השוואת ההשפעות של אדי סיגריה אלקטרונית עשן סיגריה ברומן

פרוטוקול זה מתאר שיטה לחשוף מכרסמים אדי סיגריה אלקטרונית (E-אדי) ועשן סיגריות. תאי החשיפה בנויים על ידי שינוי תאי הרדמה עם מערכת שאיבה אוטומטית המספקת עשן אדים או עשן סיגריות למכרסמים. מערכת זו יכולה בקלות להיות שונה כדי להתאים רבים endpoints ניסיוני.

סיגריות אלקטרוניות (E- סיגריות ) נמצאים בשימוש נרחב, גדל בפופולריות. ההערכה היא כי יותר מ 9 מיליון מבוגרים להשתמש בהם באופן קבוע. ההשפעות הבריאותיות השליליות האפשריות של חשיפת סיגריות אלקטרונית (E-Vapor) אינן מוגדרות כראוי. בעוד כמה מודלים של בעלי חיים של חשיפה E- vapor פותחו, מודלים מעטים לחשוף מכרסמים קליני רלוונטי כמויות של ניקוטין ולעשות השוואות ישירות עשן סיגריה בתוך אותה מערכת החשיפה. כאן, אנו מציגים שיטה לבנייה ותפעול של תא E- vapor ותא עישון סיגריות. החדרים בנויים על ידי התאמת תאי הרדמה עם מערכת שאיבה מבוקרת מחשב המספקת כמויות עקביות של Eחשיפה של ניקוטין נמדדת באופן עקיף על ידי כימות רמות קוטינין לפני ואחרי החשיפה, וניתן לשנות את מערכת החשיפה כך שתתאים לסוגים שונים של סיגריות אלקטרוניות וסיגריות טבק, והיא יכולה. לשמש כדי להשוות את ההשפעות של E- אדי עשן סיגריה in vivo .

מאז כניסתם לשוק האמריקאי ב -2004, הסיגריות האלקטרוניות (E-cigarettes) התרחבו לתעשייה של מיליארד דולר. ההערכה היא שכמעט 9 מיליון מבוגרים משתמשים בהם באופן קבוע. בשנת 2014 ו 2015, יותר תלמידי תיכון השתמשו סיגריות E מאשר סיגריות קונבנציונאלי ² . מספר גדל והולך של משתמשים E- סיגריות הוליד מאמץ מחקר כדי להעריך את ההשפעות הבריאותיות הפוטנציאליות שלהם.

E- סיגריות ליצור אדי (המכונה "אדי" E-Steam ") על ידי חימום פתרון צמיג כי בדרך כלל מכיל תערובת של מים, פוליאתילן גליקול או ירקות גליצרין, ניקוטין, טעמים ^{3 , 4} . הוכח כי E- אדי מכיל כמה תרכובות מזיקות כולל ריאקטיבי חמצן המינים (ROS), ניקוטין, אלדהידים שונים, ופחמימנים ארומטיים polycyclic ^{5 ,}6. רבים של תרכובות אלה נוצרים במהלך תהליך אידוי של נוזל E לפני שאיפה ⁷ . יש לציין, כמה תרכובות מזיקות אלה נמצאים גם עשן סיגריות, מה שמעלה חשש כי E- סיגריות להשתמש עלולה להיות השלכות בריאותיות דומות ⁷ .

יש מעט הסכמה על ההשפעות הבריאותיות של סיגריות אלקטרוניות. כדי לענות על זה, כמה מודלים של בעלי חיים של חשיפת E- אדים פותחו ( טבלה 1 ). מודלים אלה מעסיקים מגוון של שיטות כגון חשיפה של כל הגוף E- אדי ואוורור מכני. בעוד המודלים הנוכחיים סיפקו מידע תובנה, מעטים עושים השוואות ישירות לעשן סיגריות בתוך אותה מערכת חשיפה ( טבלה 1 ). בנוסף, בעוד מספר מחקרים בבני אדם הראו כי משתמשים בסיגריות אלקטרוניות ומעשני סיגריות יש רמות קוטינין בסרום בין 30-200 ng / mL, מודלים רבים של חשיפת אדי וחשיפה לסיגריות עשןאידיאל זה טווח ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12} .

כאן אנו מציגים שיטה להשוואת ההשפעות של עשן סיגריות וחשיפה לאדים קיטור ב- vivo , המניבים רמות קוטינין בדם בדומה למחקרים אנושיים.

הפרוטוקול הבא בוצע תחת הדרכה ואישור של אוניברסיטת מישיגן טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC).

1. אלקטרונית סיגריות אדי קימברלי האסיפה

הערה: החדר המלא צריך להיות ממוקם במכסה המנוע במהלך השימוש. החדר כאן היה שוכן בטמפרטורה מבוקרת ומסוננת סביבת המעבדה. החוקרים יכולים לבחור לעקוב אחר היבטים אלה של המערכת כדי להבטיח עקביות של איכות האוויר בחדר. כאופציה, כיסוי צגים עם כלוב מתכת יכול למנוע מכרסמים טמפררינג תוך ומאפשר צגים לדגום את הסביבה קאמרית פנים.

1. לרכוש תא הרדמה עם מכסה אוויר חזק נשלף עם נפח של 20 L.
2. באמצעות ראה לנעול מצויד להב מתאים חיתוך החומר, לחתוך חור בקוטר 10.2 ס"מ במכסה של החדר כ 7.6 ס"מ מן הקצה האחורי שלתָא.
3. הכנס את אוורור מתכוונן לתוך החור ואת הר למקומו עם כל דבק caulk.
   הערה: ודא כי caulk דבק אינו נגיש המכרסמים בחדר, כפי שהם עשויים ללעוס את caulk. כדי למנוע בעיה זו אפשרית, להחיל את caulk אל מחוץ לקיר החדר כדי לטעון את האוורור.
4. חותכים צינורות סיליקון לשני חלקים 15 ס"מ, וצרף הקצוות משני הצדדים של מחבר T.
   הערה: צינורות סיליקון יש פוטנציאל להגיב עם כמה מרכיבים של אדי או עשן סיגריה. לפיכך, החוקרים עשויים לשקול שימוש שאינו מגיב צינורות.
5. פתיל הן של צינורות סיליקון דרך חורים מראש ליד הקדמי של המכסה הקאמרי כך מחבר T הוא בתוך החדר. ודא כי הצינור הוא מאובטח על המכסה עם קולק או דבק או סרט חשמלי.
6. חבר את הקצוות החופשיים של צינורות הסיליקון לקצות המוצא של שתי משאבות אוויר זעירות. משאבות צריך להיות מותקן על המכסה של החדר עם פעמיים,צדדית או קלטת.
   הערה: אורך הצינור המחובר לקצה המוצא של המשאבה צריך להיות קצר כדי להגביל את כמות אדי הקיטור על המשטח הפנימי של הצינור במהלך השימוש.
7. עם צינור סיליקון חדש, לצרף קצה אחד בצד קלט של אחד המשאבות אוויר (משאבה א ' באיור 1 ), לחתוך את הצינור הזה כ 4 ס"מ אורך. זה המקום שבו סיגריה אלקטרונית יוכנס במהלך השימוש קאמרית. ודא כי הקוטר של הצינור מאפשר התאמה קלה סביב סוף e-cig.
8. עם צינור סיליקון חדש, לצרף קצה אחד בצד קלט של משאבת אוויר אחרים (משאבה B באיור 1 ). משאבה זו תציג את האוויר בחדר לתוך החדר. לפיכך, קצה הצינור חייב להיות ממוקם מחוץ למכסה המנוע. אורך צינור זה אינו קריטי, אבל צריך להיות קצר ככל האפשר כדי להגביל את התנגדות זרימת האוויר.
9. בתוך החדר לצרף שני ווים קטנים עם דבק דו צדדי להחזיק oxygחד חמצני חד חמצני.

איור 1. סכמטי של אלקטרונית סיגריות אדי קיטור.
לשכת שוכנת ברדס קטר (לא מוצג). אוויר משאבת אוויר (משאבה B) מציג אוויר החדר מחוץ מכסה המנוע קטר לתוך החדר ברציפות ב 2 L / min. משאבת E-cig (משאבת A) נשיפה 133 מ"ל של E- אדי מעל 4 s, עם מרווח של 30 שניות מנוחה. E- אדי החדר תערובת האוויר לפני להיות נשאב לתוך החדר. צגים גז ברציפות למדוד פחמן חד חמצני (CO) וחמצן (O ₂ ) ריכוזים בתוך החדר. E- אדי הוא מותש פסיבי דרך פתח לתוך מכסה המנוע קטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

2. סיגריה עשן תא חדר

הערה: כמעט כל מותג oסיגריה F יכול לשמש עם מערכת זו, אולם מחקר סטנדרטי סיגריות כגון אוניברסיטת קנטאקי 1R6F מחקר סיגריה הם חסכוניים, אמין, ואת הטוב ביותר עבור יישום זה.

1. בצע את השלבים 1.1 - 1.6, & שלב 1.9.
2. עם צינור סיליקון חדש, לצרף קצה אחד אל מכשיר התאורה סיגריה, ואת הקצה השני בצד קלט של משאבת אוויר (משאבה A באיור 2 ). את מכשיר התאורה של הסיגריה יש למקם בתוך מכסה המנוע קטר מחוץ לתא במהלך השימוש.
   הערה: בניית מתקן התאורה של סיגריות דורשת ידע של ייצור מתכת והנדסת חשמל. בעוד מדריך שלב אחר שלב לא ינתן כאן, לראות חומרים משלימים עבור תוכניות.
3. עם צינור סיליקון חדש, לצרף קצה אחד למשאבת אוויר אחרים (משאבת B באיור 2 ). משאבה זו תציג את האוויר בחדר לתוך החדר, ולכן את קצה הצינור חייב להיות ממוקם מחוץ למכסה המנוע קטר. >
4. חותכים כמה 5 מ"מ חריצים אנכיים רחב בקיר הקדמי של החדר, ואת הר אוהד המחשב בצד החיצוני של החדר כך שהוא מכסה את הפתח. ודא כי החלק הקדמי של המאוורר הוא פונה לכיוון החדר כגון מאוורר יפוצץ את האוויר לתוך החדר דרך פתח זה.

איור 2. סכמטי של עשן סיגריה לשכת.
אוויר משאבת אוויר (משאבה B) מציג אוויר החדר מחוץ מכסה המנוע קטר לתוך החדר ברציפות ב 2 L / min. משאבת שואבת על סיגריה מואר עבור 40 S עם שיעור של 2 L / min, ו 20 שניות מאוחר יותר מאוורר המחשב מפנה את החדר מעל 3 דקות. עשן החדר תערובת האוויר לפני להיות נשאב לתוך החדר. צגים גז ברציפות למדוד פחמן חד חמצני (CO) וחמצן (O ₂ ) ריכוזים קאמרית. עשן הוא מותש דרך פתח לתוך ברדס קטר."אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

3. מיקרו בקר הרכבה ותוכנה

1. בקרת מערכת שאיבה של תא אדים סיגריה בתא עשן סיגריה על ידי microcontrollers נפרד. הורד את תוכנת המיקרו-בקר והעלה את קודי ההפעלה שסופקו בחומרים המשולבים S. קוד סיגריה אלקטרונית יפעיל את משאבת אוויר החדר ברציפות ולהפעיל את משאבת דואר סיגריה למשך 4 משך כל 30 שניות. קוד עשן הסיגריות יפעיל את משאבת האוויר בחדר ברציפות, יפעיל את משאבת הסיגריות למשך 40 שניות, והפעיל את מאוורר המחשב 20 שניות לאחר הפסקת משאבת הסיגריות. המאוורר ייסגר לאחר ריצה במשך 3 דקות.
   הערה: ניתן לכוונן את עיתוי המשאבה והמאוורר בהתאם לצורך. הפניה ליצרן הוראות כיצד להעלות קודים רלוונטיים למיקרו בקר.
2. להרכבהLe microcontroller, לחבר חוטי zip, דיודות, resisters, ו קבלים ללוח לחם כפי שמתואר באיור 3 ו לצרף חוטי תנין קליפ אל משאבות האוויר המקביל (ו מאוורר המחשב לתא עישון סיגריה). הקם את המיקרונטרולר מחוץ למכסה המנוע אם אפשר.

איור 3. סכמטי של מיקרו.
סכמטי למיקרו בקר ולוח לחם להפעלת תזמון משאבות אויר ומאווררים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

4. בעלי חיים

1. השתמש חולדות מבוגר במשקל 450 - 520 גרם.
2. חולדות הקבוצה לפי סוג החשיפה ( למשל , סיגריה אלקטרונית, עשן סיגריות, אוויר החדר נשאב לתא).
3. בשלב זה יחסי ציבורIor לחשיפה, לאסוף 500 μL של דם צינורות EDTA מצופה מווריד הזנב באמצעות מזרק למדוד ריכוז קוטינין בסרום הבסיס.
4. ספין למטה דגימות דם ב XG 20,000 למשך 30 דקות ב 4 ˚C ולאסוף בסרום. ודא כי דגימות הם צוננים על הקרח לאורך כל התהליך הזה.
5. בעקבות פרוטוקול היצרן, assay עבור cotinine בדגימות בסרום שנאסף. דוגמאות ניתן לאחסן גם ב -80 ˚C לשימוש מאוחר יותר.

5. הפעלת לשכת הסיגריות האלקטרונית

1. נקו את הפנימי של החדר עם אתנול 70%, ולאחר מכן עם מים deionized, ולתת אוויר יבש עד החדר יבש לחלוטין (או כ 30 דקות).
2. כייל גז צגים ו הר צג כולו על הקיר בתוך החדר.
3. המקום חולדות בתוך החדר. שים לב כי עד שלושה בעלי חיים יכול להיות חשוף בו זמנית.
4. ודא E- סיגריה טעונה במלואה עם E- נוזלי הולם להכניס את סיגריה אלקטרונית לתוך צינור קלט. זה קריטי כדי להבטיח כי E- סיגריה סוללה E- נוזלי רמות נאותים לאורך כל משך 90 דקות חשיפה.
5. הפעל את משאבות האוויר והפעל את הטיימר.
6. במהלך החשיפה להתבונן הגז מפקחת כדי להבטיח החדר מכיל> 20% O ₂ ו 0 עמודים לדקה CO.
   הערה: אם רמות החמצן נופלות, החדר עלול שלא להיות מאוורר היטב או שלא ניתן לכוונן את צג החמצן כראוי.
7. לאחר זמן החשיפה הגיע 90 דקות, להסיר את הסיגריה E ולהמשיך להפעיל את משאבות הגז כדי לפרוק את שארית הנותרים. בנוסף, החלק העליון של החדר ניתן להרים כדי לזרז אוורור.
8. לאחר אדי יש לנקות, להסיר את החולדות לנקות את החדר.
9. איסוף 500 דם μL מווריד הזנב מכל חולדה כ 1 שעות לאחר החשיפה בסיום פרוטוקול הניסוי.
10. בצע את השלבים 4.4 - 4.5 כדי לבודד סרום assay עבור cotinine.

"Jove_title"> 6. הפעלת לשכת סיגריות הטבק

1. בצע את השלבים 5.1 - 5.3.
2. הכנס סיגריה לתוך מכשיר התאורה סיגריה, עם סוף הסיגריה נגד אלמנטים חימום.
3. להדליק את מכשיר התאורה סיגריה עד התחת סיגריה מתחיל smolder (כ 5 s).
4. לאחר סיגריה מואר, להפעיל את מערכת השאיבה, להפעיל את הטיימר, ולצפות סיגריה לשרוף עד סיום (כ 40).
5. ברגע שהסיגריה נשרפה, הוצא בזהירות את הסיגריה השקועה ממכשיר המצת.
6. ודא כי רמות CO לא לעלות מעל 1000 ppm ו O ₂ רמות לא נופלים מתחת 20%. תזמון ומאוורר המחשב הוא קריטי במניעת הצטברות חד תחמוצת הפחמן.
7. לאחר 4 דקות להפעיל את מערכת שאיבה את ולחזור לשלב 6.2 עד חולדות חשופים לעשן טבק במשך 90 דקות (או כ 23 סיגריות).
   הערה: פחמן חד חמצני רמות 4 דקות לאחר סיגריה BurNing צריך ליפול מתחת 400 ppm, אחרת פחמן חד חמצני עלול להתחיל להצטבר בחדר.
8. כאשר החשיפה הושלמה, המשך להשאיר את מערכת השאיבה על מנת לאוורר עשן שיורי. כאשר חד תחמוצת הפחמן נופל מתחת 100 עמודים לדקה להסיר חולדות מן החדר. זה צריך לקחת 5 - 10 דקות.
9. הסר חולדות לנקות את החדר.
10. איסוף 500 דם μL מווריד הזנב כ 1 שעות לאחר החשיפה בסיום פרוטוקול הניסוי כמו עם סיגריות E.
11. בצע את השלבים 4.4 - 4.5 כדי לבודד סרום assay עבור cotinine.

פחמן חד חמצני ניטור חמצן

ריכוזי החמצן לא נפלו מתחת ל -20% במהלך החשיפה לאדים אלקטרוניים וריכוזי CO נותרו בלתי ניתנים לזיהוי במהלך החשיפה. צגי גז במהלך החשיפה לעישון סיגריות הראו כי ריכוז החמצן נשאר מעל 20%. ריכוזי פחמן חד חמצני לא עלה על 1,000 ppm ( איור 4 ).

איור 4: פחמן חד חמצני ריכוזי עשן סיגריה לשכת. ריכוז חד תחמוצת הפחמן נרשמה כל 30 שניות במהלך הצגת עשן סיגריות 1R6F. התוצאות המוצגות הן ממוצעים מ -3 מחזורי 4 דקות רצופים. ריכוז חד תחמוצת הפחמן לא עלה על 1000 ppm. הסיגריה נשרפת עד להשלמת מעל 40, והמאוורר מופעל20 שניות מאוחר יותר ( כלומר, מאוורר מופעל 1 דקות לאחר הצתה סיגריה).

סרום קרום

החשיפה הטרום-סרום ו-1 שעות עבור קבוצת ה- E-n אדי (n = 3) הייתה 4.2 ± 0.4 ng / mL ו- 171.6 ± 20.5 ng / mL, בהתאמה. טרום החשיפה ו 1 h postexposure סרום cotinine עבור קבוצת עשן סיגריות (n = 3) היה 3.9 ± 0.3 ng / mL ו 98.8 ± 2.1 ng / mL, בהתאמה ( איור 5 ).

איור 5: רמות קוטינין בסרום בעקבות סיגריה עשן או סיגריה אלקטרונית חשיפה אדי. סרום cotinine נמדד לפני תחילת פרוטוקול, ו 1 שעות לאחר הפגישה 90 דקות חשיפה. חשיפה מוקדמת ו- 1 שעות לאחר החשיפה של קוטינין בקבוצות אדים, היה 4.2 ± 0.4 ng / mLNd 171.6 ± 20.5 ng / mL, בהתאמה. חשיפה מוקדמת ו-1 שעות של קוטינין לחולי סיגריות היו 3.9 ± 0.3 ng / mL ו- 98.8 ± 2.1 ng / mL, בהתאמה. ההבדלים בין ריכוזי הקוטינין בסרום לפני ואחרי היו מובהקים סטטיסטית. * P <0.05.

איור 6: אלקטרונית סיגריות אדי לשכת סיגריה עשן קאמרית. תמונה של אדי סיגריה אלקטרונית (מימין) ואת החדר עשן סיגריה (משמאל) בתוך מכסה המנוע קטר. תיבות אדומות מכילות מיקרו-בקרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלה 1: מאפייני מודלים של חשיפה לסיגריות אלקטרוניות.

כאן אנו מתארים שיטה לבניית תאים לחשוף מכרסמים E- אדי עשן סיגריה באופן מבוקר ( איור 6 ). בניית תא הסיגריות היא פשוטה יחסית וזולה בהשוואה למערכות חשיפה מסחריות ^{14 , 15 , 16} . חלקים וכלים הדרושים כדי לבנות את החדר זמינים בקלות על ידי ספקים מסחריים באינטרנט. באופן דומה, בניית תא עשן הסיגריות היא פשוטה יחסית, למעט התקן התאורה לסיגריות אשר חייב להיות מפוברק (ראה חומרים משלימים עבור תוכניות).

לאחר התאים נבנים, צעד קריטי של מערכת החשיפה הוא כיול החדרים לחשוף את המכרסמים לכמות הניקוטין הרצוי. בשני החדרים E- סיגריה בתא סיגריה, התאמת כמות החשיפה הכוללת tIme היא אולי השיטה הקלה ביותר להגדיל או להקטין את כמות החשיפה לניקוטין. הגדלת זמן הנפץ במערכת החשיפה לסיגריות אלקטרוניות עלולה להגביר את מינון הניקוטין, אך עם זאת, הציור של סיגריה אלקטרונית לאורך זמן ארוך הוכח כגורם להגדלת רמות ה- ROS, אלדהידים ותרכובות מסוכנות אחרות, או לא משקפים את הרגלים אופייניים של משתמש סיגריה E ⁵ . ניתן לשנות את משך הנשיפה ואת זמן החשיפה הכולל על ידי שינוי הקוד המועלה למיקרו בקר. כמו כן, יש לציין כי ריכוז הניקוטין בסיגריות E, כמו גם את המתח של אלמנט סיגריה חימום, יכול להשתנות באופן משמעותי יש לקחת בחשבון בעת ​​כיול המערכת.

אחד היתרונות הגדולים ביותר של מערכת חשיפה זו הוא הרבגוניות שלה. כמעט כל סוג של e-cig או e-cig פתרון ניתן להשתמש עם מערכת זו. זוהי תכונה שימושית במיוחדTure בהתחשב בכך E- השוק סיגריה עכשיו כולל מעל 400 מותגים ואלפי פתרונות E-cigarette ¹³ . בנוסף, מערכת החשיפה תואמת מספר רב של נקודות קצה ניסיוניות המאפשרות השפעות של סיגריה אלקטרונית על מערכות שונות של איברים ותהליכי מחלה. כמו כן, אנו מכירים בכך כי קיימות מספר מגבלות לפרדיגמת חשיפה זו, כגון השיטה בה החיות חשופות לאדים. E- משתמשים סיגריה ישירות שואפים E- אדי תוך פרדיגמה זו מכרסמים שואפים E- אדי פסיבי. בנוסף, המכרסמים עשויים לקלוט תרכובות בתוך אדי או עשן על ידי נתיבים אחרים ( כלומר , ספיגת עורי ישיר, בליעה תוך הטבה). עם זאת, אנו סבורים כי היתרונות של מערכת החשיפה עולים בהרבה על המגבלות.

בסך הכל, פרדיגמה זו חשיפה מספקת עקבית קלינית רלוונטיות E- אדי וחשמל עשן סיגריה, ועשוי לעזורסיוע במאמץ המחקר בקביעת ההשפעות הבריאותיות השליליות של סיגריה אלקטרונית ועשן סיגריות.

למחברים אין מה לחשוף.

מחקר זה התאפשר על ידי מענק מחקר אבי העורקים (אוניברסיטת מישיגן) לד"ר אליסון. המחברים היו גם רוצים להודות ניק סקוט באוניברסיטת מישיגן הצמח פעולות הירשם וגרפיקה המחלקה לסיוע בתכנון והרכבה של המכשיר תאורה סיגריה.