Comparando os efeitos do fumo eletrônico do cigarro e do cigarro em uma novela

Este protocolo descreve um método para expor roedores ao vapor de cigarro eletrônico (vapor E) e fumaça de cigarro. As câmaras de exposição são construídas modificando câmaras de anestesia com um sistema de bombeamento automatizado que fornece vapor E ou fumaça de cigarro a roedores. Este sistema pode ser facilmente modificado para acomodar muitos endpoints experimentais.

Cigarros eletrônicos (E- cigarros ) estão sendo amplamente utilizados , e cresce em popularidade. Estima-se que mais de 9 milhões de adultos os usem regularmente. Os potenciais efeitos adversos para a saúde da exposição ao vapor de cigarro eletrônico (vapor E) são mal definidos. Enquanto vários modelos animais de exposição a vapor foram desenvolvidos, poucos modelos expõem roedores a quantidades clinicamente relevantes de nicotina e fazem comparações diretas com a fumaça de cigarro dentro do mesmo sistema de exposição. Aqui, apresentamos um método para construir e operar uma câmara de vapor E e câmara de fumo de cigarro. As câmaras são construídas por equipar câmaras de anestesia com um sistema de bombeamento controlado por computador que fornece quantidades consistentes de EA exposição à nicotina é medida indiretamente pela quantificação dos níveis séricos de cotinina pré e pós-exposição, que podem ser modificados para acomodar vários tipos de cigarros E e cigarros de tabaco e podem Ser utilizados para comparar os efeitos do vapor E e do fumo do cigarro in vivo .

Desde que entraram no mercado norte-americano em 2004, os cigarros eletrônicos (cigarros eletrônicos) se expandiram para uma indústria de bilhões de dólares, e estima-se que quase 9 milhões de adultos os usam regularmente. Em 2014 e 2015, mais estudantes do ensino médio usaram cigarros eletrônicos do que cigarros convencionais ² . O crescente número de usuários de cigarros eletrônicos gerou um esforço de pesquisa para avaliar seus efeitos adversos potenciais na saúde.

Os cigarros eletrônicos geram um vapor (denominado "vapor E") por aquecimento de uma solução viscosa que tipicamente contém uma mistura de água, polietilenoglicol ou glicerina vegetal, nicotina e aromas ^{3 , 4} . Foi demonstrado que o vapor E contém vários compostos nocivos incluindo espécies de oxigénio reactivo (ROS), nicotina, vários aldeídos e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos ^{5 ,}6. Muitos destes compostos são formados durante o processo de vaporização de E-líquido antes da inalação ⁷ . Notavelmente, vários destes compostos nocivos também estão presentes na fumaça de cigarro, levantando preocupação de que o uso de cigarros eletrônicos podem ter consequências adversas semelhantes para a saúde ⁷ .

Há pouco consenso sobre os efeitos para a saúde dos E-cigarros. Para resolver este problema, foram desenvolvidos vários modelos animais de exposição ao vapor E ( Tabela 1 ). Estes modelos empregam uma variedade de métodos tais como a exposição do vapor do E-vapor do corpo inteiro ea ventilação mecânica. Embora os modelos atuais tenham fornecido dados perspicazes, poucos fazem comparações diretas com a fumaça do cigarro dentro do mesmo sistema de exposição ( Tabela 1 ). Além disso, embora vários estudos em seres humanos tenham mostrado que usuários de cigarros eletrônicos e fumantes de cigarros têm níveis de cotinina sérica entre 30-200 ng / mL, muitos modelos de vapor E e exposição a fumaça de cigarro caemIde este intervalo ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12} .

Aqui apresentamos um método para comparar os efeitos da exposição ao fumo de cigarro e ao vapor E in vivo que produzem níveis séricos de cotinina semelhantes aos estudos em seres humanos.

O protocolo seguinte foi realizado sob a orientação e aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan (IACUC).

1. Conjunto eletrônico da câmara do vapor do cigarro

NOTA: A câmara completa deve ser colocada numa exaustão durante o uso. A câmara aqui foi alojada num ambiente de laboratório controlado por temperatura e filtrado. Os investigadores podem optar por monitorar tais aspectos do sistema para garantir a consistência da qualidade do ar ambiente. Como uma opção, cobrindo os monitores com uma gaiola de metal pode impedir a manipulação de roedores, permitindo que os monitores a amostra ambiente da câmara interior.

1. Adquirir uma câmara de anestesia com tampa removível estanque ao ar com volume de 20 L.
2. Usando uma serra de calibre equipada com uma lâmina apropriada para cortar o material, corte um orifício de 10,2 cm de diâmetro na tampa da câmara a aproximadamente 7,6 cm da extremidade traseira docâmara.
3. Insira o respiradouro ajustável no orifício e monte no lugar com qualquer adesivo de calafetar.
   NOTA: Certifique-se de que o calafetar adesivo não é acessível para os roedores na câmara, pois eles podem mastigar o calafetar. Para evitar este possível problema, aplique o calafetar no exterior da parede da câmara para montar o respiradouro.
4. Corte a tubulação de silicone em dois segmentos de 15 cm e prenda as extremidades em ambos os lados de um conector em T.
   NOTA: A tubulação de silicone tem o potencial de reagir com alguns componentes do vapor e ou do fumo do cigarro. Assim, os investigadores podem considerar o uso de tubos não reativos.
5. Passe os dois tubos de silicone através de orifícios prontos perto da parte frontal da tampa da câmara, de modo que o conector em T fique dentro da câmara. Certifique-se de que a tubulação está presa à tampa com calafetagem adesiva ou fita isoladora.
6. Conecte as extremidades livres da tubulação de silicone às extremidades de saída de duas micro bombas de ar. As bombas devem ser montadas na tampa da câmara comFace fita adesiva ou calafetar.
   NOTA: O comprimento da tubulação conectada à extremidade de saída da bomba deve ser curto para limitar a quantidade de coleta de vapor na superfície interna da tubulação durante o uso.
7. Com um novo tubo de silicone, ligue uma extremidade ao lado de entrada de uma das bombas de ar (Bomba A na Figura 1 ) e corte este tubo até aproximadamente 4 cm de comprimento. Este é o local onde o cigarro eletrônico será inserido durante o uso da câmara. Certifique-se de que o diâmetro do tubo permite um ajuste confortável ao redor da extremidade do e-cig.
8. Com um novo tubo de silicone, ligue uma extremidade ao lado de entrada da outra bomba de ar (Bomba B na Figura 1 ). Esta bomba irá introduzir ar ambiente para dentro da câmara. Como tal, a extremidade do tubo deve ser colocada fora do exaustor. O comprimento deste tubo não é crítico, mas deve ser o mais curto possível para limitar a resistência ao fluxo de ar.
9. Dentro da câmara anexar dois pequenos ganchos com adesivo de dupla face para segurar oxigênioMonóxido de carbono.

Figura 1. Esquema da Câmara de Cigarro-Vapor Eletrônica.
A câmara é alojada na exaustão (não ilustrada). A bomba de ar ambiente (Bomba B) introduz o ar ambiente de fora do exaustor na câmara continuamente a 2 L / min. A bomba E-cig (bomba A) sopra 133 mL de vapor E durante 4 s, com um intervalo de repouso de 30 s. Vapor E e mistura de ar ambiente antes de ser bombeada para dentro da câmara. Os monitores de gás medem continuamente as concentrações de monóxido de carbono (CO) e oxigênio (O ₂ ) dentro da câmara. O vapor E é esgotado passivamente através do respiradouro na exaustão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Cigarro Smoke-câmara de montagem

NOTA: Praticamente qualquer marca oF cigarro pode ser usado com este sistema, porém cigarros de pesquisa padronizados, como a Universidade de Kentucky 1R6F Research Cigarro são rentáveis, confiável e melhor para esta aplicação.

1. Siga os passos 1.1 - 1.6, & passo 1.9.
2. Com um novo tubo de silicone, ligue uma extremidade ao dispositivo de iluminação do cigarro e a outra extremidade ao lado de entrada da bomba de ar (Bomba A na Figura 2 ). O dispositivo de iluminação do cigarro deve ser colocado dentro do exaustor e fora da câmara durante o uso.
   Nota: A construção do dispositivo de iluminação do cigarro requer conhecimento de fabricação de metal e engenharia elétrica. Embora um guia passo-a-passo para a construção não será dado aqui, consulte materiais suplementares para planos.
3. Com um novo tubo de silicone, ligue uma extremidade à outra bomba de ar (Bomba B na Figura 2 ). Esta bomba irá introduzir ar ambiente para dentro da câmara, assim a extremidade do tubo deve ser colocada fora da exaustão. >
4. Cortar várias fendas verticais de 5 mm de largura na parede frontal da câmara e montar uma ventoinha de computador no exterior da câmara de forma a cobrir esta abertura. Assegure-se de que a frente do ventilador fique voltada para a câmara de forma que o ventilador soprará ar para dentro da câmara através desta abertura.

Figura 2. Esquema da Câmara de Fumo de Cigarro.
A bomba de ar ambiente (Bomba B) introduz o ar ambiente de fora do exaustor na câmara continuamente a 2 L / min. A bomba A desenha no cigarro aceso por 40 s com taxa de 2 L / min, e 20 s mais tarde o ventilador do computador evacua a câmara durante 3 min. O fumo eo ar ambiente misturam antes de serem bombeados para dentro da câmara. Os monitores de gás medem continuamente as concentrações da câmara de monóxido de carbono (CO) e de oxigênio (O ₂ ). A fumaça é exaurida através do respiradouro na exaustão.Ftp_upload / 55672 / 55672fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

3. Montagem e Software do Microcontrolador

1. Controle o sistema de bombeamento da câmara de vapor E-cigarro e da câmara de fumo do cigarro por microcontroladores separados. Faça o download do software do microcontrolador e carregue os códigos de operação fornecidos nos Materiais complementares . O código eletrônico do vapor do cigarro funcionará a bomba de ar da sala continuamente e ativará a bomba do E-cigarro para uma duração de 4 s cada 30 s. O código de fumo do cigarro irá executar a bomba de ar ambiente continuamente, ativar a bomba de cigarro por 40 s, e ativar o ventilador do computador 20 s após a bomba de cigarro parou. O ventilador desliga-se depois de funcionar durante 3 min.
   Nota: A temporização das bombas e da ventoinha pode ser ajustada conforme necessário. Instruções do fabricante de referência sobre como carregar códigos relevantes para o microcontrolador.
2. AssembrarConecte o microcontrolador, conecte os fios, diodos, resistores e capacitores à placa de pão, conforme ilustrado na Figura 3, e conecte os cabos de crocodilos nas respectivas bombas de ar (e no ventilador do computador para a câmara de fumo do cigarro). Coloque o microcontrolador fora do exaustor, se possível.

Figura 3. Esquema do Microcontrolador.
Esquema de microcontrolador e placa de pão para operar o tempo de bombas de ar e ventilador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Animais

1. Utilizar ratos adultos pesando entre 450 e 520 g.
2. Ratos de grupo de acordo com o tipo de exposição ( por exemplo , cigarro eletrônico, fumaça de cigarro, ar ambiente bombeado para dentro da câmara).
3. Neste momento prPara a exposição, coletar 500 μL de sangue em tubos revestidos com EDTA da veia da cauda usando uma seringa para medir a concentração basal de cotinina no soro.
4. Reduzir as amostras de sangue a 20.000 xg durante 30 min a 4 ˚C e recolher o soro. Certifique-se de que as amostras são refrigeradas em gelo durante todo este processo.
5. Seguindo o protocolo do fabricante, ensaio para cotinina nas amostras de soro colhidas. As amostras também podem ser armazenadas a -80 ° C para uso posterior.

5. Operação da Câmara de cigarros eletrônicos

1. Limpe o interior da câmara com etanol a 70%, depois com água desionizada e deixe secar ao ar até que a câmara fique completamente seca (ou cerca de 30 minutos).
2. Calibre os monitores de gás e monte todo o monitor na parede dentro da câmara.
3. Coloque ratos dentro da câmara. Note que até três animais podem ser expostos simultaneamente.
4. Certifique-se de que o cigarro eletrônico está totalmente carregado com o E-líquido adequado e insira o cigarro eletrônicoNo tubo de entrada. É fundamental garantir que os níveis de bateria E-cigarro e E-líquido são adequados durante toda a duração da exposição de 90 min.
5. Ligue as bombas de ar e inicie o temporizador.
6. Durante a exposição, observe os monitores de gás para garantir que a câmara contenha> 20% de O ₂ e 0 ppm de CO.
   Nota: Se os níveis de oxigénio caírem, a câmara pode não estar bem ventilada ou o monitor de oxigénio pode não ser adequadamente calibrado.
7. Uma vez que o tempo de exposição tenha atingido 90 minutos, remova o cigarro eletrônico e continue a operar as bombas de gás para ventilar o vapor restante. Além disso, o topo da câmara pode ser levantado para acelerar a ventilação.
8. Uma vez que o vapor tenha limpado, remova os ratos e limpe a câmara.
9. Recolher 500 μL de sangue da veia da cauda de cada rato cerca de 1 h após a exposição à conclusão do protocolo experimental.
10. Siga as etapas 4.4 a 4.5 para isolar o soro e ensaiar a cotinina.

6. Operando a Câmara de Tabaco

1. Siga os passos 5.1 - 5.3.
2. Insira o cigarro no dispositivo de iluminação do cigarro, com a extremidade do cigarro contra os elementos de aquecimento.
3. Ligue o dispositivo de iluminação do cigarro até que a ponta do cigarro comece a arder (cerca de 5 s).
4. Uma vez que o cigarro está aceso, ligar o sistema de bombeamento, iniciar o timer, e observar a queimadura de cigarro para conclusão (cerca de 40 s).
5. Uma vez que o cigarro queimou, retire cuidadosamente o cigarro gasto do dispositivo de iluminação do cigarro com fórceps.
6. Certifique-se de que os níveis de CO não subam acima de 1000 ppm e os níveis de O ₂ não caem abaixo de 20%. O tempo ea duração do ventilador do computador são críticos na prevenção do acúmulo de monóxido de carbono.
7. Após 4 min, desligue o sistema de bombagem e volte ao passo 6.2 até que os ratos fiquem expostos ao fumo do tabaco durante 90 minutos (ou aproximadamente 23 cigarros).
   NOTA: Os níveis de monóxido de carbono 4 minDeve cair abaixo de 400 ppm, caso contrário, o monóxido de carbono pode começar a se acumular na câmara.
8. Quando a exposição estiver completa, continue a deixar o sistema de bombeamento ligado para ventilar o fumo residual. Quando o monóxido de carbono cai abaixo de 100 ppm, remova os ratos da câmara. Isso deve levar de 5 a 10 minutos.
9. Remova os ratos e limpe a câmara.
10. Recolher 500 μL de sangue da veia da cauda cerca de 1 h após a exposição à conclusão do protocolo experimental, tal como com os cigarros electrónicos.
11. Siga as etapas 4.4 a 4.5 para isolar o soro e ensaiar a cotinina.

Monitoramento de monóxido de carbono e oxigênio

As concentrações de oxigênio não caíram abaixo de 20% durante a exposição ao vapor e as concentrações de CO permaneceram indetectáveis ​​ao longo da exposição. Os monitores de gás durante a exposição à fumaça de cigarro indicaram que a concentração de oxigênio permaneceu acima de 20%. As concentrações de monóxido de carbono não excederam 1000 ppm ( Figura 4 ).

Figura 4: Concentrações de monóxido de carbono na câmara de fumar cigarros. A concentração de monóxido de carbono foi registada a cada 30 s ao longo da introdução da fumaça de cigarros 1R6F. Os resultados apresentados são médias de 3 ciclos consecutivos de 4 min. As concentrações de monóxido de carbono não excederam 1.000 ppm. O cigarro é queimado até completar mais de 40 s, eo ventilador é ativadoD 20 s mais tarde ( isto é, o ventilador é activado 1 minuto após a ignição do cigarro).

Cotinina sérica pré e pós-exposição

A pré-exposição e 1 h de cotinina sérica pós-exposição para o grupo E-vapor (n = 3) foi de 4,2 ± 0,4 ng / mL e 171,6 ± 20,5 ng / mL, respectivamente. A pré-exposição e 1 h de cotinina sérica pós-exposição para o grupo de fumo de cigarro (n = 3) foi de 3,9 ± 0,3 ng / mL e 98,8 ± 2,1 ng / mL, respectivamente ( Figura 5 ).

Figura 5: Níveis de cotinina no soro após exposição ao fumo de cigarro ou cigarro eletrônico. A cotinina sérica foi medida antes do início do protocolo e 1 h após uma sessão de exposição de 90 minutos. A cotinina sérica pré-exposição e 1 h pós-exposição para o grupo e-vapor foi de 4,2 ± 0,4 ng / mL aNd 171,6 ± 20,5 ng / mL, respectivamente. A pré-exposição e 1 h de cotinina sérica pós-exposição para o grupo de fumo de cigarro foi de 3,9 ± 0,3 ng / mL e 98,8 ± 2,1 ng / mL, respectivamente. A diferença entre as concentrações de cotinina no soro pré e pós-exposição foi estatisticamente significativa. * P @ 0,05.

Figura 6: Câmara de Vapor de Cigarro Electrónica e Câmara de Fumo de Cigarro. Imagem do vapor de cigarro eletrônico (direita) e câmara de fumaça de cigarro (esquerda) dentro do exaustor. As caixas vermelhas contêm microcontroladores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Características dos Modelos de Exposição de Cigarros Eletrônicos.

Aqui descrevemos um método para construir câmaras que expõem os roedores ao vapor E e ao fumo do cigarro de uma forma controlada ( Figura 6 ). A construção da câmara de cigarros electrónicos é relativamente simples e barata em comparação com os sistemas de exposição comercial ^{14 , 15 , 16} . As peças e ferramentas necessárias para construir a câmara estão prontamente disponíveis a partir de fornecedores comerciais on-line. Da mesma forma, a construção da câmara de fumo de cigarro é relativamente simples, com excepção do dispositivo de iluminação do cigarro que deve ser fabricado (ver Materiais Complementares para planos).

Uma vez que as câmaras são construídas, um passo crítico do sistema de exposição é a calibração das câmaras para expor os roedores para a quantidade desejada de nicotina. Tanto na câmara de cigarros electrónicos como na câmara de cigarros, ajustando a quantidade de exposição total tIme é talvez o método mais fácil para aumentar ou diminuir a quantidade de exposição à nicotina. Aumentar o tempo de sopro no sistema de exposição a cigarros eletrônicos pode aumentar a dose de nicotina, contudo o vapor de vapor do cigarro eletrônico durante um longo período de tempo mostrou aumentar os níveis de ROS, aldeídos e outros compostos perigosos e pode Ou pode não refletir os hábitos típicos de um usuário de cigarro eletrônico ⁵ . A duração do sopro e o tempo de exposição total podem ser ajustados modificando o código carregado para o microcontrolador. Além disso, deve notar-se que a concentração de nicotina em soluções E-cigarette, bem como a tensão do elemento de aquecimento E-cigarette, pode variar significativamente e deve ser tido em conta ao calibrar o sistema.

Uma das maiores vantagens deste sistema de exposição é a sua versatilidade. Praticamente qualquer tipo de solução e-cig ou e-cig pode ser usado com este sistema. Esta é uma característica especialmente útilDado que o mercado de cigarros electrónicos já inclui mais de 400 marcas e milhares de soluções E-cigarette ¹³ . Adicionalmente, o sistema de exposição é compatível com múltiplos pontos de avaliação experimentais, permitindo que os efeitos do E-cigarro em vários sistemas de órgãos e processos de doença sejam estudados. Também reconhecemos que existem várias limitações a este paradigma de exposição, como o método pelo qual os animais são expostos ao vapor. E-cigarro usuários diretamente inalar E-vapor, enquanto neste paradigma os roedores inalar E-vapor passivamente. Além disso, os roedores provavelmente também absorverão compostos dentro do vapor ou fumaça por outras vias ( ou seja, absorção dérmica direta e ingestão enquanto preening). No entanto, pensamos que os benefícios do sistema de exposição superam em muito as limitações.

Globalmente, este paradigma de exposição proporciona uma exposição consistente e clinicamente relevante ao vapor de E e ao fumo de cigarro, e pode ajudarAuxiliar o esforço de pesquisa na determinação dos efeitos adversos à saúde do cigarro eletrônico e da fumaça de cigarro.

Os autores não têm nada a revelar.

Esta pesquisa foi tornada possível pelo Aortic Research Grant (University of Michigan) ao Dr. Eliason. Os autores também gostariam de reconhecer Nick Scott no Departamento de Operações e Sinais de Operações de Planta da Universidade de Michigan para ajudar no projeto e montagem do dispositivo de iluminação de cigarros.