Macropatch focal gravações das correntes sinápticas da junção Neuromuscular Larval da drosófila

Correntes sinápticas podem ser gravadas focally de boutons sinápticas visualizados na drosófila terceiro ínstar larvas junção neuromuscular. Esta técnica permite monitorar a atividade de um único bouton sináptica.

Drosófila junção neuromuscular (JNM) é um sistema excelente modelo para estudar a transmissão sináptica glutamatérgico. Descrevemos a técnica de macropatch focal gravações das correntes sinápticas de boutons visualizados no MNJ larvas de Drosophila . Esta técnica requer a fabricação personalizada de micropipetas, bem como um microscópio composto, equipado com uma alta ampliação, objectivo de imersão de água de longa distância, óptica de interferência diferencial (DIC) de contraste e uma fluorescente de gravação acessório. O eletrodo de gravação está posicionado no topo de um selecionado bouton sináptica visualizado com óptica DIC, epi-fluorescência ou ambos. A vantagem desta técnica é que permite monitorar a atividade sináptica de um número limitado de sítios de lançamento. O eletrodo de gravação tem um diâmetro de vários micra, e os locais de lançamento posicionados fora da borda do eletrodo não afetam significativamente as correntes gravadas. As correntes sinápticas gravadas tem cinética rápida e podem ser facilmente resolvidas. Estas vantagens são especialmente importantes para os estudos de linhas de mosca mutantes com maior atividade sináptica espontânea ou assíncrona.

Drosófila é um sistema excelente modelo para estudar os mecanismos moleculares de controle da transmissão sináptica. O sistema neuromuscular em Drosophila é glutamatérgico, e portanto a drosófila de junção neuromuscular (JNM) pode ser usada para estudar as características conservadas de lançamento glutamatérgico. Desde Jan e de Jan estudo¹, as terceiro ínstar larvas tem sido amplamente costumava estudar evocado e espontânea transmissão sináptica monitorando potenciais de junção excitatória (EJPs) ou correntes (EJCs). EJPs são comumente registrados intracelular com um microeléctrodo de vidro afiado, e refletem a atividade do MNJ inteira, incluindo todos os boutons fazendo sinapses para a fibra muscular determinada.

Em contraste, a atividade de um número limitado dos sítios de lançamento pode ser gravada focally posicionando uma dica micropipeta perto de terminais neuronais ou varicosidades sinápticas. Esta técnica foi originalmente empregada por Katz e Miledi², e gravações extracelulares focais têm sido empregadas com sucesso em várias preparações de JNM, incluindo sapo^3,4,5, rato^{6 , 7 , 8}, crustáceo,^{9,10,11,12,13,14,15,16}e Drosófila^{17,18,19,20,21,22,23}. Esta abordagem foi desenvolvida por Dudel, quem otimizado macropatch recodificação eletrodos^24,25. Na implementação do Dudel, esta técnica estreitamente alinhados a solta-remendo-braçadeira método²⁶.

O MNJ larvas de Drosophila definiu claramente boutons sinápticas e linhas transgénicas com geneticamente codificadas etiquetas fluorescentes neuronais (ver Tabela de materiais) estão prontamente disponíveis. Estas vantagens nos permitiram gravar EJCs e mEJCs de um selecionado bouton sináptica^20,21,22. Aqui, descrevemos esta técnica em detalhe.

1. fabricação de eletrodos de gravação

1. puxando os eletrodos de vidro
   1. uso o seguinte protocolo para o extrator de microeletrodos (ver Tabela de materiais):
      1. linha 1: calor 510 puxar - velocidade 30 hora 250; Linha 2: Aqueça 490 Pull - velocidade 30 hora 250.
         Nota: As unidades de tempo correspondem a 0,5 ms por unidade; as outras unidades são relativas. O valor do calor deve ser ajustado para cada filamento após o teste de rampa é executado.
   2. Usar um microscópio (ampliação de x 35) para garantir que o diâmetro interno do eletrodo puxado é na faixa de 7 a 10 µm ( figura 1A). Armazenar os capilares em recipientes hermeticamente fechados para evitar a acumulação de poeira.
2. Fogo polimento
   1. capilares de polonês de fogo (80-90% do valor máximo de calor para 1-2 s) usando uma microforja (ver Tabela de materiais). Certifique-se o diâmetro interno final do eletrodo polido é de 5 µm ( figura 1A) ²⁷.
3. Dobra
   Nota: duas curvas são feitas a fim de posicionar os eletrodos na parte superior do músculo sob um objectivo de alta ampliação.
   1. Uso o aparelho mostrado na figura 1B. Fixar o eletrodo no manipulador e posicione a ponta sobre o filamento, não tocando la
   2. Conjunto valor para 60-70% do máximo de calor e pressione o pedal da microforja para 1-2 s (consulte a Tabela de materiais) para aquecer o filamento. Use uma agulha em forma de L para puxar suavemente a ponta do eletrodo ( figura 1B alargada). Faça a curva em cerca de 90 ^o ( Figura 1).
   3. Segure o eletrodo sobre a chama da tocha à mão usando a pinça e fazer a segunda curva a uma distância de 7-10 mm da primeira curva e em um ângulo de aproximadamente 120 ^ó ( Figura 1).

Figura 1. Passos finais da fabricação de micropipeta. (A) eletrodo dicas depois puxando e polimento de fogo. (B. 1) a instalação para a ponta dobra. (B. 2), a área de Box é alargada mostrado à direita. O eletrodo e o filamento são fixos para que a ponta do eletrodo é posicionado ligeiramente acima do fio e não tocar. (C. 1) o eletrodo de gravação. (C. 2), a área de Box é alargada mostrado à direita. A primeira curva tem um ângulo de aproximadamente 90°, e a distância entre a primeira curva e a ponta do eletrodo é de cerca de 1 mm. escala barra = 3 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. etapas preparatórias adicionais

1. Prepare-se, como heamolymph (HL3) solução (em mM): NaCl 70, 5 KCl, 20 MgCl ₂, 10 NaHCO ₃, 5 a trealose, 115 sacarose, 5 HEPES e 1mm CaCl ₂; ajustar o pH para 7,3 - 7.4. manter a solução na geladeira e torná-lo fresco toda semana.
2. Fazer o mesmo caminho como gravação de vidro de pipetas de estimulação pipetas, exceto que não há nenhuma necessidade de dobrá-los.
   Nota: A preparação de eletrodos de estimulação é descrita detalhadamente em ²⁸ e ²⁷. O diâmetro final após polimento de fogo deve ser na faixa de 5-7 µm.
3. Inserir uma pipeta de estimulação em um suporte de microeletrodos conectada a uma seringa.
4. Placas de dissecação de fabrico de pequenos pratos de petri (35 x 10mm) revestidos com epóxi de borracha de silicone (consulte Tabela de materiais), conforme descrito em ²⁸.
   Nota: A borracha de Silicone deve ser completamente endurecida antes do uso.
5. Escolher um errante larvas de terceiro instar e dissecá-lo conforme descrito em ^{27 , 28 , 29 , 30}.
   Nota: Para visualizar boutons, use a estirpe voar CD8-GFP (ver Tabela de materiais)
   1. usando fórceps (ver Tabela de materiais), escolher as 3 ^rd ínstar larvas de um frasco.
   2. Pin as larvas, colocando o primeiro pino posterior e outro pino anterior (fechar a boca hooks).
   3. Solução Adicionar HL3.
   4. Fazer um corte usando Primavera tesoura (ver Tabela de materiais) todo o caminho do pino de topo para o fundo um do lado dorsal das larvas.
   5. Pino o filete de larvas, colocação de 2 pinos adicionais sobre os lados esquerdo e direito das larvas.
   6. Remover a coragem e a tracheas usando fórceps.
   7. Cortar os nervos fora o cabo ventral do nervo usando tesouras primavera.

3. Gravações elétricas de EJCs

Figura 2. A configuração de gravação. A amostra MNJ derrotou o silicone revestido de Petri (seta) é posicionado sobre o estágio móvel do vertical composto microscópio equipado com recursos de epifluorescência, um objectivo de alta ampliação e dois Micromanipuladores. O microscópio está estacionado em uma tabela de antivibração. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Gravação
   1. lugar de Petri com a preparação na fase de microscópio ( Figura 2). Inserir o eléctrodo de referência no banho.
   2. Preencher o eletrodo gravação com HL3 solução. No âmbito do objectivo de 10x (consulte Tabela de materiais), mergulhe o eletrodo para o banho e coloque-o sobre os músculos, 6 e 7 dos segmentos abdominais 2, 3 ou 4 usando o micromanipulador ((ver Tabela de materiais) Figura 3 A. 1 e a. 2).
   3. Mudar o objetivo para 60 x (veja a Tabela de materiais). Focar a área de interesse usando epi-fluorescência ou óptica DIC. Colocar a ponta do eletrodo em cima bouton synaptic ( Figura 3 b. 1-3).
   4. Pressione o eletrodo muito suavemente para o músculo. A pressão excessiva pode danificar o MNJ ou induzir um aumento na atividade sináptica espontânea. Verifique se a ponta do eletrodo não está entupido - se substituí-lo, é
   5. Ligar o amplificador, placa A/D e o computador.
   6. Escolher o modo de grampo de tensão do amplificador.
   7. Iniciar o software de aquisição e escolha o ' sem lacunas ' modo.
   8. Observe a aparência do mEJCs na tela do computador.
   9. Assegure-se que a amplitude do mEJCs é na faixa de 0,2 - 0,7 nd.
      Nota: EJCs menores indicam que o eléctrodo de gravação tem defeitos ou se ele não está posicionado corretamente.

Figura 3. Visualização de boutons sinápticas. (A), A imagem de brightfield de um hemi-segmento abaixo dos 10 x ampliação (a. 1) e a área ampliada Box mostrando os músculos 6 e 7 (a. 2, a seta marca o eléctrodo de gravação). Barra de escala = 50 µm. (B) sináptica boutons são visualizados em uma linha de drosófila com um marcador neuronal geneticamente codificado (CD8-GFP) usando imagens de epi-fluorescência (b. 1) ou óptica DIC (b. 2). Imagens são tiradas com o 60 x objetivo e o cubo do filtro para a imagem latente de GFP (ver Tabela de materiais). Synaptic boutons são marcados com as setas e uma sobreposição de imagens DIC e fluorescente é mostrada em b. 3. Barra de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. estimulação
   1. usando um micromanipulador, sob um controle visual, coloque o eletrodo de estimulação perto do axônio que inervam segmentos abdominais 2-4.
   2. Aplicar pressão negativa puxando o êmbolo da seringa conectada ao titular do eletrodo, para que o axônio é puxado para dentro do eletrodo ( Figura 2).
   3. Ativar o estimulador. Gire o botão na unidade de isolamento (consulte a Tabela de materiais) para definir uma corrente zero e suavemente, aumente até EJCs aparecem (ou até que o limite é atingido).
   4. Realizar a estimulação em um regime de suprathreshold, com a estimulação atual aumentou aproximadamente duas vezes, em comparação com o limiar para a observação de EJCs.
      Nota: Em nossa experiência, tal intensidade de estimulação é ideal para evitar falhas de potencial de ação e potencial de ação disparando. Por exemplo, se EJCs aparecem na corrente de estimulação de 0.2 mA, usar uma corrente de 0,4 mA durante todo o experimento.
3. Selo resistência
   1. medir a resistência de selo do eletrodo gravação macropatch colocando o interruptor de resistência do eléctrodo do amplificador para " teste do selo " posição. Observe que o valor da resistência do selo em GΩ será exibido no " atual " janela.
   Certifique-se da resistência do selo está no intervalo de 0,5 - 2 M
   2. Ω. Valores fora desse intervalo indicam que o eletrodo é polido não corretamente ou não devidamente posicionado.
   3. Monitorar a resistência do selo em toda a gravação, certificando-se que permanece constante durante todo o experimento.

4. Análise

1. analisar gravações empregando personalizado software para análise (ver Tabela de materiais).
   Nota: Nosso laboratório utiliza software in-house Quantan ³¹, que é personalizado para a detecção de EJCs e mEJCs gravado focally ( Figura 4). Este software inclui um filtro Gaussian digital e permite a detecção de picos quantal em sobreposição multi quantal eventos ( Figura 4A). Outras abordagens são descritas em ¹⁷.

Figura 4. Análise de quantal. Deteção de mEJCs (A) e (B) de EJCs por Quantan software. A área do evento é marcada em verde, e picos são marcados por setas vermelhas. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Macropatch focal gravações permitem monitoramento atividade sináptica de boutons sinápticas selecionados (Figura 5). Quando o eletrodo é posicionado na parte superior uma bouton synaptic (Figura 5A, site 1), os mEJCs gravados (Figura 5, local 1) têm uma amplitudes exceda significativamente o nível de ruído e em ponto de aumentação fases (em uma escala do milissegundo sub). Quando o eletrodo gravação é afastado o bouton sináptica por vários mícrons (Figura 5A, local 2), as amplitudes de declínio mEJCs gravado quase para o nível de ruído (Figura 5B, site 2). Os EJCs gravados mal podem distinguir-se do barulho e eles têm prolongado aumento fases (Figura 5, local 2 versus local 1).

O número limitado de sítios de lançamento contribuindo para EJCs gravados e mEJCs, bem como a rápida cinética das correntes sinápticas gravou focally, permite a detecção precisa de eventos de lançamento em mutantes com elevada atividade sináptica. Isso pode ser claramente ilustrado por gravações de mEJCs de complexin mutante nulo (figura 6A). Atividade espontânea é elevada drasticamente neste mutante³², e, portanto, mEJPs gravados intracelular se sobrepõem e não pode ser claramente distinguidos uns dos outros (Figura 6B), enquanto gravações focal²² permitem precisos detecção de eventos de lançamento espontâneo (Figura 4A).

Figura 5. Gravações de EJCs e mEJCs de um selecionado bouton. (A) colocando o eletrodo sobre um selecionado bouton (local 1) e movê-lo longe o bouton (local 2). As imagens mostram o GFP-CD8 marcado MNJ visualizado com epi-fluorescência (a. 1), gravação de eletrodo sobre a fibra muscular (a. 2), e sobreposições (a. 3, 4), com o eletrodo posicionado sobre o local 1 (a. 3) ou (do site 2 A. a. 4). barra de escala = 10 µm. (B) mEJCs gravados a partir do bouton (local 1) distinguem-se claramente o ruído de gravação e tem fases de ascensão rápidas. Em contraste, mEJCs gravado do site 2 não pode ser distinguida confiantemente o ruído de gravação, as amplitudes são reduzidos são, e eles têm um tempo mais lento-curso. (C) as Amplitudes de EJCs gravado a partir do bouton (local 1) exceder por muitos-dobra que as amplitudes de EJCs gravadas do site 2, e eles também têm cinética mais rápida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. Focal macropatch contra gravações intracelulares. Gravações focais permitem a detecção precisa de mEJCs em complexin mutante nulo (A), enquanto gravações intracelulares (B) desta exposição mutante liberar eventos que se sobrepõem e não podem ser detectados de forma confiável. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Drosófila representa um organismo modelo vantajoso para estudar a transmissão sináptica. Várias configurações de gravação foram usadas no MNJ larval, incluindo gravações intracelulares de potenciais sinápticos, gravações das correntes sinápticas com dois eletrodos tensão braçadeira^33,34e macropatch focal gravações das correntes sinápticas descritas aqui. A última técnica permite a quantificação precisa da transmissão sináptica em boutons visualizados.

O sucesso do protocolo descrito depende criticamente a capacidade de Visualizar claramente a área de interesse e personalizar a preparação de eletrodos de gravação. Assim, qualidade óptica DIC, um objectivo de imersão de água de alta magnificação com uma longa distância de trabalho e equipamentos personalizados para fogo, polimento e dobra de gravação eletrodos são criticamente importantes.

A vantagem dessa abordagem é que permite monitorar a atividade de algumas sinapses que estão posicionadas sob o eletrodo de gravação. Deve-se notar, no entanto, boutons posicionados perto da borda do eletrodo também podem contribuir para atividade gravada. É fundamental, portanto, que não altera a posição do eletrodo, bem como a resistência do selo, durante o experimento.

A capacidade de monitorar a atividade de um único bouton pode ser potencialmente combinada com recentes tecnologias de imagem. Por exemplo, de detecção óptica de atividade às zonas ativo individual³⁵ pode ser combinada com gravações focais de EJCs e mEJC, e isto poderia acoplar a resolução espacial de detecção óptica com resolução temporal de gravações elétricas.

Os autores não têm nada para divulgar.

Com a subvenção de NIH R01 MH 099557