Confronto degli effetti di fumo elettronico di sigarette e sigaretta in un romanzo

Questo protocollo descrive un metodo per esporre i roditori al vapore elettronico di vapore (vapore E) e al fumo di sigaretta. Le camere di esposizione sono costruite modificando le camere di anestesia con un sistema di pompaggio automatico che fornisce vapori e fumo di sigaretta ai roditori. Questo sistema può essere facilmente modificato per ospitare molti endpoint sperimentali.

Le sigarette elettroniche ( sigarette elettroniche ) vengono ampiamente utilizzate e crescono in popolarità. Si stima che più di 9 milioni di adulti li utilizzano regolarmente. I potenziali effetti negativi sulla salute dell'esposizione elettronica del vapore di sigaretta (E-vapore) sono poco definiti. Mentre sono stati sviluppati diversi modelli animali di E- vapor esposizione, alcuni modelli espongono i roditori a quantità clinicamente rilevanti di nicotina e fanno confronti diretti con il fumo di sigaretta all'interno dello stesso sistema di esposizione. Qui esempiamo un metodo per costruire e utilizzare una camera di vapore E e una camera di fumo per sigarette. Le camere sono costruite applicando camere di anestesia con un sistema di pompaggio controllato da computer che fornisce quantità consistenti di EL'esposizione alla nicotina viene misurata indirettamente quantificando i livelli di cotinina sierica pre e post esposizione. Questo sistema di esposizione può essere modificato per accogliere vari tipi di sigarette E e sigarette di tabacco e può Essere utilizzato per confrontare gli effetti di E- vapore e fumo di sigaretta in vivo .

Dall'entrata nel mercato statunitense nel 2004, le sigarette elettroniche (sigarette elettroniche) si sono espanse in un settore di miliardi di dollari e si stima che quasi 9 milioni di adulti li usano regolarmente ¹ . Nel 2014 e nel 2015, più studenti delle scuole superiori avevano utilizzato sigarette elettroniche rispetto alle sigarette convenzionali ² . Il crescente numero di utenti di sigarette elettroniche ha generato uno sforzo di ricerca per valutare i loro potenziali effetti negativi sulla salute.

Le sigarette elettroniche generano un vapore (soprannominato "E vapore") riscaldando una soluzione viscosa che contiene tipicamente una miscela di acqua, polietilenglicole o glicerina vegetale, nicotina e aromi ^{3 , 4} . È stato dimostrato che il vapore in E contiene diversi composti nocivi tra cui le specie ossigeno reattivo (ROS), la nicotina, le aldeidi vari e gli idrocarburi policiclici aromatici ^{5 ,}6. Molti di questi composti si formano durante il processo di vaporizzazione del liquido E prima dell'iniezione ⁷ . Notevolmente, molti di questi composti nocivi sono presenti anche nel fumo di sigaretta, suscitando preoccupazione che le sigarette elettroniche possano avere conseguenze negative per la salute ⁷ .

C'è poco consenso sugli effetti sulla salute delle sigarette elettroniche. Per risolvere questo problema, sono stati sviluppati diversi modelli animali di esposizione a vapori E ( Tabella 1 ). Questi modelli impiegano una varietà di metodi come l'esposizione a vapore del corpo intero e la ventilazione meccanica. Mentre i modelli attuali hanno fornito dati accurati, pochi effettuano confronti diretti con il fumo di sigarette all'interno dello stesso sistema di esposizione ( Tabella 1 ). Inoltre, mentre diversi studi sull'uomo hanno dimostrato agli utenti e ai fumatori di sigarette per avere livelli di cotinina sierici compresi tra 30-200 ng / ml, molti modelli di esposizione al fumo di E e fumo di sigaretta cadonoIde questa gamma ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12} .

Ecco qui un metodo per confrontare gli effetti del fumo di sigaretta e dell'esposizione al vapore in vivo in modo da produrre livelli di cotinina sierici simili agli studi umani.

Il seguente protocollo è stato eseguito sotto la guida e l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università del Michigan.

1. Assieme elettronico della camera da sigarette vapore

NOTA: La camera completa deve essere collocata in una cappa di fumo durante l'uso. La camera qui è stata alloggiata in un ambiente di laboratorio controllato e filtrato. Gli investigatori possono scegliere di monitorare tali aspetti del sistema per garantire la coerenza della qualità dell'aria ambiente. Come opzione, la copertura dei monitor con una gabbia metallica può impedire la manomissione del roditore permettendo ai monitor di campionare l'ambiente della camera interna.

1. Acquisire una camera di anestesia con coperchio estraibile con volume volumetrico di 20 L.
2. Utilizzando una sega a fresa dotata di una lama adatta al taglio del materiale, tagliare un foro di diametro di 10,2 cm nel coperchio della camera di circa 7,6 cm dal bordo posteriore delCamera.
3. Inserire lo sfiato regolabile nel foro e montare in posizione con qualsiasi adesivo a caulk.
   NOTA: Assicurarsi che il caucciù adesivo non sia accessibile ai roditori della camera, in quanto possono masticare il caulk. Per evitare questo evento, applicare il caulk all'esterno della parete della camera per montare l'apertura.
4. Tagliare il tubo in silicone in due segmenti di 15 cm e fissare le estremità su entrambi i lati di un connettore a T.
   NOTA: Il tubo in silicone ha il potere di reagire con alcuni componenti di vapore e fumo di sigaretta. Pertanto, gli investigatori potrebbero considerare l'utilizzo di tubi non reattivi.
5. Filettare entrambi i tubi in silicone attraverso fori premade vicino alla parte anteriore del coperchio della camera in modo che il connettore T sia all'interno della camera. Assicurarsi che il tubo sia fissato al coperchio con un nastro adesivo o un nastro elettrico.
6. Collegare le estremità libere del tubo in silicone alle estremità di uscita di due pompe ad aria micro. Le pompe devono essere montate sul coperchio della camera con doppio-Nastro adesivo o caulk.
   NOTA: La lunghezza del tubo collegato alla estremità di uscita della pompa deve essere breve per limitare la quantità di raccolta del vapore sulla superficie interna del tubo durante l'uso.
7. Con un nuovo tubo in silicone, collegare un'estremità al lato d'ingresso di una delle pompe d'aria (pompa A nella Figura 1 ) e tagliare questo tubo a circa 4 cm di lunghezza. Questo è dove la sigaretta elettronica verrà inserita durante l'uso della camera. Assicurarsi che il diametro del tubo consente una perfetta adattamento all'estremità dell'e-cig.
8. Con un nuovo tubo in silicone, collegare un'estremità all'entrata dell'altra pompa dell'aria (pompa B in figura 1 ). Questa pompa introdurrà aria ambiente nella camera. In quanto tale, l'estremità del tubo deve essere posizionata al di fuori della cappa aspirante. La lunghezza di questo tubo non è critica, ma dovrebbe essere il più corto possibile per limitare la resistenza al flusso d'aria.
9. All'interno della camera fissare due piccoli ganci con adesivo a doppia faccia per tenere ossigEn e monitor di gas monossido di carbonio.

Figura 1. Schema della camera elettronica a vapore.
La camera è alloggiata in cappa di fumo (non illustrata). La pompa dell'aria ambiente (pompa B) introduce aria ambiente dall'esterno della cappa aspirante in camera a 2 L / min. La pompa E-cig (pompa A) soffia 133 mL di vapore E per 4 s, con un intervallo di riposo di 30 secondi. E vapore e miscela aria ambiente prima di essere pompati nella camera. I monitor a gas misurano continuamente le concentrazioni di monossido di carbonio (CO) e ossigeno (O ₂ ) all'interno della camera. Il vapore E è esaurito passivamente attraverso l'apertura nella cappa di fumo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Assemblea fumaria della sigaretta

NOTA: Praticamente qualsiasi marca oF cigarette può essere utilizzato con questo sistema, tuttavia le sigarette di ricerca standardizzate come la sigaretta di ricerca dell'Università di Kentucky 1R6F sono convenienti, affidabili e migliori per questa applicazione.

1. Seguire i passaggi 1.1 - 1.6 e step 1.9.
2. Con un nuovo tubo in silicone, collegare un'estremità al dispositivo di illuminazione della sigaretta e l'altra estremità al lato di ingresso della pompa dell'aria (pompa A della Figura 2 ). Il dispositivo di illuminazione della sigaretta deve essere posizionato all'interno della cappa e all'esterno della camera durante l'uso.
   Nota: La costruzione del dispositivo di illuminazione per sigarette richiede una conoscenza della fabbricazione del metallo e dell'ingegneria elettrica. Mentre non verrà fornita una guida dettagliata per la costruzione, consultare i materiali supplementari per i piani.
3. Con un nuovo tubo in silicone, collegare un'estremità all'altra pompa dell'aria (pompa B in figura 2 ). Questa pompa introdurrà aria ambiente nella camera, quindi l'estremità del tubo deve essere posizionata al di fuori della cappa aspirante. >
4. Tagliare diverse fessure verticali di 5 mm nella parete anteriore della camera e montare un ventilatore del computer all'esterno della camera in modo che copri questa apertura. Assicurarsi che la parte anteriore del ventilatore sia rivolta verso la camera in modo tale che la ventola soffia l'aria nella camera attraverso questa apertura.

Figura 2. Schema della camera di fumo sigaretta.
La pompa dell'aria ambiente (pompa B) introduce aria ambiente dall'esterno della cappa aspirante in camera a 2 L / min. La pompa A rileva una sigaretta accesa per 40 secondi con una velocità di 2 L / min e 20 secondi più tardi la ventola del computer evita la camera per 3 minuti. Il fumo e la miscela di aria ambiente prima di essere pompati nella camera. I monitor a gas misurano continuamente le concentrazioni di ossido di carbonio (CO) e ossigeno (O ₂ ). Il fumo è esaurito attraverso la sfoglia in cappa di fumo.Ftp_upload / 55672 / 55672fig2large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Assemblaggio del microcontrollore e software

1. Controllare il sistema di pompaggio della camera di vapore E-sigaretta e la camera di fumo per sigarette tramite microcontrollori separati. Scaricare il software del microcontrollore e caricare i codici operativi forniti nei Materiali Supplementari . Il codice elettronico di vapore per sigaretta eseguirà continuamente la pompa dell'aria ambiente e attivare la pompa per sigarette E per una durata di 4 s ogni 30 secondi. Il codice del fumo di sigaretta eseguirà continuamente la pompa dell'aria ambiente, attivare la pompa della sigaretta per 40 secondi e attivare la ventola del computer 20 secondi dopo che la pompa della sigaretta si è arrestata. Il ventilatore si spegnerà dopo aver funzionato per 3 minuti.
   Nota: la tempistica delle pompe e del ventilatore può essere regolata come necessario. Istruzioni del produttore di riferimento su come caricare i codici pertinenti al microcontrollore.
2. Per assemblareIl microcontrollore, collegare i fili di zip, i diodi, le resistenze e i condensatori al pannello di pane come mostrato in figura 3 e collegare i fili di alligatore alla corrispondente pompe d'aria (e ventilatore per la camera di fumo per sigarette). Posizionare il microcontrollore al di fuori della cappa aspirante se possibile.

Figura 3. Schema del microcontrollore.
Schema del microcontrollore e della scheda di pane per il funzionamento delle pompe e del ventilatore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Animali

1. Usi i ratti adulti che pesano 450 - 520 g.
2. Ratti di gruppo in base al tipo di esposizione ( ad esempio , sigaretta elettronica, fumo di sigaretta, aria ambiente pompata in camera).
3. A questo tempo prAll'esposizione, raccogliere 500 μL di sangue in tubi rivestiti con EDTA mediante una siringa per misurare la concentrazione di cotinina nel siero di base.
4. Spin giù i campioni di sangue a 20.000 xg per 30 minuti a 4 ˚C e raccogliere il siero. Assicurarsi che i campioni siano raffreddati in ghiaccio durante questo processo.
5. Seguendo il protocollo del produttore, il dosaggio della cotinina nei campioni di siero raccolti. I campioni possono anche essere conservati a -80 ˚C per un uso successivo.

5. Funzionamento della camera elettronica per la sigaretta

1. Pulire l'interno della camera con il 70% di etanolo, quindi con acqua deionizzata e lasciare asciugare l'aria fino a quando la camera è completamente asciutta (o circa 30 minuti).
2. Calibrare i monitor di gas e montare l'intero monitor sulla parete interna della camera.
3. Posizionare i ratti all'interno della camera. Si noti che fino a tre animali possono essere esposti contemporaneamente.
4. Assicurarsi che la sigaretta E sia completamente carica con un adeguato liquido E e inserire la sigaretta ENel tubo di ingresso. È fondamentale assicurarsi che la batteria E-sigaretta E-livello liquido sia adeguata per tutta la durata dell'esposizione di 90 minuti.
5. Accendere le pompe dell'aria e avviare il timer.
6. Durante l'esposizione osservare i monitor di gas per garantire che la camera contenga> 20% O ₂ e 0 ppm CO.
   Nota: se i livelli di ossigeno cadono, la camera potrebbe non essere ben aerata o il monitor dell'ossigeno potrebbe non essere adeguatamente calibrato.
7. Una volta che il tempo di esposizione ha raggiunto i 90 minuti, rimuovere la sigaretta E e continuare a eseguire le pompe a gas per sfiatare il vapore residuo. Inoltre, la parte superiore della camera può essere sollevata per accelerare la ventilazione.
8. Una volta che il vapore si è eliminato, togliere i ratti e pulire la camera.
9. Raccogliere 500 μL di sangue dalla vena della coda da ciascun ratto circa 1 h dopo l'esposizione alla conclusione del protocollo sperimentale.
10. Seguire i punti 4.4 - 4.5 per isolare il siero e il dosaggio per la cotina.

6. Funzionamento della camera di sigaretta del tabacco

1. Seguire i punti 5.1 - 5.3.
2. Inserire la sigaretta nel dispositivo di illuminazione della sigaretta, con la fine della sigaretta contro gli elementi riscaldanti.
3. Accendere il dispositivo di illuminazione della sigaretta fino a quando il cigoletto inizia a smorzare (circa 5 s).
4. Una volta che la sigaretta è accesa, accendere il sistema di pompaggio, avviare il timer e osservare la combustione della sigaretta fino alla fine (circa 40 s).
5. Una volta che la sigaretta è bruciata, rimuovere con cura la sigaretta passata dal dispositivo di illuminazione della sigaretta.
6. Assicurarsi che i livelli di CO non superino i 1000 ppm ei livelli di O ₂ non scendano al di sotto del 20%. Il tempo e la durata del ventilatore del computer sono fondamentali per prevenire l'accumulo di ossido di carbonio.
7. Dopo 4 minuti girare il sistema di pompaggio e tornare al punto 6.2 fino a quando i ratti sono esposti al fumo di tabacco per 90 min (o circa 23 sigarette).
   NOTA: Livelli di monossido di carbonio 4 min dopo la sigarettaNing dovrebbe scendere al di sotto di 400 ppm, altrimenti il ​​monossido di carbonio può cominciare ad accumularsi in camera.
8. Quando l'esposizione è completa, continuare a lasciare il sistema di pompaggio per ventilare il fumo residuo. Quando il monossido di carbonio scende al di sotto di 100 ppm, togliere i ratti dalla camera. Questo dovrebbe richiedere 5-10 min.
9. Rimuovere i topi e pulire la camera.
10. Raccogliere 500 μl di sangue dalla vena della coda circa 1 h dopo l'esposizione alla conclusione del protocollo sperimentale come con le sigarette E.
11. Seguire i punti 4.4 - 4.5 per isolare il siero e il dosaggio per la cotina.

Monitoraggio di monossido di carbonio e ossigeno

Le concentrazioni di ossigeno non sono diminuite al di sotto del 20% durante l'esposizione al vapore e le concentrazioni di CO non sono state rilevabili durante l'esposizione. I monitor di gas durante l'esposizione al fumo di sigarette hanno indicato che la concentrazione di ossigeno è rimasta al di sopra del 20%. Le concentrazioni di monossido di carbonio non hanno superato i 1.000 ppm ( Figura 4 ).

Figura 4: Concentrazioni di monossido di carbonio nella camera di fumo di sigarette. La concentrazione di monossido di carbonio è stata registrata ogni 30 s nel corso dell'introduzione del fumo da sigarette 1R6F. I risultati mostrati sono la media di 3 cicli consecutivi di 4 min. Le concentrazioni di monossido di carbonio non hanno superato i 1.000 ppm. La sigaretta viene bruciata fino al completamento di 40 secondi e il ventilatore viene attivatoD 20 s più tardi ( cioè il ventilatore viene attivato 1 min dopo l'accensione della sigaretta).

Precoce e Postexposure Serina Cotinina

La pre-esposizione e 1 h postexposure della cotinina sierica per il gruppo vapore E (n = 3) erano rispettivamente 4,2 ± 0,4 ng / ml e 171,6 ± 20,5 ng / ml. La pre-esposizione e la cotinina sierica postexposure di 1 h per il gruppo di fumo di sigaretta (n = 3) erano rispettivamente di 3.9 ± 0.3 ng / mL e 98.8 ± 2.1 ng / mL ( Figura 5 ).

Figura 5: livelli di cotina di siero dopo fumo di sigaretta o esposizione elettronica di sigarette elettroniche. La cotinina sierica è stata misurata prima dell'inizio del protocollo e 1 h dopo una seduta di esposizione di 90 minuti. La pre-esposizione e la cotinina di siero post-esposizione a 1 h per il gruppo e vapore erano 4,2 ± 0,4 ng / mL aNd 171,6 ± 20,5 ng / ml, rispettivamente. La pre-esposizione e la cotinina sierica postexposure di 1 h per il gruppo di fumo di sigaretta erano rispettivamente 3.9 ± 0.3 ng / mL e 98.8 ± 2.1 ng / mL. La differenza tra la concentrazione di cotinina sierica pre e postexposure era statisticamente significativa. * P <0,05.

Figura 6: Camera elettronica a vapore e sigaretta a fumo. Immagine del vapore elettronico di vapore (a destra) e della camera di fumo di sigaretta (sinistra) all'interno della cappa di fumo. Le scatole rosse contengono microcontrollori. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Caratteristiche dei modelli elettronici di esposizione per sigarette.

Qui descriviamo un metodo per la costruzione di camere che espongono i roditori al vapore e al fumo di sigaretta in modo controllato ( Figura 6 ). La costruzione della camera di sigaretta E è relativamente semplice e poco costosa rispetto ai sistemi di esposizione commerciale ^{14 , 15 e 16} . Le parti e gli strumenti necessari per costruire la camera sono facilmente reperibili da fornitori commerciali online. Allo stesso modo, la costruzione della camera di fumo per sigarette è relativamente semplice, ad eccezione del dispositivo di illuminazione della sigaretta che deve essere fabbricato (vedere Materiali supplementari per i piani).

Una volta che le camere sono costruite, una fase critica del sistema di esposizione è la calibrazione delle camere per esporre i roditori alla quantità desiderata di nicotina. Nella camera di sigaretta E e nella camera di sigaretta, regolando la quantità di esposizione totale tIl nome è forse il metodo più semplice per aumentare o diminuire la quantità di esposizione alla nicotina. Aumentando il tempo di soffio nel sistema di esposizione a sigarette E può aumentare la dose di nicotina, tuttavia è stato dimostrato che il vapore dalla sigaretta E per un lungo periodo di tempo aumenta i livelli di ROS, aldeidi e altri composti pericolosi. O non riflettere le abitudini tipiche di un utente di sigaretta E ⁵ . La durata del soffio e il tempo totale di esposizione possono essere regolati modificando il codice caricato sul microcontrollore. Va inoltre osservato che la concentrazione della nicotina nelle soluzioni di sigaretta E, nonché la tensione dell'elemento di riscaldamento della sigaretta E, può variare in modo significativo e deve essere presa in considerazione durante la calibrazione del sistema.

Uno dei maggiori vantaggi di questo sistema di esposizione è la sua versatilità. Virtualmente qualsiasi marchio di soluzione e-cig o e-cig può essere utilizzato con questo sistema. Questa è una fea particolarmente utilePoiché il mercato della sigaretta elettronica ora include oltre 400 marchi e migliaia di soluzioni di sigaretta E ¹³ . Inoltre, il sistema di esposizione è compatibile con più endpoint sperimentali che permettono di studiare gli effetti della sigaretta E sui vari sistemi organici e sui processi di malattia. Riconosciamo inoltre che ci sono diverse limitazioni a questo paradigma di esposizione, come il metodo con cui gli animali sono esposti al vapore. Gli utenti di sigarette elettroniche inalano direttamente il vapore E, mentre in questo paradigma i roditori inalano il vapore E in modo passivo. Inoltre, i roditori probabilmente assorbono anche composti all'interno del vapore o fumo da altri percorsi ( ad esempio assorbimento dermico diretto e ingestione durante la prevenzione). Tuttavia, riteniamo che i vantaggi del sistema di esposizione superino di gran lunga i limiti.

Nel complesso, questo paradigma di esposizione offre un'esposizione consistente e clinicamente rilevante del fumo e del fumo di sigaretta e può aiutareAiuti lo sforzo di ricerca per determinare gli effetti negativi sulla salute di sigaretta E e fumo di sigaretta.

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Questa ricerca è stata resa possibile dalla Aortic Research Grant (University of Michigan) presso il Dr. Eliason. Gli autori vorrebbero inoltre riconoscere Nick Scott presso il Dipartimento per la Segnaletica e la Grafica del Dipartimento di piantagioni di Michigan per assistere alla progettazione e all'assemblaggio del dispositivo di illuminazione per sigarette.