Medir a ligação da proteína à actina F por co-sedimentação

Este protocolo descreve um método para testar a capacidade de uma proteína co-sedimentar com actina filamentosa (F-actina) e, se for observada ligação, para medir a afinidade da interacção.

A organização de actina filamentosa (F-actina) dentro das células é regulada por um grande número de proteínas de ligação à actina que controlam a nucleação, crescimento, reticulação e / ou desmontagem da actina. Este protocolo descreve uma técnica - a co-sedimentação de actina, ou sedimentação, ensaio - para determinar se uma proteína ou proteína domínio liga F-actina e medir a afinidade da interação ( isto é, a constante de equilíbrio de dissociação). Nesta técnica, uma proteína de interesse é primeiro incubada com F-actina em solução. Em seguida, utiliza-se a centrifugação diferencial para sedimentar os filamentos de actina, e o material peletizado é analisado por SDS-PAGE. Se a proteína de interesse se liga à F-actina, co-sedimentará com os filamentos de actina. Os produtos da reacção de ligação ( isto é, F-actina e a proteína de interesse) podem ser quantificados para determinar a afinidade da interacção. O ensaio de peletização de actina é uma técnica simples para determinarSe uma proteína de interesse se liga a F-actina e para avaliar como as alterações a essa proteína, tais como a ligação do ligando, afectam a sua interacção com F-actina.

A actina é uma proteína essencial do citoesqueleto que desempenha um papel crítico em múltiplos processos celulares, incluindo motilidade, contração, adesão e morfologia ¹ . A actina existe em duas formas: actina globular monomérica (G-actina) e actina filamentosa polimerizada (F-actina). Dentro das células, a organização da F-actina é controlada por uma grande coleção de proteínas que regulam a nucleação, crescimento, reticulação e desmontagem dos filamentos de actina ^{2 , 3 , 4} . No entanto, como múltiplas proteínas de ligação de actina funcionam em conjunto para regular a organização da rede de actina ainda não está bem esclarecida.

A medição das interações proteína-proteína é uma abordagem importante para entender como as proteínas exercem seus efeitos sobre o comportamento celular ao nível bioquímico. Muitos ensaios diferentes podem ser utilizados para detectar interacções entre proteínas purificadas.Abordagens comuns para proteínas solúveis incluem pull-downs, polarização de fluorescência, calorimetria de titulação isotérmica e ressonância de plasmão de superfície. É importante notar que todos estes ensaios requerem que as proteínas sejam solúveis e são, portanto, difíceis de adaptar para utilização com uma proteína polimérica, filamentosa tal como F-actina. Aqui, descrevemos uma técnica - a co-sedimentação de actina, ou granulação, ensaio - para determinar se uma proteína ou proteína domínio se liga F-actina e para medir a afinidade da interação.

O ensaio de peletização de actina é uma técnica relativamente simples que não requer equipamento especializado, além de uma ultracentrífuga. Todos os reagentes podem ser feitos, assumindo conhecimentos de bioquímica básica, ou adquiridos. Uma vez estabelecida a ligação à F-actina, o ensaio pode ser utilizado para medir a afinidade aparente ( isto é, a constante de equilíbrio de dissociação) ⁵ . Além disso, uma vez estabelecida a afinidade, o ensaio de peletizaçãoÉ uma ferramenta útil para medir como alterações na proteína de interesse ( isto é , modificações pós-translacionais, mutações, ou ligação de ligando) afetam sua interação com F-actina ⁶ . A técnica tem limitações (ver a Discussão ) que o pesquisador deve estar ciente antes de tentar o ensaio.

1. Preparar os Materiais

1. Purificar a proteína de interesse (ver secção 2).
2. Prepare ou compre G-actina.
   NOTA: A G-actina pode ser isolada a partir de múltiplas fontes ¹ ; Alternativamente, ele pode ser comprado. A G-actina reconstituída (em Tris 5 mM, pH 8,0, CaCl2 0,2 ​​mM, ATP 0,2 mM (adenosina trifosfato) e ditiotreitol 0,5 mM (DTT)) deve ser congelada instantaneamente, armazenada a -80 ° C e> 10 mg / mL Em alíquotas pequenas (10-20 μL) e descongeladas imediatamente antes do uso. As alíquotas de G-actina não devem ser recongeladas.
3. Prepare ou adquira uma proteína de controlo, tal como BSA (ver passo 4.4).
4. Preparar tampão de polimerização 10x (imidazol 200 mM pH 7,0, KCl 1 M, MgCl2 20 mM, ATP 5 mM e EGTA 10 mM (éter de etileno glicol bis (p-aminoetil) -N, N, N ', N'- Tetraacético)). Faça um estoque 10x e ajuste o pH após a adição de ATP, se necessário. Alíquota (25 μL é um volume útil) e armazenar a -80 & #176; C.
5. Preparar 10x tampão de reacção (imidazol 200 mM pH 7,0, NaCl 1,5 M, MgCl2 20 mM, ATP 5 mM e EGTA 10 mM). Faça um estoque 10x e ajuste o pH após a adição de ATP, se necessário. Alíquota (50-100 μL é um volume útil) e armazenar a -80 ° C.
   NOTA: A composição do tampão de reacção é flexível e pode necessitar de ser ajustada para reduzir a sedimentação de fundo, limitar a ligação não específica e / ou melhorar a ligação (passos 1.5.1-1.5.3).
   1. Ajustar o pH do tampão de reacção entre 6 e 8 para optimizar a estabilidade da proteína. A um pH mais baixo ou mais elevado, substitua o imidazole por um tampão apropriado.
      NOTA: Utilize pH 7,0 como ponto de partida, a menos que uma proteína necessite de um pH inferior ou superior para a estabilidade. Não utilize um tampão com um pH inferior a 6,0 ou superior a 8,0, uma vez que isto pode perturbar a actina. Os tampões recomendados (concentração final e pH óptimo listados) incluem: MOPS 20 mM (ácido 3- ( N- morfolino) propanossulfónico), pH= 6,5; Imidazole 20 mM, pH = 7,0; HEPES 10 mM (ácido 4- (2-hidroxietil) piperazina-1-etanossulfónico), pH = 7,5; E Tris 20 mM, pH = 8,0.
   2. Variar a concentração de sal do tampão de reacção, dependendo das necessidades do ensaio.
      NOTA: A actina é uma proteína ácida, e quase todas as proteínas de ligação à actina dependem, em certa medida, de interacções electrostáticas para associar-se à actina. Consequentemente, o aumento da concentração de sal diminui a ligação da actina na maioria dos casos. O tampão de reacção utiliza um nível fisiológico de sal (NaCl 150 mM, concentração de trabalho), e este é o ponto de partida recomendado. Se necessário, a concentração de sal pode ser reduzida ( por exemplo, até 100 mM) para promover a ligação ou aumentada para limitar a ligação.
   3. Não altere as concentrações de MgCl ₂ , ATP ou EGTA no tampão de reacção, a menos que haja uma razão específica para o fazer.

2. Preparar a Proteína de Teste para o Ensaio

1. PrepararEa proteína de alta pureza usando cromatografia líquida para obter os melhores resultados ⁷ .
   NOTA: Se estiver a utilizar proteína recombinante, devem ser removidas proteínas de proteínas grandes, tais como a glutationa-S-transferase (GST) por clivagem de protease da proteína alvo, uma vez que podem interferir com a ligação. O GST também causa a homodimerização de proteínas de fusão, que podem aumentar artificialmente a afinidade da ligação da actina.
2. Determine a concentração de proteína medindo a absorbância a 280 nm. Divida pelo coeficiente de extinção; O coeficiente de extinção pode ser calculado a partir da sequência de proteínas utilizando a análise de sequências ou ferramentas on-line. Alternativamente, determinar a concentração de proteína usando Bradford ou BCA (ácido bicinchoninic) métodos.
   NOTA: Para as experiências iniciais, 50-100 μL de proteína a 20-40 μM é normalmente suficiente. Isto permitirá a análise da ligação na gama micromolar baixa, um ponto de partida útil para a maioria das proteínas de ligação à actina. Um quan maiorE muitas vezes uma maior concentração de proteína são necessários para gerar uma curva de ligação para calcular a afinidade (ver secção 5).
3. Imediatamente antes do uso, centrifugação dura da proteína (50.000-100.000 xg durante 10 min a 4 ° C) para remover os agregados de proteína insolúvel. Se a solubilidade for uma preocupação, re-medir a concentração de proteína (passo 2.2) após a centrifugação.

3. Prepare a F-actina

1. Remova uma alíquota de G-actina do congelador de -80 ° C e descongelá-lo rapidamente.
2. Adicionar o tampão de polimerização 10x à G-actina até uma concentração final de 1x. Assegurar que a concentração de G-actina no tampão de polimerização 1x é pelo menos 10-20 μM, bem acima da concentração crítica. Incubar durante 1 hora à temperatura ambiente (RT) para permitir que a actina polimerize.
3. Após a polimerização, armazenar a F-actina em solução a 4 ° C, onde será estável por algumas semanas. Antes de usar a F-actina novamente após o armazenamento, gentilmente inverterOu mexer várias vezes no tubo para assegurar que toda a actina seja dissolvida e uniformemente distribuída em solução.
   NOTA: (Opcional) Adicionar phalloidin para alcançar uma razão molar de 1: 1 de G-actina: phalloidin. Incubar durante 30 min à RT para permitir que a faloidina se ligue à F-actina. A phalloidin estabiliza a F-actina e realiza duas coisas: (i) reduz a quantidade de actina que não sedimenta durante a centrifugação e (ii) permite que a F-actina seja diluída abaixo da concentração crítica (~ 0,5 μM), que é frequentemente Necessário se variando a quantidade de F-actina para gerar uma curva de ligação (ver secção 5 na medição da afinidade).

4. Ensaio de granulação - Protocolo Básico

NOTA: O protocolo básico descrito na secção 4 é utilizado para determinar se uma proteína de interesse co-sedimentos com F-actina. Uma vez estabelecida a ligação à F-actina, a afinidade desta interacção pode ser medida seguindo o protocolo descrito na secção 5.

1. Preparar o tampão de reacção no dia da utilização diluindo o stock 10x para 1x e adicionar DTT a uma concentração final de 1 mM.
   NOTA: (Opcional) Adicionar polidocanol a uma concentração final de 0,02% no tampão de reacção. O Polidocanol é um tensioactivo que reduz a ligação de fundo não específica e ajuda a impedir que as proteínas hidrofóbicas se adiram ao tubo de ultracentrífuga.
2. Diluir a proteína de interesse para as concentrações desejadas em 1x tampão de reação em tubos de ultracentrífuga. Mantenha os volumes de amostra baixos (40-60 μL) para evitar o uso de grandes quantidades de proteína usando tubos de ultracentrífuga com pequenos volumes mínimos ( por exemplo , tubos de 7 x 20 mm que contenham 0,2 mL cada).
   NOTA: Uma vez que muitas proteínas de ligação à actina têm uma afinidade para a actina F na gama micromolar, recomenda-se testar uma proteína de interesse a 2 e 10 μM. Se a ligação não for observada a 10 μM, é improvável que a ligação seja observada em concentrações mais elevadas. Se oA proteína adicionada constitui mais de 10-20% do volume final da reacção, pode ser necessário diálise da proteína no tampão de reacção antes de realizar a experiência.
3. Adicionar F-actina à concentração final desejada.
   NOTA: 2 μM é uma concentração útil para experiências iniciais porque está bem acima da concentração crítica, mantendo assim a actina no estado filamentoso. Produzirá uma pastilha visível quando analisada por SDS-PAGE (passo 4.10).
4. Preparar os seguintes controles em tubos de ultracentrífuga para tornar o ensaio informativo.
   1. Preparar amostra (s) contendo a proteína de interesse sem F-actina. Assegurar que a concentração de proteína nestas amostras corresponda à concentração nas amostras "plus F-actina".
      NOTA: Estas amostras determinarão a quantidade de proteína que é agregada ou presa aos lados do tubo de ultracentrífuga na ausência de F-actina.
   2. Preparar amostras de controlo negativoÀ mesma concentração ou concentrações semelhantes utilizadas para a proteína de interesse. Use uma proteína controle que não se ligue à F-actina, com e sem F-actina.
      NOTA: Este é um importante controle porque as proteínas podem se tornar "presas" em filamentos de actina e pellet com F-actina, mesmo que eles não se liguem à F-actina. A quantidade de aprisionamento pode variar dependendo da fonte de F-actina, condições de tampão, etc. Assim, este controlo deve ser incluído em todas as experiências. Idealmente, a proteína de controlo deve ter um peso molecular semelhante à proteína de interesse ( por exemplo , para aE-catenina (~ 100 kDa), a BSA (66 kDa) é um controlo apropriado). Os padrões de filtração de gel comercialmente disponíveis constituem proteínas de controlo excelentes, uma vez que cobrem uma gama de tamanhos e tendem a não conter agregados.
   3. Opcionalmente, preparar amostras de controlo positivo contendo uma proteína que se liga à F-actina, com e sem F-actina. Certifique-se de que a (s) concentração (ões) são semelhantes àsE proteína de interesse.
      NOTA: Este controlo é útil na medida em que demonstra que as condições experimentais ( eg, F-actina preparada, tampão de reacção e centrifugação) permitem a ligação da F-actina. Uma vez que o ensaio de peletização pode deixar de detectar interacções fracas de actina F (ver a Discussão), recomenda-se que a proteína de ligação à actina F conhecida tenha uma afinidade moderada a fraca pela actina F ( isto é, na gama micromolar baixa ). As proteínas de ligação a F-actina purificadas estão comercialmente disponíveis.
5. Incubar todas as amostras durante 30 min à RT.
   NOTA: Os tempos de incubação mais longos são bons, assumindo que a proteína de interesse é estável, embora provavelmente desnecessária. Se a proteína de interesse não é estável à RT, então as amostras podem ser incubadas a 4 ° C. Neste caso, podem ser necessários tempos de incubação mais longos.
6. Coloque as amostras no rotor da centrífuga. Posicionar os tubos dentro do rotor para auxiliar na ressuspensão do sedimento após a centrifugação.Para isso, marque todos os tubos de centrífuga ( por exemplo, com um número de amostra) e coloque todos os tubos no rotor na mesma posição ( por exemplo, o número voltado para fora).
7. Centrifugar a 100 000 xg durante 20 min a 4 ° C numa ultracentrífuga.
8. Após a centrifugação, retirar 3/4 do sobrenadante ( por exemplo , 45 μL se o volume inicial for 60 μL) de cada tubo e misturar com 1/3 volumes de tampão de amostra 4x (15 μL neste caso) num tubo de microcentrífuga separado.
   1. Remover o sobrenadante restante com uma ponta de carga de gel, tomando cuidado para não perturbar o sedimento (que pode ser visível como um ponto vítreo).
      NOTA: É importante remover o sobrenadante dos tubos o mais rapidamente possível após a conclusão da centrifugação para limitar a dissociação da proteína após a separação. Além disso, não lave o sedimento com tampão de reação pela mesma razão.
9. Adicionar 4/3 volumes de 1x tampão de amostra a cada pelleT ( por exemplo , 80 μL se o volume de partida fosse 60 μL).
   NOTA: Isto faz com que a diluição seja a mesma que para o sobrenadante (passo 4.8, volumes de 1/3 de tampão de amostra 4x foram adicionados), permitindo a comparação directa entre as amostras de sedimento e sobrenadante e a determinação da percentagem de proteína que foi sedimentada.
   1. Adicionar tampão de amostra a todos os tubos e incubar durante pelo menos 5 min à RT. Permitir que o sedimento para sentar-se no buffer de amostra para melhorar a recuperação da amostra.
   2. Triturar a amostra 8-10 vezes com uma ponta de pipeta p200 para ressuspender o grânulo lavando continuamente a área do sedimento do tubo. Raspe suavemente a ponta da pipeta sobre a pastilha durante a trituração para ajudar na ressuspensão.
      NOTA: Tome cuidado para evitar a introdução de ar na amostra durante a trituração, pois isso fará com que o tampão de amostra borbulhe e reduza a recuperação da amostra.
   3. Transferir as amostras ressuspensas para tubos de microcentrífuga após a trituração.
   4. Analisar as amostras de sobrenadante e sedimento por SDS-PAGE e coloração com Coomassie ⁸ por carregamento de 10-15 μL de amostra por pista; Isso é suficiente para visualizar as proteínas.
      NOTA: Proteínas que co-sedimentam com F-actina serão enriquecidas nas amostras de "plus F-actina" sobre as amostras de pellet "sem F-actina" ( Figura 1A ). A coloração azul padrão de Coomassie é suficiente para a detecção se as concentrações de proteína estiverem na gama de 0,1-10 μM. Coloidal Coomassie ⁹ ou Western blotting pode ser utilizado para aumentar a sensibilidade se forem utilizadas concentrações de proteína mais baixas para medir interacções de maior afinidade.
   5. Image Coomassie-manchou géis usando um scanner ou sistema de imagem (passo 5.12).

   5. Ensaio de granulação - Quantificação

   Nota: Se for observada a ligação específica à F-actina, pode ser útil medir a afinidade de tInteração. Isto é conseguido fazendo algumas alterações e adições ao protocolo delineado na secção 4. Para um excelente guia para a concepção e interpretação de ensaios de ligação, consulte Pollard ¹⁰ . Um fluxograma ( Figura 2 ) é fornecido para assistência com a análise e quantificação.

   1. Determine a faixa de concentração a ser testada.
      NOTA: A gama de concentrações dependerá da proteína e deverá abranger desde uma concentração abaixo do Kd aparente ( por exemplo, 1 μM) até concentrações suficientemente elevadas para saturar a ligação. É crítico que a ligação chegue à saturação em múltiplas amostras na extremidade superior da gama de concentração para gerar uma curva de ligação exacta ( Figura 1C ). Como mencionado acima, muitas proteínas de ligação à actina têm afinidade para a actina F na gama micromolar baixa (1-5 uM). Para uma proteína com um Kd de 0,5-1 μM, uma gama de concentração de partida útil seria 0,1-10 μM.
   2. Hard spin (passo 2.3) a proteína de interesse para remover agregados. Serialmente diluir a proteína para fazer uma série de concentração contendo 7-8 amostras a 2x a concentração final a ser testado. Por exemplo, se o intervalo a testar for de 0,1 a 8 μM, preparar as seguintes diluições em tampão de reacção 1x: 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 e 0,2 μM.
      NOTA: Tal como mencionado no passo 4.2, se a proteína adicionada for superior a 10% -20% da primeira diluição (a amostra de 16 μM no exemplo acima), pode ser necessário concentrar a proteína ou dializar a Em 1x tampão de reacção. Certifique-se de preparar o suficiente de cada diluição para "mais F-actina" e "nenhuma F-actina" amostras.
   3. Preparar amostras (como na secção 4), diluindo a proteína de interesse para as concentrações desejadas em 1x tampão de reacção em tubos de ultracentrífuga. Mantenha os volumes de amostra baixos (40-60 μL) para evitar o uso de grandes quantidades de proteína usando ultracentrosTubos de irrigação com pequenos volumes mínimos ( por exemplo , tubos de 7 x 20 mm que contenham 0,2 mL cada).
      1. Adicionar F-actina à concentração final desejada para as amostras apropriadas e aumentar o volume utilizando 1x tampão de reacção. Por exemplo, para reacções de 50 μL utilizando 2 μM de actina F, certifique-se de que cada amostra contém 25 μL de proteína 2x, 10 μL de actina F 10 μM e 15 μL de tampão de reacção 1x. Incluir amostras de controlo (passos 4.4.2 e 4.4.3).
         NOTA: Para os controlos negativo e positivo, utilize uma concentração dentro da gama a ser testada (passo 5.1), idealmente perto do meio até ao extremo superior da gama ( por exemplo, 4 μM se a gama de concentração for de 0,1-10 μM).
   4. Incubar todas as amostras durante 30 min à RT.
   5. Após 30 min, remover 1/5 de cada amostra ( por exemplo, 10 μL da reação de 50 μL) e misturar com 20 μL de água e 10 μL de tampão de amostra 4x.
      NOTA: Estes são os "Total" sE serão usados ​​para gerar uma curva padrão.
   6. Coloque as amostras no rotor da ultracentrífuga. Centrifugar durante 20 min a 100 000 xg e 4 ° C.
   7. Opcionalmente, após centrifugação, retire 3/4 do sobrenadante ( por exemplo, 30 μL se o volume centrifugado for 40 μL) de cada tubo e misture com 4x tampão de amostra (10 μL neste caso) num tubo de microcentrífuga separado. Remover o sobrenadante remanescente com uma ponta de carga de gel, tomando cuidado para não perturbar o sedimento.
      NOTA: Quando se mede a afinidade de ligação, não é necessário executar o sobrenadante. No entanto, pode ser útil guardar o sobrenadante, especialmente quando se testa uma nova proteína.
   8. Remover o sobrenadante se não analisar (passo 5.7).
   9. Ressuspender o sedimento em 1 volume de 1x tampão de amostra ( por exemplo, 40 μL se o volume centrifugado for 40 μL).
      1. Adicionar tampão de amostra a todos os tubos e incubar durante pelo menos 5 min à RT.
      2. TrIturar a amostra 8-10 vezes com uma ponta de pipeta p200, lavando continuamente a área do sedimento do tubo. Raspe suavemente a ponta da pipeta sobre a pastilha durante a trituração para ajudar na ressuspensão.
   10. Transferir a proteína ressuspendida para um tubo de microcentrífuga.
       NOTA: Estas são as amostras "Pellet".
   11. Analisar as amostras de Total e Pellet por SDS-PAGE ⁸ . Executar todas as amostras em um gel, se possível; Se não, execute as amostras de peletes num gel e as amostras totais num segundo.
       NOTA: Dado o número de amostras, um sistema de gel grande é recomendado para análise. Se estiver a correr amostras em dois ou mais géis, é importante que todos os géis sejam corados de forma idêntica ( isto é, a mesma solução de Coomassie e um tempo idêntico em mancha / destain).
   12. Image Coomassie-géis manchados usando um sistema de imagem que mede a intensidade da banda de proteína em uma ampla ( ou seja, um de dois a três log) e intervalo linear. Certifique-se de que as imagensSão recolhidos sem pixels saturados.
       NOTA: Os sistemas de imagem baseados em laser oferecem a melhor sensibilidade e relação sinal / ruído.
   13. Usando ImageJ ou um programa de análise semelhante, medir a intensidade da banda de proteína e calcular a quantidade de proteína ligada.
       NOTA: Para todas as medições de amostra, use a ferramenta de seleção em ImageJ para desenhar uma região de interesse (ROI) ao redor de cada faixa e medir (analisar> Medir) a área eo valor de cinza médio. Calcule o fundo para cada gel medindo o valor médio de cinza de uma área sem amostra. Subtraia o valor de cinza médio de fundo de cada valor de cinza médio de ROI e, em seguida, multiplique pela área para obter o valor de densidade integrado para cada banda.
       1. Medir a proteína de intensidades de banda de interesse a partir das amostras Total ( Figura 2A ).
       2. Gerar uma curva padrão representando a intensidade da banda ( isto é, as medições de densidade integrada) versus a massa da proteína ( Figura2B).
       3. Medir a quantidade de proteína de interesse que co-sedimentado com F-actina (proteína co-sedimentada, Figura 2C ).
       4. Medir a quantidade de proteína de interesse que sedimentou na ausência de F-actina (sedimentação de fundo, Figura 2D ).
       5. Subtrair a sedimentação de fundo da proteína co-sedimentada ( isto é, subtrair os valores do passo 5.13.4 do passo 5.13.3) para determinar a quantidade de proteína que se liga à F-actina.
       6. Medir a quantidade de F-actina em cada pellet ( Figura 2E ). Determine a quantidade média de F-actina por amostra e, em seguida, divida cada amostra pela média para determinar a razão de F-actina em cada amostra em relação à média ( isto é, os números abaixo das faixas).
       7. Para cada amostra, divida a quantidade de proteína ligada (calculada no passo 5.13.5) pela proporção de peletes de actina F actina (passo 5.13.6) para ajustar as diferenças no grânulo.
          NOTE: Este valor é a proteína ligada normalizada.
       8. Utilize a curva padrão (passo 5.13.2) para calcular a quantidade (massa) de proteína ligada normalizada (passo 5.13.7) em cada amostra.
          NOTA: A proteína removida inicialmente (a amostra "Total"), bem como a quantidade carregada (que, a menos que toda a pastilha tenha sido carregada, será uma fracção da pastilha), deve ser contabilizada ao calcular a quantidade total de proteína Que peletizou.
       9. Determine a concentração de proteína ligada em cada amostra a partir da massa total de proteína na pastilha (calculada no passo 5.13.8) e o volume da amostra. Subtrair este valor da concentração de partida para determinar a quantidade de proteína livre. Dividir a concentração de proteína ligada pela concentração de actina (μM / μM de actina) eo gráfico versus a concentração de proteína livre para gerar uma curva de ligação ( Figura 1C ).
          OBSERVAÇÃO: Como a F-actina não é uma espécie única e uniforme,Culto para extrapolar a concentração molar de F-actina a partir da concentração de G-actina. Utilizar a concentração inicial de G-actina para determinar a quantidade de proteína ligada (μM / μM de actina) e estimar a concentração aparente de locais de ligação na reacção. A concentração de locais de ligação é normalmente menor do que a concentração de monómeros de actina na reacção porque nem toda a actina polimeriza e porque uma única molécula de proteína de ligação a actina pode fazer contacto com múltiplos monómeros no filamento de actina.
   14. Usando um programa estatístico, determine a afinidade (K _d ) e Bmax da curva de ligação usando regressão não-linear de mínimos quadrados.
       NOTA: As parcelas de Scatchard são desencorajadas para analisar dados de ligação, em parte porque podem obscurecer se a ligação está saturada e porque podem distorcer o erro experimental ¹⁰ .

Examinámos a ligação do homodímero de αE-catenina à actina F no ensaio de co-sedimentação. Uma vez que experiências anteriores demonstraram que a afinidade do homodímero de αE-catenina para a actina F é de cerca de 1 μM e do B _max próximo de ¹¹ , realizámos o ensaio com uma concentração baixa de actina F (0,2 μM em vez de 2 μM; a discussão). Uma vez que 0,2 μM está abaixo da concentração crítica, a faloidina foi adicionada para estabilizar a F-actina polimerizada a partir da G-actina de músculo esquelético de coelho (passo 3.3). Incubaram-se concentrações crescentes de homodímero de cE-catenina (0,125-12,0 uM) na presença ou na ausência de actina F 0,2 uM. As amostras foram centrifugadas, e as pastilhas resultantes foram analisadas ( Figura 1A ). Conforme esperado, o homodímero de αE-catenina co-sedimentado com F-actina acima do fundo ( Figura 1A , compara as amostras de pastilhas de F-actina com o não-F-acAmostras de pellet de estanho). A BSA foi executada como um controlo negativo ( Figura 1B ). A proteína ligada foi quantificada e plotada sobre proteína livre para calcular a afinidade da interacção ( Figura 1C ). Os dados traçados correspondem melhor a uma equação de Hill. O Kd calculado foi 2,9 μM, o Bmax foi 0,2, eo coeficiente de Hill (h) foi 4,8. Assim, o homodímero de αE-catenina liga F-actina cooperativamente com uma baixa afinidade micromolar, consistente com o trabalho anterior (um Kd de 2,9 μM contra ~ 1,0 μM) ¹¹ .

Figura 1: Ensaio de co-sedimentação de F-actina de alta velocidade. ( A ) Concentrações crescentes (0,125-12,0 μM) de homodímero de αE-catenina foram incubadas com (painéis esquerdos) ou sem (painéis direitos) F-actina 0,2 μM estabilizada com phalloidiN. Incubaram-se durante 30 min à RT e centrifugaram-se. O total (7,5% do material de partida) e o material peletizado (50% do material peletizado) foram separados por SDS-PAGE e corados com corante de Coomassie. ( B ) 4 μM BSA foi executado como um controlo negativo. As amostras totais e em pellets, com (+) ou sem (-) F-actina, foram separadas por SDS-PAGE e coradas com corante de Coomassie. ( C ) Ligou-se αE-catenina (μM / μM de actina) a partir de A contra cE-catenina livre (μM), e os dados encaixam-se numa equação de Hill (linha vermelha). Os coeficientes Kd, Bmax e Hill (h) estão listados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Quantificação de peletização de actina - fluxograma. Este esquema descreve as etapas chave na seção 5, com exemplos de amostras de Total e Pellet ( A , CE ) e a curva padrão ( B ) usada para quantificação. 5.13 etapas: 1 ) Medir a quantidade de proteína de interesse nas amostras totais (A). 2 ) Gerar uma curva padrão, traçando a intensidade da banda versus a massa da proteína (B). 3 ) Meça a quantidade de proteína de interesse co-sedimentada com F-actina ( C ). 4 ) Meça a quantidade de proteína de interesse que sedimentou na ausência de F-actina ( D ). 5 ) Subtrair D de C para determinar a quantidade de proteína ligada a F-actina. 6 ) Medir a quantidade de F-actina em cada pellet (E), calcular a quantidade média de F-actina por amostra e dividir cada amostra pela média (os números abaixo mostram a razão). 7 )Para cada amostra, divida-se a quantidade de proteína ligada (calculada no passo 5) pela razão de peletes de F-actina (calculada no passo 6) para ajustar as diferenças no grânulo. 8 ) Utilizar a curva padrão ( B ) para calcular a quantidade (massa) de proteína ligada normalizada em cada amostra (passo 7). 9 ) Determine a concentração de proteína livre e proteína ligada para criar uma curva de ligação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O ensaio de co-sedimentação de actina é uma técnica direta que pode determinar rapidamente se uma proteína se liga à F-actina. Com algumas modificações, a técnica também pode ser usada para medir a afinidade da interação. Além dos pontos levantados no protocolo acima, as questões a seguir devem ser consideradas ao projetar, conduzir e interpretar o ensaio.

Proteína de Interesse

Pode utilizar-se uma proteína recentemente preparada ou congelada no ensaio. Se for utilizada proteína congelada, recomenda-se que os resultados sejam comparados com proteínas frescas (nunca congeladas) para assegurar que o congelamento não afecte a ligação da F-actina.

G-actina Fonte

Muitas experi�cias de granula�o utilizam G-actina isolada do m�culo devido �sua abund�cia relativa. Existem três principais isotipos de actina em mamíferos - alfa, beta e gama - que são notavelmente semelhantes (> 90%Ty). No entanto, existem diferenças funcionais entre os isotipos ^{12 , 13} . Se possível, o isotipo G-actina utilizado no ensaio de ligação deve corresponder ao isotipo in vivo . Por exemplo, se testar uma proteína expressa no músculo esquelético, alfa-actina é a melhor escolha; Se examinar uma proteína expressa em fibroblastos, beta-actina é recomendada.

Uso de Phalloidin

Uma vez que a faloidina se liga à F-actina, pode interferir ou mesmo bloquear a ligação de algumas proteínas de ligação a F-actina ( por exemplo, a faloidina bloqueia a cofilina da ligação a filamentos de actina) ¹⁴ . Assim, phalloidin deve ser usado com cautela e os resultados em comparação com não-phalloidin-tratados amostras quando possível.

Fundo alto

Não é raro que as proteínas se sedimentem na ausência de F-actina ( Figura 1A , nenhuma amostra de peletes de F-actinaS). No entanto, níveis elevados de sedimentação de fundo podem mascarar a verdadeira co-sedimentação de actina e tornar difícil, se não impossível, determinar se uma proteína se liga à F-actina ou medir a afinidade da interação. Adicionar polidicanol ao tampão de reacção (passo 4.1) pode reduzir significativamente o fundo e é uma solução fácil. Se isso não reduzir o fundo, o ajuste do tampão de reação, da concentração de sal e / ou da temperatura de incubação pode ajudar.

Curva de encadernação

Para gerar uma curva de ligação, é necessário variar a concentração quer da proteína de interesse quer da F-actina através de uma série de reacções. Na prática, é mais fácil e preferível manter F-actina numa concentração fixa e variar a concentração da proteína de interesse. A manutenção da F-actina numa concentração fixa ( por exemplo, 2 μM) no ensaio de peletização limita a captura não específica em concentrações mais elevadas de F-actina e impedeDepolimerização a concentrações mais baixas (<0,5 μM) de F-actina. A despolimerização pode ser prevenida usando phalloidin, embora isto introduza um fator de complicação potencial no sistema (veja o passo 3.3 e acima). A manutenção da F-actina numa concentração fixa também permite comparar (e normalizar) a pastilha de actina F entre amostras e identificar experiências falhadas ( isto é, onde a pastilha de actina F é altamente variável, impedindo a análise entre concentrações). Finalmente, manter F-actina numa concentração fixa permite determinar se a ligação ao filamento de actina é cooperativa ( Figura 1C ).

Ligação saturada

Tal como em todas as experiências de ligação, é crítico que a ligação à F-actina esteja saturada e que a concentração de proteína mais platinas de F-actina ( Figura 1C ). Sem um platô, não é possível calcular uma constante de equilíbrio de dissociação precisa. Assim,É importante planejar cuidadosamente a série de diluição a ser testada e sempre incluir concentrações mais altas de proteína ( ou seja, pelo menos 5- a 10 vezes maior do que o esperado K _d ).

Análise de ligação

Para que as constantes de dissociação medidas sejam conclusivas, o ensaio deve ser realizado utilizando uma concentração de actina F que permita que a concentração dos locais de ligação na actina F para a proteína de interesse seja muito mais baixa do que a afinidade. Para verificar se este critério foi atingido, estimar a concentração de locais de ligação de B _max . Por exemplo, se [F-actina] fosse 2 μM e _Bmax = 0,5, então [locais de ligação] ≈ 1 μM. O Kd deve ser pelo menos 5- a 10 vezes maior do que [locais de ligação]. Se o Kd medido é da mesma ordem de grandeza que [locais de ligação], então é possível que a curva de ligação observada represente uma titulação de ligação de alta afinidade siEm vez de uma verdadeira isoterma de ligação. Se isto for observado, repetir o ensaio usando uma concentração de F-actina 10 vezes menor para medir uma afinidade precisa. Para interações de alta afinidade, a estabilização da faloidina (etapa 3.3) pode ser necessária para se obter uma concentração de F-actina suficientemente baixa para medir com precisão a afinidade.

Finalmente, existem limitações fundamentais com o ensaio de co-sedimentação que os pesquisadores devem estar cientes de quando realizar e avaliar o ensaio. Mais importante ainda, o ensaio de co-sedimentação não produz uma verdadeira constante de equilíbrio. Os produtos de ligação ( isto é, proteína mais F-actina) são separados dos reagentes durante a centrifugação, após o que os produtos podem então dissociar-se para criar um novo equilíbrio. Como resultado, o ensaio de co-sedimentação pode calcular mal ou não detectar interacções de baixa afinidade. Uma vez que muitas proteínas de ligação à actina têm uma afinidade baixa ( isto é, micromolar) para a actina F, um resultado negativo ( isto é, nenhuma ligação detectável) no ensaio não significa necessariamente que uma proteína não se liga à F-actina. Como alternativa, os ensaios de ligação de filamento único com base em microscopia TIRF são mais sensíveis e mais precisos para determinar uma constante de dissociação (para revisões nesta técnica, ver referências ¹⁵ , ¹⁶ ). Apesar destas limitações, o ensaio de granulação está dentro dos meios da maioria dos investigadores e é uma ferramenta eficaz para determinar se uma proteína liga F-actina e para medir a afinidade da interacção.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health Grant HL127711 para AVK.