通过共沉淀测量蛋白与F-肌动蛋白的结合

该方案描述了一种测试蛋白质与丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）共沉淀的能力的方法，并且如果观察到结合，则测量相互作用的亲和力。

细胞内的丝状肌动蛋白（F-actin）组织受大量控制肌动蛋白成核，生长，交联和/或拆解的肌动蛋白结合蛋白的调节。该方案描述了一种技术 - 肌动蛋白共沉淀或造粒，测定 - 以确定蛋白质或蛋白质结构域是否结合F-肌动蛋白并测量相互作用的亲和力（ 即解离平衡常数）。在该技术中，首先将感兴趣的蛋白质与溶液中的F-肌动蛋白一起温育。然后，使用差速离心法沉淀肌动蛋白丝，通过SDS-PAGE分析沉淀物。如果感兴趣的蛋白质结合F-肌动蛋白，它将与肌动蛋白丝共沉淀。可以量化结合反应的产物（ 即， F-肌动蛋白和目的蛋白）以确定相互作用的亲和力。肌动蛋白造粒测定法是一种简单的确定方法如果感兴趣的蛋白质结合F-肌动蛋白，并评估该蛋白质如配体结合的变化如何影响其与F-肌动蛋白的相互作用。

肌动蛋白是必需的细胞骨架蛋白，在多种细胞过程中起关键作用，包括运动，收缩，粘附和形态¹ 。肌动蛋白以两种形式存在:单体球状肌动蛋白（G-actin）和聚合丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）。在细胞内，F-肌动蛋白组织由大量蛋白质控制，其调节肌动蛋白丝2,3,4的成核，生长，交联和分解。然而，多种肌动蛋白结合蛋白如何协调一致地调节肌动蛋白网络组织仍然在很大程度上不清楚。

蛋白质 - 蛋白质相互作用的测量是了解蛋白质在生物化学水平上如何发挥其对细胞行为的影响的重要途径。许多不同的测定法可用于检测纯化蛋白质之间的相互作用。可溶性蛋白质的常见方法包括下拉，荧光偏振，等温滴定量热法和表面等离子体共振。重要的是，所有这些测定都需要蛋白质可溶，因此难以适应与聚合物丝状蛋白质如F-肌动蛋白一起使用。在这里，我们描述了一种技术 - 肌动蛋白共沉淀或造粒，测定 - 以确定蛋白质或蛋白质结构域是否结合F-肌动蛋白并测量相互作用的亲和力。

肌动蛋白造粒测定是一种相对简单的技术，除了超速离心机外，不需要专门的设备。所有的试剂都可以根据基础生物化学知识或购买。一旦与F-肌动蛋白结合，该测定可用于测量表观亲和力（ 即解离平衡常数）。此外，一旦建立亲和力，就进行造粒测定是测量感兴趣蛋白质（ 即翻译后修饰，突变或配体结合）的变化如何影响其与F-肌动蛋白⁶的相互作用的有用工具。该技术在尝试测定之前确实存在研究人员应该注意的限制（参见讨论 ）。

准备材料

1. 净化感兴趣的蛋白质（见第2部分）。
2. 准备或购买G-肌动蛋白。
   注意:G-肌动蛋白可以从多个来源分离¹ ;或者，可以购买。重组的G-肌动蛋白（在5mM Tris pH 8.0,0.2mM CaCl 2，0.2mM ATP（三磷酸腺苷）和0.5mM二硫苏糖醇（DTT）中）应该被快速冷冻，储存在-80℃和> 10mg / mL在小（10-20μL）等分试样中，并在使用前解冻。不要将G-肌动蛋白等分试样重新冷冻。
3. 准备或购买对照蛋白，如BSA（参见步骤4.4）。
4. 制备10倍聚合缓冲液（200mM咪唑pH 7.0,1M KCl，20mM MgCl 2，5mM ATP和10mM EGTA（乙二醇 - 双（β-氨基乙基醚）-N，N，N'四乙酸））。制成10x原料，加入ATP后调节pH值，必要时。等分（25μL是有用的体积）并存储在-80＆＃176℃。
5. 制备10x反应缓冲液（200mM咪唑pH 7.0,1.5M NaCl，20mM MgCl 2，5mM ATP和10mM EGTA）。制成10x原料，加入ATP后调节pH值，必要时。等分试样（50-100μL是有用的体积），并储存在-80℃。
   注意:反应缓冲液的组成是柔性的，可能需要调整以减少背景沉淀，限制非特异性结合和/或改善结合（步骤1.5.1-1.5.3）。
   1. 调整反应缓冲液的pH值在6和8之间以优化蛋白质的稳定性。在较低或较高的pH值下，用适当的缓冲液代替咪唑。
      注意:使用pH 7.0作为起点，除非蛋白质需要更低或更高的pH值才能稳定。不要使用pH低于6.0或高于8.0的缓冲液，因为这可能会扰乱肌动蛋白。推荐的缓冲液（终浓度和最佳pH列出）包括:20mM MOPS（3-（ N-吗啉代）丙磺酸），pH= 6.5; 20mM咪唑，pH = 7.0; 10mM HEPES（4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸），pH = 7.5;和20mM Tris，pH = 8.0。
   2. 根据测定的需要，改变反应缓冲液的盐浓度。
      注意:肌动蛋白是一种酸性蛋白质，几乎所有的肌动蛋白结合蛋白在一定程度上依赖于与肌动蛋白相关的静电相互作用。因此，在大多数情况下，增加盐浓度会降低肌动蛋白的结合。反应缓冲液使用生理盐水（150 mM NaCl，工作浓度），这是推荐的起点。如果需要，盐浓度可以降低（ 例如， 100mM）以促进结合或增加以限制结合。
   3. 不要改变反应缓冲液中MgCl ₂ ，ATP或EGTA的浓度，除非有特定的原因。

2.准备测试蛋白质用于测定

1. Preparea高纯度蛋白质使用液相色谱法获得最佳效果⁷ 。
   注意:如果使用重组蛋白，应通过蛋白酶切割靶蛋白来去除大量蛋白质标签，如谷胱甘肽-S-转移酶（GST），因为它们会干扰结合。 GST还引起融合蛋白的同二聚化，这可以人为增加肌动蛋白结合的亲和力。
2. 通过测量280nm处的吸光度来确定蛋白质浓度。除以消光系数;可以使用序列分析或在线工具从蛋白质序列计算消光系数。或者，使用Bradford或BCA（二喹啉酸）方法测定蛋白质浓度。
   注意:对于初始实验，20-40μM的50-100μL蛋白质通常是足够的。这将允许分析低微摩尔范围内的结合，这是大多数肌动蛋白结合蛋白的有用起点。更大的一个并且通常需要较高浓度的蛋白质以产生结合曲线以计算亲和力（参见第5节）。
3. 在使用之前，将蛋白质硬转化（在4℃下50,000-100,000xg 10分钟）以除去不溶性蛋白质的聚集体。如果是溶解度，离心后重新测量蛋白质浓度（步骤2.2）。

3.准备F-肌动蛋白

1. 从-80°C冰箱中取出G-肌动蛋白等分试样，并迅速解冻。
2. 将10倍聚合缓冲液加入到G-肌动蛋白中至终浓度为1倍。确保1x聚合缓冲液中的G-肌动蛋白浓度至少为10-20μM，远高于临界浓度。在室温（RT）孵育1小时以使肌动蛋白聚合。
3. 聚合后，将F-肌动蛋白储存在4℃的溶液中，保持稳定数周。在储存后再次使用F-肌动蛋白后，轻轻倒转或者将管子轻轻松开以确保所有肌动蛋白溶解并均匀分布在溶液中。
   注:（可选）添加鬼笔环肽以达到摩尔比为1:1的G-肌动蛋白:鬼笔环肽。在室温下孵育30分钟，以使鬼笔环肽与F-肌动蛋白结合。鬼笔环肽稳定F-肌动蛋白并完成两件事情:（i）减少在离心过程中不沉淀的肌动蛋白的量，（ii）它允许将F-肌动蛋白稀释到临界浓度（〜0.5μM）以下如果改变F-肌动蛋白的量以产生结合曲线（参见关于测量亲和力的第5节），则是必需的。

造血细胞测定 - 基本方案

注意:第4节中描述的基本方案用于确定感兴趣的蛋白质是否与F-肌动蛋白共沉淀。一旦建立了与F-肌动蛋白的结合，则可以按照第5节中描述的方案来测量该相互作用的亲和力。

1. 通过将10x原料稀释至1x并加入DTT至终浓度为1 mM，将反应缓冲液制备成使用日。
   注:（可选）在反应缓冲液中加入最终工作浓度为0.02％的聚多卡醇。波立多醇是减少非特异性背景结合并有助于防止疏水性蛋白质粘附到超速离心管的表面活性剂。
2. 在超离心管中，将1x目的浓度的目标蛋白稀释至1x反应缓冲液中。保持样品体积低（40-60μL），以避免使用大量的蛋白质，通过使用体积小的超离心管（ 例如 ，每个保持0.2 mL的7 x 20 mm管）。
   注意:由于许多肌动蛋白结合蛋白对微摩尔范围内的F-肌动蛋白具有亲和力，所以建议以2和10μM测试感兴趣的蛋白质。如果在10μM未观察到结合，则在较高浓度下不可能观察到结合。如果添加的蛋白质占最终反应体积的10-20％以上，可能需要在进行实验之前将蛋白质透析到反应缓冲液中。
3. 将F-肌动蛋白加入到所需的最终浓度。
   注意:2μM是初始实验的有用浓度，因为它远远高于临界浓度，从而保持肌动蛋白处于丝状状态。当通过SDS-PAGE（步骤4.10）分析时，它将产生可见的颗粒。
4. 在超速离心管中准备以下控制以使测定信息丰富。
   1. 准备含有没有F-肌动蛋白的目的蛋白质的样品。确保这些样品中的蛋白质浓度与"加F-肌动蛋白"样品中的浓度相符。
      注意:这些样品将确定在没有F-肌动蛋白的情况下聚集或粘附在超离心管侧面的蛋白质的量。
   2. 准备阴性对照样品以与用于感兴趣的蛋白质相同或相似的浓度。使用不含F-肌动蛋白的不结合F-肌动蛋白的对照蛋白。
      注意:这是一个重要的控制，因为即使蛋白质不结合F-肌动蛋白，蛋白质可以在肌动蛋白丝和F-肌动蛋白沉淀中被"捕获"。捕获的量可以根据F-肌动蛋白源，缓冲液条件等而变化。因此，该控制应包括在所有实验中。理想情况下，对照蛋白应具有与感兴趣的蛋白质相似的分子量（ 例如 ，对于αE-连环蛋白（〜100kDa），BSA（66kDa）是适当的对照）。商业上可获得的凝胶过滤标准品制备出优异的对照蛋白质，因为它们涵盖一定范围的尺寸，并且倾向于不含聚集体。
   3. 任选地，制备含有和不含F-肌动蛋白的含有结合F-肌动蛋白的蛋白质的阳性对照样品。确保浓度类似于e蛋白质。
      注意:该控制有助于证明实验条件（ 例如，制备的F-肌动蛋白，反应缓冲液和离心）允许F-肌动蛋白结合。由于造粒测定法不能检测到弱F-肌动蛋白相互作用（参见讨论），建议已知的F-肌动蛋白结合蛋白对F-肌动蛋白具有中等至弱的亲和力（ 即，在低微摩尔范围内）。纯化的F-肌动蛋白结合蛋白是可商购的。
5. 在室温下孵育所有样品30分钟。
   注意:假设感兴趣的蛋白质是稳定的，尽管可能不必要，培养时间更长。如果感兴趣的蛋白质在RT时不稳定，则样品可以在4℃下孵育。在这种情况下，可能需要较长的孵育时间。
6. 将样品装入离心机转子。将管置于转子内，以​​帮助离心后将沉淀物重新悬浮。为此，请标记所有离心管（ 例如，带有样品编号），并将转子中的所有管放置在相同的位置（ 例如，数字朝外）。
7. 在超速离心机中，在4℃下以100,000xg离心20分钟。
8. 离心后，从每个管中取出3/4的上清（ 例如 ，起始体积为60μL的45μL），并与1/3体积的4x样品缓冲液（在这种情况下为15μL）混合在一个单独的微量离心管中。
   1. 用凝胶加载尖端去除剩余的上清液，注意不要打扰颗粒（可能是玻璃状斑点）。
      注意:在离心机运行完成后尽快从管中除去上清液以限制分离后的蛋白质解离是重要的。同样的原因，不要用反应缓冲液清洗沉淀物。
9. 向每个颗粒添加4/3体积的1x样品缓冲液t（如果起始体积为60μL，则为80μL）。
   注意:这使得稀释与上清液相同（步骤4.8，加入1/3体积的4x样品缓冲液），允许沉淀和上清液样品之间的直接比较和测定造粒的蛋白质的百分比。
   1. 将样品缓冲液加入所有试管中，并在室温孵育至少5分钟。让颗粒置于样品缓冲液中以改善样品回收率。
   2. 用p200移液管尖端将样品研磨8-10次，通过连续洗涤管的颗粒区域重新悬浮沉淀。在研磨过程中，将移液管末端轻轻刮去，以帮助重悬。
      注意:注意避免在研磨过程中将空气引入样品，因为这将导致样品缓冲液起泡，并会降低样品回收率。
   3. 研磨后将再悬浮的样品转移到微量离心管中。
   4. 通过SDS-PAGE和考马斯染色⁸分析上清液和沉淀样品，每泳道加载10-15μL样品;这足以使蛋白质可视化。
      注意:与F-肌动蛋白共沉淀的蛋白质将在"无F-肌动蛋白"颗粒样品中富集"加F-肌动蛋白"颗粒样品（ 图1A ）。如果蛋白质浓度在0.1-10μM范围内，则标准考马斯蓝染色足以检测。如果使用较低的蛋白质浓度来测量更高亲和力的相互作用，则可以使用胶体考马斯⁹或Western印迹来提高灵敏度。
   5. 图像使用扫描仪或成像系统的考马斯染色凝胶（步骤5.12）。

   造粒测定 - 定量

   注意:如果观察到与F-肌动蛋白的特异性结合，则可以测量t的亲和力他互动。这是通过对第4节中概述的协议进行一些修改和补充来实现的。有关设计和解释结合测定的优秀指南，请参阅Pollard ¹⁰ 。提供了流程图（ 图2 ），以帮助分析和量化。

   1. 确定要测试的浓度范围。
      注意:浓度范围将取决于蛋白质，并且应该从低于表观K _d （ 例如 1μM）的浓度延伸到足够高的饱和结合浓度。重要的是，在浓度范围的高端，多个样品的结合达到饱和，以产生精确的结合曲线（ 图1C ）。如上所述，许多肌动蛋白结合蛋白在低微摩尔范围（1-5μM）中对F-肌动蛋白具有亲和力。对于K _d为0.5-1μM的蛋白质，有用的起始浓度范围为0.1-10μM。
   2. 硬旋转（步骤2.3）感兴趣的蛋白质去除聚集体。连续稀释蛋白质，使含有7-8个样品的浓度系列以2x的最终浓度测试。例如，如果要测试的范围为0.1-8μM，则在1x反应缓冲液中制备以下稀释液:16,8,4,2,1,0.5和0.2μM。
      注意:如步骤4.2中所述，如果添加的蛋白质占第一稀释度的10％-20％（上述实施例中的16μM样品），可能需要进一步浓缩蛋白质或透析蛋白质转变成1x反应缓冲液。确保为"加F-肌动蛋白"和"无F-肌动蛋白"样品准备足够的每种稀释液。
   3. 通过在超离心管中的1x反应缓冲液中稀释目的蛋白质至所需浓度来制备样品（如第4部分）。保持样品体积低（40-60μL），以避免使用大量的蛋白质通过使用超薄具有最小体积（ 例如 ，每个保持0.2mL的7×20mm管）的步枪管。
      1. 将F-肌动蛋白添加到合适样品的所需最终浓度，并使用1x反应缓冲液调出体积。例如，对于使用2μMF-肌动蛋白的50μL反应，确保每个样品具有25μL的2x蛋白质，10μL的10μMF-肌动蛋白和15μL的1x反应缓冲液。包括对照样品（步骤4.4.2和4.4.3）。
         注意:对于阴性和阳性对照，使用要测试的范围内的一个浓度（步骤5.1），理想情况下，接近中间至高端范围（如果浓度范围为0.1-10μM，则为4μM）。
   4. 在室温下孵育所有样品30分钟。
   5. 30分钟后，取出每个样品的1/5（ 例如， 10μL的50μL反应），并与20μL的水和10μL的4x样品缓冲液混合。
      注意:这些是"总计"将用于生成标准曲线。
   6. 将样品装入超速离心机转子。在100,000 xg和4℃下离心20分钟。
   7. 离心后，取出3/4的上清液（ 如离心体积为40μL，每孔30μL），并与4x样品缓冲液（在这种情况下为10μL）混合，并分离出离心管。用凝胶加载尖端去除剩余的上清液，注意不要打扰沉淀。
      注意:当测量结合亲和力时，不需要运行上清液。然而，保存上清液可能是有用的，特别是在测试新蛋白质时。
   8. 如果不分析，则取出上清液（步骤5.7）。
   9. 将沉淀重悬于1体积的1x样品缓冲液中（如果离心体积为40μL，则为40μL）。
      1. 将样品缓冲液加入所有试管中，并在室温孵育至少5分钟。
      2. TR用p200吸头提取样品8-10次，连续洗涤管的颗粒区域。在研磨过程中，将移液管末端轻轻刮去，以帮助重悬。
   10. 将再悬浮的蛋白质转移到微量离心管中。
       注意:这些是"Pellet"样品。
   11. 通过SDS-PAGE ⁸分析Total和Pellet样品。如果可能，运行一个凝胶上的所有样品;如果没有，在一个凝胶上运行颗粒样品，并在一秒钟内运行总样品。
       注意:鉴于样品数量，推荐使用大型凝胶系统进行分析。如果在两个或多个凝胶上运行样品，重要的是所有凝胶都被染色相同（ 即，相同的考马斯溶液和相同的染色/脱色时间）。
   12. 图像考马斯染色的凝胶使用成像系统，测量宽（ 即，两到三对数）和线性范围内的蛋白质带强度。确保图像a没有饱和像素收集。
       注意:基于激光的成像系统提供最佳的灵敏度和信噪比。
   13. 使用ImageJ或类似的分析程序，测量蛋白质带强度并计算结合蛋白的量。
       注意:对于所有样本测量，使用ImageJ中的选择工具绘制每个频带周围的感兴趣区域（ROI），并测量（分析>测量）区域和平均灰度值。通过从没有样品的区域测量平均灰度值来计算每个凝胶的背景。从每个ROI平均灰度值减去背景平均灰度值，然后乘以面积以获得每个频带的积分密度值。
       1. 从总样本测量感兴趣的蛋白质带强度（ 图2A ）。
       2. 通过绘制带强度（ 即综合密度测量）与蛋白质质量的关系来生成标准曲线（ 图2B）。
       3. 测量与F-肌动蛋白共沉淀的感兴趣蛋白质的量（共沉淀蛋白， 图2C ）。
       4. 测量在不存在F-肌动蛋白时沉淀的感兴趣的蛋白质的量（背景沉淀， 图2D ）。
       5. 从共沉淀蛋白中减去背景沉淀（ 即从步骤5.13.3中减去步骤5.13.4的值），以确定与F-肌动蛋白结合的蛋白质的量。
       6. 测量每个颗粒中的F-肌动蛋白的量（ 图2E ）。确定每个样品的平均F-肌动蛋白量，然后将每个样品除以平均值，以确定每个样品中F-肌动蛋白与平均值之比（ 即，低于条带的数字）。
       7. 对于每个样品，通过F-肌动蛋白肌动蛋白颗粒比（步骤5.13.6）将结合的蛋白质的量（在步骤5.13.5中计算）分配以调整颗粒中的差异。
          ñOTE:该值是归一化的结合蛋白。
       8. 使用标准曲线（步骤5.13.2）计算每个样品中标准化结合蛋白的量（质量）（步骤5.13.7）。
          注意:最初去除的蛋白质（"总"样品）以及负载量（除了整个颗粒负载以外，将是颗粒的一部分），必须在计算蛋白质总量时考虑那颗颗粒。
       9. 从颗粒中的蛋白质总量（步骤5.13.8中计算）和样品的体积确定每个样品中结合蛋白的浓度。从起始浓度减去该值以确定游离蛋白的量。通过肌动蛋白的浓度（肌动蛋白的μM/μM）和阴性相对于游离蛋白的浓度分离结合蛋白的浓度以产生结合曲线（ 图1C ）。
          注意:由于F-肌动蛋白不是单一的，均匀的物种，它是diffi从G-肌动蛋白浓度推断F-肌动蛋白的摩尔浓度。使用起始G-肌动蛋白浓度来确定结合蛋白的量（肌动蛋白的μM/μM），并估计反应中结合位点的表观浓度。结合位点的浓度通常小于反应中肌动蛋白单体的浓度，因为不是所有的肌动蛋白聚合，并且因为单个肌动蛋白结合蛋白分子可以与肌动蛋白丝上的多个单体接触。
   14. 使用统计程序，通过使用非线性最小二乘回归从结合曲线确定亲和力（K _d ）和B _max 。
       注意:Scatchard图不鼓励用于分析结合数据，部分原因是它们可能会掩盖绑定是否饱和，并且可能会扭曲实验错误¹⁰ 。

我们检查了在共沉淀测定中αE-连环蛋白同源二聚体结合F-肌动蛋白。由于过去的实验已经表明，α-catenin同二聚体对F-肌动蛋白的亲和力约为1μM，B _max在^{11 11}附近，我们用低浓度的F-肌动蛋白（0.2μM而不是2μM）进行测定讨论）。由于0.2μM低于临界浓度，所以加入鬼笔环肽以稳定从兔骨骼肌G肌动蛋白聚合的F-肌动蛋白（步骤3.3）。在0.2μMF-肌动蛋白存在或不存在下培养增加浓度的αE-连环蛋白同二聚体（0.125-12.0μM）。将样品离心，并分析得到的颗粒（ 图1A ）。如预期的那样，αE-连环蛋白同二聚体与背景中的F-肌动蛋白共沉淀（ 图1A ，将F-肌动蛋白颗粒样品与无F-ac锡丸样品）。 BSA作为阴性对照（ 图1B ）。结合蛋白质被定量并绘制在游离蛋白上，以计算相互作用的亲和力（ 图1C ）。绘制的数据最适合Hill方程。计算的K _d为2.9μM，B _max为0.2，Hill系数（h）为4.8。因此，αE-连环蛋白同源二聚体以低微摩尔亲和力协同结合F-肌动蛋白，与以前的工作（2.9μM对〜1.0μM的K _d ） ^11一致 。

图1: 高速F-肌动蛋白共沉淀测定。 （ A ）将增加的浓度（0.125-12.0μM）的αE-连环蛋白同源二聚体与（左图）或没有（右图）一起孵育0.2μM用肌钙磷稳定的F-肌动蛋白ñ。将它们在室温下孵育30分钟并离心。通过SDS-PAGE分离总量（起始原料的7.5％）和沉淀物（50％的沉淀物），并用考马斯染料染色。 （ B ）作为阴性对照，运行4μMBSA。通过SDS-PAGE分离具有（+）或不含（ - ）F-肌动蛋白的总和颗粒样品，并用考马斯染料染色。 （ C ）从游离αE-连环蛋白（μM）绘制来自A的结合αE-连环蛋白（μM/μM肌动蛋白），数据拟合到Hill方程（红线）。列出了K _d ，B _max和Hill系数（h）。 请点击此处查看此图的较大版本。

图2: 肌动蛋白造粒定量 - 流程图。该示意图概述了第5节中的关键步骤，其中包括用于定量的总计和颗粒样品（ A ， CE ）和标准曲线（ B ）的实例。 5.13步骤: 1 ）测量总样品（A）中感兴趣的蛋白质的量。 2 ）通过绘制带强度与蛋白质质量（B）的关系来生成标准曲线。 3 ）测量与F-肌动蛋白（ C ）共沉淀的感兴趣的蛋白质的量。 4 ）测量不存在F-肌动蛋白（ D ）时造粒的蛋白质的量。 5 ）从C中减去D以确定与F-肌动蛋白结合的蛋白质的量。 6 ）测量每个颗粒（E）中的F-肌动蛋白的量，计算每个样品的平均F-肌动蛋白量，并将每个样品除以平均值（下面的数字显示比例）。 7 ）对于每个样品，将结合的蛋白质的量（步骤5中计算）除以F-肌动蛋白颗粒比（在步骤6中计算）以调整颗粒中的差异。 8 ）使用标准曲线（ B ）计算每个样品中标准化结合蛋白的量（质量）（步骤7）。 9 ）确定游离蛋白和结合蛋白的浓度以产生结合曲线。 请点击此处查看此图的较大版本。

肌动蛋白共沉淀测定是一种直接的技术，可以快速确定蛋白质是否结合F-肌动蛋白。通过一些修改，该技术也可以用于测量交互的亲和力。除了上述方案中提出的观点外，在设计，实施和解释测定时应考虑以下问题。

感兴趣的蛋白质

新鲜制备的或冷冻的蛋白质可用于测定。如果使用冷冻蛋白，强烈建议将结果与新鲜（未冷冻）蛋白进行比较，以确保冷冻不影响F-肌动蛋白结合。

G-肌动蛋白来源

许多造粒实验使用从肌肉中分离的G-肌动蛋白，因为其相对丰度。在哺乳动物中有三种主要的肌动蛋白同种型 - α，β和γ - 是非常相似的（> 90％序列识别TY）。尽管如此，在同种异型12,13之间存在功能差异。如果可能，结合测定中使用的G-肌动蛋白同种型应与体内同种型相符。例如，如果测试在骨骼肌中表达的蛋白质，则α-肌动蛋白是最佳选择;如果检查在成纤维细胞中表达的蛋白质，推荐使用β-肌动蛋白。

鬼伞素使用

由于鬼笔环肽结合F-肌动蛋白，它可能会干扰甚至阻断一些F-肌动蛋白结合蛋白（ 例如，鬼笔环肽嵌段cofilin与肌动蛋白丝结合）的结合。因此，谨慎使用鬼笔环肽，如果可能，结果与非鬼笔环己烷处理的样品相比。

高背景

蛋白质在不存在F-肌动蛋白的情况下沉淀是常见的（ 图1A ，没有F-肌动蛋白颗粒样品S）。然而，高水平的背景沉淀可以掩盖真正的肌动蛋白共沉淀，并且使得难以（如果不是不可能）确定蛋白质是否结合F-肌动蛋白或测量相互作用的亲和力。向反应缓冲液中加入polidicanol（步骤4.1）可以显着降低背景，是一个简单的解决方案。如果不降低背景，调整反应缓冲液，盐浓度和/或培养温度可能有所帮助。

绑定曲线

为了产生结合曲线，有必要在一系列反应中改变感兴趣的蛋白质或F-肌动蛋白的浓度。在实践中，将F-肌动蛋白维持在固定浓度并且改变目的蛋白质的浓度是更容易和优选的。在造粒测定中以固定浓度（ 例如 2μM）维持F-肌动蛋白限制在较高浓度的F-肌动蛋白上的非特异性捕获，并且防止在低于（<0.5μM）的F-肌动蛋白浓度下解聚。可以使用鬼笔环肽来防止解聚，尽管这引入了系统中潜在的复杂因素（见第3.3及以上）。维持固定浓度的F-肌动蛋白还可以使样品间的F-肌动蛋白颗粒进行比较（并标准化），并鉴定失败的实验（ 即 F-肌动蛋白颗粒高度可变，防止浓度分析）。最后，将F-肌动蛋白维持在固定的浓度允许确定与肌动蛋白丝的结合是否合作（ 图1C ）。

饱和结合

如在所有结合实验中，与F-肌动蛋白的结合是饱和的以及蛋白质加上F-肌动蛋白平台的浓度是至关重要的（ 图1C ）。没有平台，不可能计算准确的解离平衡常数。因此，它仔细规划待测试的稀释系列并且始终包含较高浓度的蛋白质（ 即，比预期的K _d高至少5至10倍）是重要的。

绑定分析

为了使测量的解离常数是确定性的，应该使用允许将F-肌动蛋白的结合位点浓集在感兴趣的蛋白质上的F-肌动蛋白浓度远低于亲和力来进行测定。为了检查是否符合此标准，估算B _max的结合位点浓度。例如，如果[F-肌动蛋白]为2μM，B _max = 0.5，则[结合位点]≈1μM。 K _d应至少比[结合位点]大5至10倍。如果测量的K _d与[结合位点]具有相同的数量级，则观察到的结合曲线可能表示高亲和力结合si的滴定而不是真正的结合等温线。如果观察到这一点，请使用10倍低F-肌动蛋白浓度重复测定以测量准确的亲和力。对于高亲和力相互作用，为了实现足够低的F-肌动蛋白浓度以精确测量亲和力，可能需要鬼笔环肽稳定（步骤3.3）。

最后，研究人员在进行和评估测定时应注意共沉淀测定的基本限制。最重要的是，共沉淀测定不会产生真正的平衡常数。在离心过程中将结合产物（ 即蛋白加F-肌动蛋白）与反应物分离，随后产物可以解离以产生新的平衡。结果，共沉淀测定可能会错误计算或不能检测到低亲和力相互作用。由于许多肌动蛋白结合蛋白对F-肌动蛋白具有低（ 即微摩尔）亲和力，所以阴性结果即，无可检测的结合）不一定意味着蛋白质不结合F-肌动蛋白。作为替代方案，基于TIRF显微镜的单丝结合测定对于确定解离常数更灵敏和更准确（对于该技术的评论，参见参考文献^15,16 ）。尽管有这些限制，造粒测定是大多数研究人员的手段，并且是确定蛋白质是否结合F-肌动蛋白并测量相互作用的亲和力的有效工具。

作者宣称他们没有竞争的经济利益。

这项工作得到了国家卫生研究院授予的HL127711给AVK的支持。