초파리 애벌레 신경 근육 학 교차로에서 시 냅 스 전류의 초점 Macropatch 녹음

시 냅 스 전류 초파리 3 탈피 애벌레 neuromuscular 접속점에 시각화 된 시 냅 스 boutons에서 focally 기록 될 수 있습니다. 이 기술은 단일 시 냅 시스 bouton의 활동을 모니터링 수 있습니다.

Drosophila 신경 근육 학 교차로 (NMJ) glutamatergic 시 냅 스 전송 연구에 우수한 모델 시스템입니다. 초파리 애벌레 NMJ에 시각화 된 boutons 시 냅 스 전류 초점 macropatch 녹음 기술을 설명합니다. 이 기술은 micropipettes, 높은 배율, 장거리 물 침수 목표, 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 광학와 형광 화합물 현미경 녹음의 맞춤된 제작을 해야 합니다. 첨부 합니다. 기록 전극 선택된 시 냅 시스 bouton DIC 광학, epi-형광, 또는 둘 다 시각 위에 배치 됩니다. 이 기법의 장점은 릴리스의 사이트의 제한 된 수의 시 냅 스 활동을 모니터링을 허용 한다입니다. 기록 전극은 여러 미크론의 직경 그리고 전극 가장자리 밖에 배치 된 릴리스 사이트 크게 영향을 주지 않습니다 기록된 전류. 기록 된 시 냅 스 전류 빠른 속도 고 쉽게 해결 될 수 있습니다. 이러한 장점은 향상 된 자연 또는 비동기 시냅틱 활동 돌연변이 플라이 라인의 연구에 대 한 특히 중요 하다.

초파리 는 시 냅 스 전송 제어 하는 분자 메커니즘을 연구 하는 우수한 모델 시스템입니다. 초파리 에서 신경 근육 학 시스템 glutamatergic, 이며 따라서 초파리 신경 근육 학 교차로 (NMJ) glutamatergic 자료의 보존된 기능을 공부를 사용할 수 있습니다. 1 월과 1 월의 연구¹, 이후 세 번째 탈피 애벌레는 갖는 자발적 시 냅 스 전송 흥분 성의 접합 잠재력 (EJPs) 또는 전류 (EJCs)을 모니터링 하 여 공부 하 광범위 하 게 사용 되었습니다. EJPs는 일반적으로 기록 침 날카로운 유리 마이크로 전극, 그들은 주어진된 근육 섬유에서 시 냅 스를 만드는 모든 boutons를 포함 하 여 전체 NMJ의 활동을 반영 하 고.

대조적으로, 출시의 사이트의 제한 된 수의 활동 신경 터미널 또는 시 냅 스 varicosities 근처 micropipette 팁을 배치 하 여 focally 기록할 수 있습니다. 이 기술은 원래 캐츠와 Miledi²에 의해 고용 되었다 및 초점 세포 외 녹음 개구리^3,,45, 마우스⁶ 를 포함 한 여러 NMJ 준비에서 성공적으로 고용 되어 ^{, 7 , 8}, 갑각류^{9,10,11,12,13,,1415,16}및 초파리^{17,18,19,20,21,,2223}. 이 이렇게는 최적화 된 레코딩 전극^24,25macropatch 누가 Dudel에 의해 더 개발 되었다. Dudel의 구현에서이 기술을 밀접 하 게 일치 하는 느슨한 패치 클램프 방법²⁶.

초파리 애벌레 NMJ 시 냅 스 boutons, 명확 하 게 정의 하 고 유전자 인코딩된 신경 형광 태그 ( 테이블의 자료참조)와 유전자 변형 라인은 쉽게 사용할 수 있습니다. 이러한 장점이 우리 EJCs와 mEJCs는 선택 된 시 냅 시스 bouton^20,,2122에서 기록를 활성화. 여기, 우리는이 기술을 자세히 설명합니다.

1. 제조의 기록 전극

1. 사용 다음 유리 전극 당기
2. 프로토콜 (재료의 표 참조):
   1. 1: 열 510 당겨-속도 30 시간 250; 2 호선: 열 490 풀-속도 30 250 시간.
      참고: 단위; 당 0.5 ms에 해당 하는 시간 단위 다른 단위는 상대. 램프 테스트 수행 후 모든 필 라 멘 트에 대 한 열 값을 조정 한다.
3. 현미경 (35 x 배율)를 사용 하 여 가져온된 전극의 내경 ( 그림 1A) 7-10 µ m의 범위에 있는지 확인. 먼지 축적을 방지 하기 위해 단단히 닫힌된 용기에 모세를 저장.
1. 화재 연마
   1. 화재 폴란드어 모세 (1-2에 대 한 최대 열 값의 80-90%)는 마이크로-포지를 사용 하 여 (재료의 표 참조). 세련 된 전극의 최종 내부 직경은 5 µ m ( 그림 1A) ²⁷ 확인.
2. 굴곡
   참고: 두 개의 굴절 높은 확대 목표 아래 근육 위에 전극 위치 하기 위해 만들어집니다.
3. 그림 1B에서 표시 하는 장치를 사용 하 여
   . 조작자에 전극을 수정 하 고 필 라 멘 트, 아니라 그것을만 지는 팁 놓고
   1. 집합 열 값의 최대 60-70%를 누르고 1-2에 대 한 마이크로-포지의 페달 (재료의 표 참조)는 필 라 멘 트가 열. L 자 모양의 바늘을 사용 하 여 부드럽게 풀 ( 그림 1B 확대) 전극의 팁 다운. 약 90 ^o ( 그림 1C)에 굴곡을 만들어.
   2. 전극 토치의 불꽃에 집게를 사용 하 여 손으로 누른 첫 번째 벤드에서 7-10 밀리미터의 거리에 두 번째 벤드 약 120 ^o ( 그림 1C)의 각도 확인.

그림 1. Micropipette 제조의 마지막 단계. (A) 전극 고 화재 연마 후 팁. (B.1) 팁 절곡에 대 한 설정. (B.2) 박스형된 영역 오른쪽에 확대 표시 됩니다. 전극과는 필 라 멘 트 전극 팁은 약간 와이어 위에 위치 하 고 감동 하지 있도록 고정 됩니다. (C.1) 기록 전극입니다. (C.2) 박스형된 영역 오른쪽에 확대 표시 됩니다. 첫 번째 벤드는 약 90 °의 각도 첫 번째 벤드와 전극의 끝 사이 거리가 약 1 m m. 규모 바 = 3 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2. 추가 예비 단계

1. 준비 (mM)에 heamolymph 같은 (HL3) 솔루션: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl ₂, 10 NaHCO ₃, 5 트 레 할 로스, 115 자당, 5 HEPES, 및 1mm CaCl ₂; pH 7.3-를 조정 7.4. 냉장고에 솔루션을 유지 하 고 매주 신선한 게.
2. 게 자극 pipets 같은 방법으로 녹음 유리 pipets, 그들을 구 부 필요가 없습니다 않습니다.
   참고: 자극 전극의 준비는 ²⁸와 ²⁷에 자세히 설명 되어 있습니다. 마지막 지름 5-7 µ m의 범위에 있어야 화재 연마 후.
3. 삽입 주사기에 연결 된 microelectrode 홀더에서 자극 피 펫.
4. 작은 접시 (35 x 10 m m) 실리콘 고무 에폭시 코팅에서 제조 해 부 접시 (재료의 표 참조) ²⁸에 설명 된 대로.
   참고: 실리콘 고무 사용 하기 전에 완전히 경화 되어야 합니다.
5. 방황 3 탈피 애벌레를 선택 하 고 ^{27 , 28 , , 29 30}에 설명 된 대로 그것을 해 부.
   참고: boutons를 시각화 하려면 비행 스트레인 CD8-GFP (재료의 표 참조)
   1. 사용 집게 (재료의 표 참조), 선택 3 ^rd 탈피 애벌레는 유리병에서.
   2. 핀 첫 번째 핀 후부 배치 애벌레와 다른 핀 앞쪽 (가까운 입 후크).
   3. 추가 HL3 솔루션.
   4. 애벌레의 등 쪽 측에 봄을가 위 (재료의 표 참조)에서 최고 핀 하단 하나를 사용 하 여 잘라 만들.
   5. 애벌레 필렛, 애벌레의 왼쪽과 오른쪽에 2 추가 핀 배치를 핀.
   6. 배 짱과 집게를 사용 하 여 tracheas 제거.
   7. 봄이 위를 사용 하 여 복 부 신경 코드 밖에 신경을 잘라.

3. EJCs의 전기 레코딩

그림 2. 녹음 설정. 샘플 NMJ 실리콘 코팅된 페 트리 접시 (화살표) epifluorescence 기능, 높은 확대 목표 및 2 개의 micromanipulators 수직 화합물 현미경의 이동식 무대 위에 위치에 고정. 현미경은 진동 방지 테이블에 배치 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

초점 macropatch 녹음 선택 된 시 냅 스 boutons (그림 5)에서 모니터링 시 냅 시스 활동 가능 전극 (그림 5A, 사이트 1) 시 냅 시스 bouton 위에 가져갈 때 기록 된 mEJCs (그림 5C, 사이트 1)는 진폭 잡음 레벨을 크게 초과 하 고 (하위 밀리초 범위)에서 단계 상승 날카로운. 때 기록 전극은 이동 시 냅 시스 bouton 멀리 몇 미크론 (그림 5A, 사이트 2), 기록 된 mEJCs 감소의 진폭에 의해 거의 소음 수준 (그림 5B, 2). 기록 된 EJCs 겨우 소음에서 구별 될 수 있다 그리고 그들은 단계 (그림 5C, 사이트 2 사이트 1 대) 상승 연장 있다.

기록 된 EJCs 및 mEJCs, 뿐만 아니라 시 냅 스 전류의 급속 한 활동에 기여 하는 릴리스 사이트의 제한 된 수 focally 기록, 돌연변이에서 출시 이벤트의 정확한 탐지를 가능 하 게 높은 시 냅 시스 활동. 이 명확 하 게 complexin null 돌연변이 (그림 6A)에서 mEJCs의 녹음 하 여 그림 수 있습니다. 자발적인 활동은 크게이 돌연변이³², 상승 그리고 따라서 침 기록 mEJPs 중복 초점 녹음²² 사용 정확한 서로 (그림 6B), 명확 하 게 구별 될 수 없다 자발적인 출시 이벤트 (그림 4A)의 탐지.

그림 5입니다. EJCs 및 mEJCs에서 선택한 bouton의. (A) 선택한 bouton (사이트 1) 전극 배치 하 고 (사이트 2) bouton 멀어. 이미지 표시 CD8-GFP 태그 NMJ 근육 섬유 (A.2)를 통해 전극 기록 피-형광 (A.1)와 시각 그리고 오버레이 (A.3, A.4), 전극으로 사이트 1 (A.3) 또는 2 ( A.4). 눈금 막대 = 10 µ m. (B) mEJCs (사이트 1) bouton에서 기록 녹음 잡음에 명확 하 게 구별 하 고 급속 한 상승 단계. 대조적으로, mEJCs 사이트 2에서에서 기록 녹음 잡음에서 안정적으로 구별 될 수 없습니다, 그들의 진폭은 감소 선택할, 그리고 그들은 느린 시간 코스. (C)는 진폭의 EJCs bouton (위치 1)에서 기록 된 많은 배 사이트 2에서 기록 된 EJCs의 진폭에 의해 초과 그리고 그들은 또한 더 빠른 속도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 6입니다. 세포내 녹음 대 초점 macropatch. 초점 녹음 동안이 돌연변이 전시에서 세포내 기록 (B) 출시 이벤트를 중복 하 고 안정적으로 검출 될 수 없다 complexin null 돌연변이 (A)에 mEJCs의 정확한 탐지를 사용 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

초파리 는 공부 시 냅 스 전송에 유리한 모델 유기 체를 나타냅니다. 여러 녹음 구성 시 냅 스 전위, 시 냅 스 전류 두 전극 전압 클램프^33,34, 및 초점 macropatch의 녹음의 세포내 녹음을 포함 한 애벌레 NMJ에 사용 되었습니다. 여기서 설명 하는 시 냅 스 전류 기록입니다. 후자의 방법을 시각화 된 boutons에 시 냅 시스 전송의 정확한 정량화를 허용합니다.

설명된 프로토콜의 성공을 비판적으로 관심의 영역을 명확 하 게 시각화 하 고 기록 전극의 준비를 사용자 지정 하는 기능에 따라 달라 집니다. 따라서, 품질 DIC 광학, 긴 작동 거리, 및 화재 연마 및 전극 녹음의 굽 힘에 대 한 사용자 지정 된 장비와 높은 확대 물 침수 목표는 매우 중요 하다.

이 방법의 장점은 기록 전극에서 위치는 몇 시 냅 스의 활동을 모니터링을 허용 한다입니다. 그러나 주목 해야 한다,, boutons 전극의 가장자리 근처 위치 또한 기록된 활동에 기여할 수 있습니다. 그것은 중요 한, 따라서, 인감 저항 뿐만 아니라, 전극의 위치는 실험 과정에서 변경 되지 않습니다.

최근 이미징 기술로 단일 bouton의 활동을 모니터 하는 능력을 잠재적으로 결합할 수 있습니다. 예를 들어 개별 활성 영역³⁵ 활동의 광학 탐지의 EJCs 및 mEJC, 초점 녹음 결합 될 수 있다 그리고이 전기 녹음의 시간 해상도 가진 광학 탐지의 공간 해상도 부부 수 있습니다.

저자는 공개 없다.

NIH 보조금 R01 수소 099557에 의해 지원