Comparación de los efectos del vapor de cigarrillo electrónico y el humo del cigarrillo en una novela

Este protocolo describe un método para exponer roedores al vapor de cigarrillo electrónico (vapor E) y al humo del cigarrillo. Las cámaras de exposición se construyen modificando las cámaras de anestesia con un sistema de bombeo automatizado que suministra vapor E o humo de cigarrillo a los roedores. Este sistema se puede modificar fácilmente para acomodar muchos puntos finales experimentales.

Los cigarrillos electrónicos ( cigarrillos electrónicos ) están siendo ampliamente utilizados , y están creciendo en popularidad. Se estima que más de 9 millones de adultos los usan regularmente. Los efectos adversos potenciales para la salud de la exposición al vapor electrónico de cigarrillos (vapor E) están mal definidos. Aunque se han desarrollado varios modelos animales de exposición al vapor de E , pocos modelos exponen a los roedores a cantidades clínicamente relevantes de nicotina y realizan comparaciones directas con el humo del cigarrillo dentro del mismo sistema de exposición. Aquí, se presenta un método para construir y operar una cámara de vapor y una cámara de humo de cigarrillo. Las cámaras se construyen equipando cámaras de anestesia con un sistema de bombeo controlado por computadora que proporciona cantidades consistentes de ELa exposición a la nicotina se mide indirectamente mediante la cuantificación de los niveles de cotinina en suero antes y después de la exposición Este sistema de exposición puede modificarse para adaptarse a diversos tipos de cigarrillos E y cigarrillos de tabaco y puede Para comparar los efectos de vapor de E y humo de cigarrillo in vivo .

Desde su entrada en el mercado estadounidense en 2004, los cigarrillos electrónicos (cigarrillos electrónicos) se han expandido a una industria de mil millones de dólares, y se estima que casi 9 millones de adultos los usan regularmente ¹ . En 2014 y 2015, más estudiantes de secundaria habían usado cigarrillos electrónicos que los cigarrillos convencionales ² . El creciente número de usuarios de cigarrillos electrónicos ha generado un esfuerzo de investigación para evaluar sus posibles efectos adversos para la salud.

Los cigarrillos electrónicos generan un vapor (denominado "vapor E") calentando una solución viscosa que contiene típicamente una mezcla de agua, polietilenglicol o glicerina vegetal, nicotina y aromas ^{3 , 4} . Se ha demostrado que el vapor E contiene varios compuestos nocivos, incluyendo especies de oxígeno reactivo (ROS), nicotina, varios aldehídos e hidrocarburos aromáticos policíclicos ^{5 ,}6. Muchos de estos compuestos se forman durante el proceso de vaporización de E-líquido antes de la inhalación ⁷ . Cabe destacar que varios de estos compuestos dañinos también están presentes en el humo del cigarrillo, lo que plantea preocupación de que el uso de cigarrillos electrónicos puede tener consecuencias similares adversas para la salud ⁷ .

Hay poco consenso sobre los efectos en la salud de los cigarrillos electrónicos. Para abordar esto, se han desarrollado varios modelos animales de exposición al vapor E ( Tabla 1 ). Estos modelos emplean una variedad de métodos tales como exposición de vapor de E-cuerpo entero y ventilación mecánica. Aunque los modelos actuales han proporcionado datos perspicaces, pocos hacen comparaciones directas con el humo del cigarrillo dentro del mismo sistema de exposición ( Tabla 1 ). Además, aunque varios estudios en humanos han demostrado que los usuarios de cigarrillos electrónicos y los fumadores de cigarrillos tienen niveles de cotinina sérica entre 30-200 ng / mL, muchos modelos de exposición al humo de tabaco y vapor de EIde este rango ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12} .

Aquí presentamos un método para comparar los efectos del humo del cigarrillo y la exposición al vapor E in vivo que produce niveles de cotinina sérica similares a los estudios en seres humanos.

El siguiente protocolo se ha llevado a cabo bajo la guía y aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Michigan (IACUC).

1. Asamblea electrónica de la cámara del vapor del cigarrillo

NOTA: La cámara completa debe colocarse en una campana extractora durante el uso. La cámara aquí fue alojada en un ambiente de laboratorio controlado y filtrado de temperatura. Los investigadores pueden elegir controlar estos aspectos del sistema para asegurar la consistencia de la calidad del aire ambiente. Como opción, cubrir los monitores con una jaula de metal puede evitar la manipulación de roedores, mientras que permite a los monitores a la muestra del ambiente interior de la cámara.

1. Adquirir una cámara de anestesia con tapa desmontable hermética con volumen de 20 L.
2. Utilizando una sierra de calar equipada con una cuchilla apropiada para cortar el material, corte un orificio de 10,2 cm de diámetro en la tapa de la cámara a aproximadamente 7,6 cm del borde posterior delcámara.
3. Inserte el respiradero ajustable en el agujero y monte en su lugar con cualquier adhesivo de calafate.
   NOTA: Asegúrese de que el calafateo adhesivo no sea accesible para los roedores en la cámara, ya que pueden masticar el calafate. Para evitar este posible problema, aplique el calafateo al exterior de la pared de la cámara para montar el respiradero.
4. Corte la tubería de silicona en dos segmentos de 15 cm y fije los extremos a cada lado de un conector en T.
   NOTA: Los tubos de silicona tienen el potencial de reaccionar con algunos componentes del vapor electrónico o del humo del cigarrillo. Por lo tanto, los investigadores pueden considerar el uso de tubos no reactivos.
5. Enrosque ambos tubos de silicona a través de los orificios prefabricados cerca de la parte frontal de la tapa de la cámara para que el conector en T esté dentro de la cámara. Asegúrese de que el tubo esté asegurado a la tapa con calafateo adhesivo o cinta aislante.
6. Conecte los extremos libres de la tubería de silicona a los extremos de salida de dos micro bombas de aire. Las bombas se deben montar en la tapa de la cámara con doble-Cinta adhesiva de un lado o calafatear.
   NOTA: La longitud de la tubería conectada al extremo de salida de la bomba debe ser corta para limitar la cantidad de recogida de vapor en la superficie interior de la tubería durante el uso.
7. Con un tubo de silicona nuevo, conecte un extremo al lado de entrada de una de las bombas de aire (bomba A en la figura 1 ) y corte este tubo a aproximadamente 4 cm de longitud. Aquí es donde el cigarrillo electrónico se insertará durante el uso de la cámara. Asegúrese de que el diámetro del tubo permite un ajuste apretado alrededor del extremo del e-cig.
8. Con un tubo de silicona nuevo, conecte un extremo al lado de entrada de la otra bomba de aire (bomba B en la figura 1 ). Esta bomba introducirá aire ambiente en la cámara. Como tal, el extremo del tubo debe colocarse fuera de la campana. La longitud de este tubo no es crítica, pero debe ser lo más corta posible para limitar la resistencia al flujo de aire.
9. Dentro de la cámara de fijar dos pequeños ganchos con adhesivo de doble cara para mantener el oxígenoEn monóxido de carbono monóxido de carbono.

Figura 1. Esquema de la cámara electrónica de vapor de cigarrillos.
La cámara se aloja en campana extractora (no mostrada). La bomba de aire de la habitación (Bomba B) introduce el aire ambiente desde fuera de la campana en la cámara continuamente a 2 l / min. La bomba E-cig (bomba A) bombea 133 ml de vapor E durante 4 s, con un intervalo de reposo de 30 s. El vapor E y la mezcla de aire ambiente antes de ser bombeados a la cámara. Los monitores de gas miden continuamente las concentraciones de monóxido de carbono (CO) y oxígeno (O ₂ ) dentro de la cámara. El vapor E se agota pasivamente a través de la ventilación en la campana extractora. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Ensamblaje de cámara de humo de cigarrillos

NOTA: Virtualmente cualquier marca oF cigarrillo se puede utilizar con este sistema, sin embargo los cigarrillos de investigación estandarizados como el Cigarrillo de Investigación de la Universidad de Kentucky 1R6F son rentables, confiables y lo mejor para esta aplicación.

1. Siga los pasos 1.1 - 1.6 y el paso 1.9.
2. Con un tubo de silicona nuevo, conecte un extremo al dispositivo de iluminación del cigarrillo y el otro extremo al lado de entrada de la bomba de aire (bomba A en la figura 2 ). El dispositivo de iluminación del cigarrillo debe colocarse dentro de la campana extractora y fuera de la cámara durante el uso.
   Nota: La construcción del dispositivo de iluminación del cigarrillo requiere el conocimiento de la fabricación del metal y de la ingeniería eléctrica. Mientras que una guía paso a paso para la construcción no se dará aquí, vea los materiales suplementarios para los planes.
3. Con un tubo de silicona nuevo, conecte un extremo a la otra bomba de aire (bomba B en la figura 2 ). Esta bomba introducirá aire ambiente en la cámara, por lo que el extremo del tubo debe colocarse fuera de la campana. >
4. Cortar varias hendiduras verticales de 5 mm de ancho en la pared frontal de la cámara, y montar un ventilador de la computadora en el exterior de la cámara para que cubra esta abertura. Asegúrese de que la parte delantera del ventilador esté orientada hacia la cámara de tal manera que el ventilador soplará aire en la cámara a través de esta abertura.

Figura 2. Esquema de la cámara de humo de cigarrillos.
La bomba de aire de la habitación (Bomba B) introduce el aire ambiente desde fuera de la campana en la cámara continuamente a 2 l / min. La bomba A se enciende con un cigarrillo encendido durante 40 s con una velocidad de 2 l / min, y 20 s después el ventilador de la computadora evacua la cámara durante 3 min. El humo y el aire ambiente se mezclan antes de ser bombeados a la cámara. Los monitores de gas miden continuamente las concentraciones de la cámara de monóxido de carbono (CO) y oxígeno (O ₂ ). El humo se agota a través de la ventilación en la campana extractora.Ftp_upload / 55672 / 55672fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Montaje y software del microcontrolador

1. Controlar el sistema de bombeo de la cámara de vapor de cigarrillo electrónico y la cámara de humo de cigarrillo por microcontroladores separados. Descargue el software del microcontrolador y cargue los códigos operativos proporcionados en los Materiales complementarios . El código electrónico del vapor del cigarrillo funcionará la bomba de aire de la habitación continuamente y activará la bomba del E-cigarrillo para una duración de 4 s cada 30 s. El código de humo del cigarrillo hará funcionar la bomba de aire de la habitación continuamente, activará la bomba de cigarrillos durante 40 s, y activará el ventilador del ordenador 20 s después de que la bomba de cigarrillos se haya detenido. El ventilador se apagará después de funcionar durante 3 min.
   Nota: La sincronización de las bombas y del ventilador se puede ajustar según sea necesario. Haga referencia a las instrucciones del fabricante sobre cómo cargar los códigos pertinentes al microcontrolador.
2. EnsamblarEl microcontrolador, conecte los alambres de la cremallera, los diodos, los resistentes, y los condensadores al tablero de pan como se representa en la figura 3 y ate los alambres del clip del cocodrilo a las bombas de aire correspondientes (y ventilador del ordenador para la cámara de humo del cigarrillo). Coloque el microcontrolador fuera de la campana si es posible.

Figura 3. Esquema del microcontrolador.
Esquema del microcontrolador y de la tabla de pan para funcionar el sincronismo de las bombas de aire y del ventilador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Animales

1. Utilizar ratas adultas de 450 - 520 g.
2. Ratas de grupo según el tipo de exposición ( por ejemplo , cigarrillo electrónico, humo de cigarrillo, aire ambiente bombeado a la cámara).
3. En este momento prAntes de la exposición, recoja 500 μl de sangre en tubos recubiertos con EDTA de la vena de la cola usando una jeringa para medir la concentración basal de cotinina sérica.
4. Retirar las muestras de sangre a 20.000 xg durante 30 minutos a 4 ˚C y recoger el suero. Asegúrese de que las muestras se enfrían en hielo durante todo este proceso.
5. Siguiendo el protocolo del fabricante, se analizó la cotinina en las muestras de suero. Las muestras también se pueden almacenar a -80 ˚C para su uso posterior.

5. Funcionamiento de la cámara de cigarrillos electrónicos

1. Limpie el interior de la cámara con etanol al 70%, luego con agua desionizada y deje secar al aire hasta que la cámara esté completamente seca (o aproximadamente 30 minutos).
2. Calibre los monitores de gas y monte todo el monitor en la pared dentro de la cámara.
3. Coloque las ratas dentro de la cámara. Tenga en cuenta que hasta tres animales pueden ser expuestos simultáneamente.
4. Asegúrese de que el E-cigarrillo está completamente cargado con E-líquido adecuado e inserte el E-cigarrilloEn el tubo de entrada. Es fundamental asegurarse de que los niveles de la batería E-cigarette y E-líquido son adecuados durante toda la duración de la exposición de 90 minutos.
5. Encienda las bombas de aire e inicie el temporizador.
6. Durante la exposición, observe los monitores de gas para asegurar que la cámara contenga> 20% de O ₂ y 0 ppm de CO.
   Nota: Si los niveles de oxígeno disminuyen, es posible que la cámara no esté bien ventilada o que el monitor de oxígeno no esté adecuadamente calibrado.
7. Una vez que el tiempo de exposición ha llegado a 90 minutos, retire el cigarrillo electrónico y continúe funcionando las bombas de gas para ventilar el vapor restante. Además, la parte superior de la cámara se puede levantar para acelerar la ventilación.
8. Una vez que el vapor se ha despejado, eliminar las ratas y limpiar la cámara.
9. Recoger 500 μL de sangre de la vena de la cola de cada rata aproximadamente 1 h después de la exposición al final del protocolo experimental.
10. Siga los pasos 4.4 - 4.5 para aislar el suero y determinar la cotinina.

6. Funcionamiento de la Cámara de Tabaco del Tabaco

1. Siga los pasos 5.1 - 5.3.
2. Inserte el cigarrillo en el dispositivo de iluminación del cigarrillo, con el extremo del cigarrillo contra los elementos calefactores.
3. Encienda el dispositivo de encendido del cigarrillo hasta que el punto de cigarrillo empiece a arder (aproximadamente 5 s).
4. Una vez que el cigarrillo está encendido, encienda el sistema de bombeo, inicie el temporizador y observe la quemadura del cigarrillo hasta completarse (unos 40 s).
5. Una vez que el cigarrillo se ha quemado, retire cuidadosamente el cigarrillo gastado del dispositivo de iluminación del cigarrillo con fórceps.
6. Asegúrese de que los niveles de CO no suban por encima de 1000 ppm y los niveles de O ₂ no caigan por debajo del 20%. La sincronización y duración del ventilador de la computadora es crítica para prevenir la acumulación de monóxido de carbono.
7. Después de 4 min, apague el sistema de bombeo y vuelva al paso 6.2 hasta que las ratas queden expuestas al humo del tabaco durante 90 minutos (o aproximadamente 23 cigarrillos).
   NOTA: Los niveles de monóxido de carbono 4 minNinguno debería caer por debajo de 400 ppm, de lo contrario el monóxido de carbono puede comenzar a acumularse en la cámara.
8. Cuando la exposición esté completa, continúe dejando el sistema de bombeo encendido para ventilar el humo residual. Cuando el monóxido de carbono cae por debajo de 100 ppm, retire las ratas de la cámara. Esto debe tomar 5 - 10 min.
9. Quitar las ratas y limpiar la cámara.
10. Recoger 500 μL de sangre de la vena de la cola aproximadamente 1 h después de la exposición al final del protocolo experimental como con los E-cigarrillos.
11. Siga los pasos 4.4 - 4.5 para aislar el suero y determinar la cotinina.

Monitorización de monóxido de carbono y oxígeno

Las concentraciones de oxígeno no bajaron por debajo del 20% durante la exposición al vapor electrónico y las concentraciones de CO permanecieron indetectables durante toda la exposición. Los monitores de gas durante la exposición al humo del cigarrillo indicaron que la concentración de oxígeno se mantuvo por encima del 20%. Las concentraciones de monóxido de carbono no superaron las 1000 ppm ( Figura 4 ).

Figura 4: Concentraciones de monóxido de carbono en la cámara de humo de cigarrillos. Se registró la concentración de monóxido de carbono cada 30 s durante el transcurso de la introducción del humo de cigarrillos 1R6F. Los resultados mostrados son promedios de 3 ciclos consecutivos de 4 min. Las concentraciones de monóxido de carbono no superaron las 1.000 ppm. El cigarrillo se quema hasta completar 40 s, y el ventilador se activaD 20 s más tarde ( es decir , el ventilador se activa 1 minuto después del encendido del cigarrillo).

Cotinina sérica pre y postexposición

La pre-exposición y 1 h de cotinina sérica post exposición al grupo E-vapor (n = 3) fue de 4,2 ± 0,4 ng / mL y 171,6 ± 20,5 ng / mL, respectivamente. La cotinina sérica de exposición previa y 1 h después de la exposición para el grupo fumador de cigarrillos (n = 3) fue de 3,9 ± 0,3 ng / mL y 98,8 ± 2,1 ng / mL, respectivamente ( Figura 5 ).

Figura 5: Niveles de cotinina en suero después de la exposición al humo de cigarrillo o al cigarrillo electrónico. La cotinina sérica se midió antes de la iniciación del protocolo, y 1 h después de una sesión de exposición de 90 minutos. La pre-exposición y 1 h de cotinina sérica post-exposición para el grupo e-vapor fue de 4,2 ± 0,4 ng / mL aNd 171,6 ± 20,5 ng / ml, respectivamente. La cotinina sérica de exposición previa y 1 h después de la exposición al humo del cigarrillo fue de 3,9 ± 0,3 ng / mL y 98,8 ± 2,1 ng / mL, respectivamente. La diferencia entre las concentraciones de cotinina en suero antes y después de la exposición fue estadísticamente significativa. P <0,05.

Figura 6: Cámara de vapor electrónico de cigarrillos y cámara de humo de cigarrillos. Imagen del vapor de cigarrillo electrónico (derecha) y de la cámara de humo del cigarrillo (izquierda) dentro de la campana extractora de humos. Las cajas rojas contienen microcontroladores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Características de los Modelos de Exposición de Cigarrillos Electrónicos.

Aquí se describe un método para la construcción de cámaras que exponen a los roedores a vapor E y el humo del cigarrillo de una manera controlada ( Figura 6 ]. La construcción de la cámara de cigarrillos electrónicos es relativamente simple y barata en comparación con los sistemas comerciales de exposición ^{14 , 15 , 16} . Las piezas y herramientas necesarias para construir la cámara están disponibles en línea a través de proveedores comerciales. De manera similar, la construcción de la cámara de humo de cigarrillo es relativamente simple, con la excepción del dispositivo de iluminación de cigarrillos que se debe fabricar (véase Materiales suplementarios para los planes).

Una vez construidas las cámaras, una etapa crítica del sistema de exposición está calibrando las cámaras para exponer a los roedores a la cantidad deseada de nicotina. Tanto en la cámara del cigarrillo electrónico como en la cámara del cigarrillo, ajustando la cantidad de exposición total tIme es quizás el método más fácil para aumentar o disminuir la cantidad de exposición a la nicotina. Aumentar el tiempo de soplado en el sistema de exposición a cigarrillos electrónicos puede aumentar la dosis de nicotina, sin embargo, se ha demostrado que el vapor de e-cigarrillo durante un largo período de tiempo aumenta los niveles de ROS, aldehídos y otros compuestos peligrosos y puede O puede no reflejar los hábitos típicos de un usuario de cigarrillos electrónicos ⁵ . La duración del soplo y el tiempo de exposición total se pueden ajustar modificando el código cargado en el microcontrolador. Además, debe tenerse en cuenta que la concentración de nicotina en soluciones de cigarrillos E, así como el voltaje del elemento de calentamiento de cigarrillos E, puede variar significativamente y debe tenerse en cuenta al calibrar el sistema.

Una de las mayores ventajas de este sistema de exposición es su versatilidad. Prácticamente cualquier marca de e-cig o solución e-cig se puede utilizar con este sistema. Esta es una característica especialmente útilDado que el mercado de cigarrillos electrónicos incluye ahora más de 400 marcas y miles de soluciones de cigarrillos electrónicos ¹³ . Además, el sistema de exposición es compatible con múltiples criterios experimentales que permiten estudiar los efectos del E-cigarrillo sobre diversos sistemas de órganos y procesos de enfermedad. También reconocemos que existen varias limitaciones a este paradigma de exposición, como el método por el cual los animales están expuestos al vapor. Los usuarios de cigarrillos electrónicos inhalan directamente el vapor E mientras que en este paradigma los roedores inhalan el vapor E pasivo. Además, los roedores también probablemente absorberán compuestos dentro del vapor o el humo por otras vías ( es decir , absorción dérmica directa e ingestión mientras se envejecen). Sin embargo, pensamos que los beneficios del sistema de exposición superan con creces las limitaciones.

En general, este paradigma de exposición proporciona una exposición consistente y clínicamente relevante al vapor de E y al humo de cigarrillo, y puede ayudarAyudan al esfuerzo de investigación para determinar los efectos adversos para la salud del cigarrillo electrónico y el humo del cigarrillo.

Los autores no tienen nada que revelar.

Esta investigación fue posible gracias a la Aortic Research Grant (Universidad de Michigan) al Dr. Eliason. Los autores también quisieran agradecer a Nick Scott en el Departamento de Signos y Gráficos de Operaciones de Planta de la Universidad de Michigan por asistir con el diseño y montaje del dispositivo de iluminación de cigarrillos.