טריים קפואים חומר. היכולת למדוד את הפעילות המטבולית מתוך החומר קפוא תאפשר ללימודי רטרוספקטיבה של הדגימות של המטופלים המאוחסנים בבנק חנקן נוזלי. במקרה של כל הדגימות, היינו מסוגלים לזהות פעילות חילוף החומרים עקבי רק מתוך החומר טריים ואילו תאים AML נמדדו גם לאחר בטל הקפאת עם תוצאות אופטימליות.
השלב השני לכיוון אופטימיזציה הוא הטיפוח של תקיעות לוקמיה העיקרי. בדקנו את הפעילות המטבולית של התאים ישר לאחר ההפרדה הדרגתיות צפיפות (ללא culturing) או אחרי culturing בן לילה. גם אם התאים לאחר ההפרדה הדרגתיות צפיפות נראית מעשית וחיוני תחת מיקרוסקופ, פעילות חילוף החומרים שלהם היה לקוי. בסך הכל ECAR וערכי OCR היו נמוכות, כמו כן, לאחר ההזרקה, ערכים OCR או ECAR לא הגיב בצורה אופטימלית כפי שעשו בתאים מעובדים.
טיפוח בתנאים שונים יכול גם להשפיע על התוצאות. באמצעות אינסולין transferrin סודיום סלניט תוספת (ITS) נחשב אימון טוב, כאשר טיפוח ראשי תקיעות8, אבל תוספת זו משבשת הפעילות המטבולית של התאים. במהלך בדיקת המאמץ תא Mito, תקיעות לוקמיה מעובדות עם ITS לא הגיב ל Oligomycin (OCR אמורה להפחית כדי לחשב נשימה מקושרים-ATP). ניסינו גם לטפח שיתוף התאים עם גזע mesenchymal (MSC), אך במקרה זה, ערכי OCR ו- ECAR יש כבר נמוכה לעומת התאים מעובדים ללא MSCs. לסיכום, טיפוח תקיעות העיקרי של חולי לוקמיה ב RPMI בינוני עם 10% FBS היא האפשרות הטובה ביותר.
חולים מתאים אפיון פרופיל מטבולי שלהם עליך לעמוד בקריטריונים מסוימים אשר על יד אחת הגבל את מספר הדגימות שנבדקו, אבל מצד שני, תניב תוצאות רלוונטיות. אנחנו נמדדים בפונקציה מטבולית של חולים עם cellularity גבוהה (עבור מדידה אחת אנחנו נזרע תאים 500,000 / per בארות hexaplicate), דוגמאות בלבד ועם 80 אחוז גבוה יותר של תקיעות לוקמיה ניתן למדוד כדי למנוע זיהוי של לא ספציפי פעילות מטבולית של סוגי תאים אחרים נוכח ההשעיה.
אחד הצעדים מכריע בניתוח נתונים הוא נירמול, כך שניתן להשוות פרמטרים מטבולית בין מדגמים שונים לוקמיה. על פי ניסויים קודמים שלנו הופיעה עם שורות תאים לוקמיה, מצאנו כי נורמליזציה על מספר התאים נותן את התוצאות הטובות ביותר. המספר הספציפי של תאים לכל טוב צריך להיקבע על ידי החוקר ותלוי על הגודל ועל פעילות חילוף החומרים של התאים שנבדקו.
המחברים אין לחשוף.
ברצוננו להודות המרכזים המטולוגיה לילדים הצ'כית. עבודה זו היה נתמך על ידי מענק של משרד הבריאות (NV15-28848A), על ידי משרד הבריאות של הרפובליקה הצ'כית, אוניברסיטת בית החולים במוטול, פראג, הרפובליקה הצ'כית 00064203 ועל ידי משרד החינוך, נוער, ספורט NPU אני נ. LO1604.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco, ThermoFisher Scientific | 61870-010 | |
Fetal Bovine Serum | Biosera | FB-1001/100 | |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15240-062 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
Oligomycin A | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375-1G | |
FCCP | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | |
Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | |
Seahorse XF Base Medium, 100 mL | Agilent Technologies | 103193-100 | |
L-glutamine solution, 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | |
HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-25G | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
Ficoll-Paque Plus | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Density gradient medium |
Seahorse XFp FluxPak | Agilent Technologies | 103022-100 | |
Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | CB40240 | |
Seahorse Analyzer XFp | Agilent Technologies | S7802A | |
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved