Medición de la unión de proteínas a actina F por co-sedimentación

Este protocolo describe un método para probar la capacidad de una proteína para co-sedimentar con actina filamentosa (F-actina) y, si se observa unión, para medir la afinidad de la interacción.

La organización de actina filamentosa (F-actina) dentro de las células está regulada por un gran número de proteínas de unión a actina que controlan la nucleación, crecimiento, reticulación y / o desmontaje de actina. Este protocolo describe una técnica - la co-sedimentación de actina, o granulación, ensayo - para determinar si un dominio de proteína o proteína se une a F-actina y para medir la afinidad de la interacción ( es decir, la constante de equilibrio de disociación). En esta técnica, una proteína de interés se incuba primero con F-actina en solución. A continuación, se utiliza la centrifugación diferencial para sedimentar los filamentos de actina, y el material en forma de gránulo se analiza por SDS-PAGE. Si la proteína de interés se une a la actina F, se co-sedimentará con los filamentos de actina. Los productos de la reacción de unión ( es decir, F-actina y la proteína de interés) se pueden cuantificar para determinar la afinidad de la interacción. El ensayo de granulación de actina es una técnica sencilla para determinarSi una proteína de interés se une a la actina F y para evaluar cómo los cambios en esa proteína, como la unión al ligando, afectan su interacción con la F-actina.

La actina es una proteína esencial del citoesqueleto que desempeña un papel crítico en múltiples procesos celulares, incluyendo la motilidad, la contracción, la adhesión y la morfología ¹ . La actina existe en dos formas: la actina globular monomérica (G-actina) y la actina filamentosa polimerizada (F-actina). Dentro de las células, F-actina organización está controlada por una gran colección de proteínas que regulan la nucleación, el crecimiento, reticulación y desmontaje de actina filamentos ^{2 , 3 , 4} . Sin embargo, la forma en múltiples actina vinculante proteínas funcionan en concierto para regular la actina red de organización sigue siendo en gran parte poco clara.

La medición de las interacciones proteína-proteína es un enfoque importante para entender cómo las proteínas ejercen sus efectos sobre el comportamiento celular a nivel bioquímico. Se pueden usar muchos ensayos diferentes para detectar interacciones entre proteínas purificadas.Los enfoques comunes para las proteínas solubles incluyen pull-downs, polarización de fluorescencia, calorimetría de titulación isotérmica y resonancia de plasmón superficial. Es importante destacar que todos estos ensayos requieren que las proteínas sean solubles y, por lo tanto, son difíciles de adaptar para su uso con una proteína polimérica filamentosa tal como actina F. Aquí, describimos una técnica - la co-sedimentación de actina, o granulación, ensayo - para determinar si una proteína o dominio de proteínas se une a la actina F y para medir la afinidad de la interacción.

El ensayo de granulación de actina es una técnica relativamente sencilla que no requiere equipo especializado, aparte de una ultracentrífuga. Todos los reactivos se pueden hacer, asumiendo el conocimiento de la bioquímica básica, o comprado. Una vez establecida la unión a F-actina, el ensayo puede usarse para medir la afinidad aparente ( es decir, la constante de equilibrio de disociación) ⁵ . Además, una vez que se establece una afinidad, el ensayo de granulaciónEs una herramienta útil para medir cómo los cambios en la proteína de interés ( es decir , las modificaciones post-traduccionales, mutaciones, ligando o ligando) afectan a su interacción con F-actina [ ^6] . La técnica tiene limitaciones (vea la Discusión ) que el investigador debe tener en cuenta antes de intentar el ensayo.

1. Preparar los Materiales

1. Purificar la proteína de interés (ver sección 2).
2. Preparar o comprar G-actina.
   NOTA: La G-actina puede aislarse de múltiples fuentes ¹ ; Alternativamente, se puede comprar. La G-actina reconstituida (en Tris 5 mM pH 8,0, CaCl2 0,2 ​​mM, ATP 0,2 mM (adenosina trifosfato) y ditiotreitol 0,5 mM (DTT)) se congeló de forma instantánea, se almacenó a -80ºC y geq 10 mg / ml En alícuotas pequeñas (10-20 μl), y se descongelan justo antes de su uso. Las alícuotas de G-actina no deben volver a congelarse.
3. Preparar o comprar una proteína de control, como BSA (ver paso 4.4).
4. Preparar un tampón de polimerización 10x (imidazol 200 mM a pH 7,0, KCl 1 M, MgCl2 20 mM, ATP 5 mM y EGTA 10 mM (éter de etilenglicol bis (β-aminoetil) -N, N, N ', N'- Tetraacético)). Hacer un stock 10x y ajustar el pH después de la adición de ATP, si es necesario. Alícuota (25 μL es un volumen útil) y almacenar a -80ºC & #176; C.
5. Preparar 10x tampón de reacción (imidazol 200 mM pH 7,0, NaCl 1,5 M, MgCl2 20 mM, ATP 5 mM y EGTA 10 mM). Hacer un stock 10x y ajustar el pH después de la adición de ATP, si es necesario. Alícuota (50-100 μL es un volumen útil) y almacenar a -80 ° C.
   NOTA: La composición del tampón de reacción es flexible y puede ser necesario ajustarla para reducir la sedimentación de fondo, limitar la unión no específica y / o mejorar la unión (pasos 1.5.1 - 1.5.3).
   1. Ajustar el pH del tampón de reacción entre 6 y 8 para optimizar la estabilidad de la proteína. A un pH inferior o superior, sustituir el imidazol por un tampón apropiado.
      NOTA: Utilice pH 7.0 como punto de partida, a menos que una proteína requiera un pH menor o mayor para la estabilidad. No utilice un tampón con un pH inferior a 6,0 o superior a 8,0, ya que esto puede interrumpir la actina. Los tampones recomendados (concentración final y pH óptimo listados) incluyen: MOPS 20 mM (ácido 3- ( N- morfolino) propanosulfónico), pH= 6,5; 20 mM de imidazol, pH = 7,0; HEPES 10 mM (ácido 4- (2 - hidroxietil) piperazina - 1 - etanosulfónico), pH = 7,5; Y Tris 20 mM, pH = 8,0.
   2. Varíe la concentración de sal del tampón de reacción, dependiendo de las necesidades del ensayo.
      NOTA: La actina es una proteína ácida, y casi todas las proteínas de unión a actina dependen en cierta medida de las interacciones electrostáticas para asociarse con la actina. Por lo tanto, el aumento de la concentración de sal disminuye la unión de actina en la mayoría de los casos. El tampón de reacción utiliza un nivel fisiológico de sal (NaCl 150 mM, concentración de trabajo), y este es el punto de partida recomendado. Si es necesario, la concentración de sal puede reducirse ( por ejemplo, hasta 100 mM) para promover la unión o aumentada para limitar la unión.
   3. No cambie las concentraciones de MgCl ₂ , ATP o EGTA en el tampón de reacción a menos que haya una razón específica para hacerlo.

2. Preparar la proteína de prueba para el ensayo

1. PrepararEa proteína de alta pureza mediante cromatografía líquida para obtener los mejores resultados ⁷ .
   NOTA: Si se usa proteína recombinante, las etiquetas de proteínas grandes, tales como la glutatión-S-transferasa (GST) deben eliminarse por escisión de proteasa de la proteína diana, ya que pueden interferir con la unión. GST también provoca la homodimerización de proteínas de fusión, que puede aumentar artificialmente la afinidad de la unión de actina.
2. Determine la concentración de proteína midiendo la absorbancia a 280 nm. Dividir por el coeficiente de extinción; El coeficiente de extinción se puede calcular a partir de la secuencia de proteínas usando análisis de secuencias o herramientas en línea. Alternativamente, determine la concentración de proteína usando métodos de Bradford o BCA (ácido bicinconínico).
   NOTA: Para los experimentos iniciales, generalmente son suficientes 50-100 μl de proteína a 20-40 μM. Esto permitirá el análisis de la unión en el rango micromolar bajo, un punto de partida útil para la mayoría de proteínas de unión a actina. Un quan más grandeY muchas veces se necesita una mayor concentración de proteína para generar una curva de unión para calcular la afinidad (véase la sección 5).
3. Justo antes del uso, centrifugación fuerte de la proteína (50.000-100.000 xg durante 10 min a 4 ° C) para eliminar los agregados de proteína insoluble. Si la solubilidad es un problema, vuelva a medir la concentración de proteína (paso 2.2) después de la centrifugación.

3. Prepare la F-actina

1. Retire una alícuota de G-actina del congelador de -80 ° C y descongelar rápidamente.
2. Añadir el tampón de polimerización 10x a la G-actina hasta una concentración final de 1x. Asegúrese de que la concentración de G-actina en tampón de polimerización 1x es de al menos 10-20 μM, muy por encima de la concentración crítica. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente (RT) para permitir que la actina se polimerice.
3. Después de la polimerización, almacenar la F-actina en solución a 4 ° C, donde será estable durante algunas semanas. Antes de usar la F-actina nuevamente después del almacenamiento, invierta suavementeO chasquear el tubo varias veces para asegurarse de que toda la actina se disuelva y se distribuya uniformemente en solución.
   NOTA: (Opcional) Añadir phalloidin para lograr una proporción molar de 1: 1 de G-actina: phalloidin. Incubar durante 30 min a RT para permitir que la faloidina se una a la F-actina. La phalloidin estabiliza la actina F y realiza dos cosas: (i) reduce la cantidad de actina que no sedimenta durante la centrifugación y (ii) permite diluir la actina F por debajo de la concentración crítica (~ 0,5 μM), lo que suele ser Necesaria para variar la cantidad de F-actina para generar una curva de unión (véase la sección 5 sobre la medición de la afinidad).

4. Ensayo de granulación - Protocolo Básico

NOTA: El protocolo básico descrito en la sección 4 se utiliza para determinar si una proteína de interés co-sedimentos con F-actina. Una vez establecida la unión a F-actina, la afinidad de esta interacción puede medirse siguiendo el protocolo descrito en la sección 5.

1. Preparar el tampón de reacción el día de uso diluyendo el stock 10x a 1x y añadir DTT a una concentración final de 1 mM.
   NOTA: (Opcional) Añada polidocanol a una concentración final de 0,02% en el tampón de reacción. El polidocanol es un surfactante que reduce la unión de fondo no específica y ayuda a evitar que las proteínas hidrófobas se peguen al tubo de ultracentrífuga.
2. Diluir la proteína de interés a las concentraciones deseadas en tampón de reacción 1x en tubos de ultracentrífuga. Mantenga los volúmenes de muestra bajos (40-60 μL) para evitar el uso de grandes cantidades de proteína usando tubos de ultracentrífuga con pequeños volúmenes mínimos ( por ejemplo , tubos de 7 x 20 mm que contengan 0,2 ml cada uno).
   NOTA: Dado que muchas proteínas de unión a actina tienen una afinidad por la actina F en el intervalo micromolar, se recomienda ensayar una proteína de interés a 2 y 10 μM. Si no se observa unión a 10 μM, es poco probable que se observe unión a concentraciones más altas. Si elLa proteína añadida constituye más del 10-20% del volumen de reacción final, puede ser necesario dializar la proteína en el tampón de reacción antes de realizar el experimento.
3. Añadir F-actina a la concentración final deseada.
   NOTA: 2 μM es una concentración útil para los experimentos iniciales porque está muy por encima de la concentración crítica, manteniendo así la actina en el estado filamentoso. Producirá un gránulo visible cuando se analiza mediante SDS-PAGE (etapa 4.10).
4. Preparar los siguientes controles en tubos de ultracentrífuga para hacer el ensayo informativo.
   1. Preparar muestras que contengan la proteína de interés sin F-actina. Asegúrese de que la concentración de proteína en estas muestras coincida con la concentración en las muestras de "más F-actina".
      NOTA: Estas muestras determinarán la cantidad de proteína que se agrega o se pega a los lados del tubo de ultracentrífuga en ausencia de F-actina.
   2. Preparar muestras de control negativoA la misma concentración o concentraciones similares utilizadas para la proteína de interés. Utilice una proteína de control que no se una a F-actina, con y sin F-actina.
      NOTA: Este es un importante control porque las proteínas pueden quedar atrapadas en filamentos de actina y pellets con F-actina, aunque no se unan a la F-actina. La cantidad de atrapamiento puede variar dependiendo de la fuente de actina F, las condiciones del tampón, etc. De este modo, este control debe incluirse en todos los experimentos. Idealmente, la proteına de control deberıa tener un peso molecular similar a la proteına de interés ( por ejemplo , para αE-catenina (~ 100 kDa), BSA (66 kDa) es un control apropiado). Los estándares de filtración en gel comercialmente disponibles constituyen excelentes proteínas de control, ya que cubren una gama de tamaños y tienden a no contener agregados.
   3. Opcionalmente, preparar muestras de control positivo que contengan una proteína que se une a F-actina, con y sin F-actina. Asegúrese de que la (s) concentración (es) son similares a las deE proteína de interés.
      NOTA: Este control es útil porque demuestra que las condiciones experimentales ( p. Ej., F-actina preparada, tampón de reacción y centrifugación) permiten la unión de F-actina. Dado que el ensayo de granulación puede fallar en la detección de interacciones de F-actina débiles (véase la Discusión), se recomienda que la proteína de unión a actina F conocida tenga una afinidad moderada a débil por la actina F ( es decir, en el intervalo micromolar bajo ). Las proteínas purificadoras de unión a actina F están comercialmente disponibles.
5. Incubar todas las muestras durante 30 min a RT.
   NOTA: Los tiempos de incubación más largos están bien, suponiendo que la proteína de interés es estable, aunque probablemente innecesaria. Si la proteína de interés no es estable a RT, entonces las muestras pueden incubarse a 4 ° C. En este caso, pueden ser necesarios tiempos de incubación más largos.
6. Cargar las muestras en el rotor de la centrifugadora. Coloque los tubos dentro del rotor para ayudar a resuspender el gránulo después de la centrifugación.Para ello, marque todos los tubos de centrífuga ( por ejemplo, con un número de muestra) y coloque todos los tubos en el rotor en la misma posición ( por ejemplo, el número hacia fuera).
7. Centrifugar a 100.000 xg durante 20 minutos a 4 ° C en una ultracentrífuga.
8. Después de la centrifugación, retirar 3/4 del sobrenadante ( por ejemplo , 45 μl si el volumen de partida era 60 μl) de cada tubo y mezclar con 1/3 volúmenes de tampón de muestra 4x (15 μL en este caso) en un tubo de microcentrífuga separado.
   1. Quitar el sobrenadante restante con una punta de carga de gel, teniendo cuidado de no perturbar el gránulo (que puede ser visible como un punto vítreo).
      NOTA: Es importante eliminar el sobrenadante de los tubos tan pronto como sea posible después de la finalización de la centrifugación para limitar la disociación de proteínas después de la separación. Además, no lave el pellet con tampón de reacción por la misma razón.
9. Añadir 4/3 volúmenes de 1x buffer de muestra a cada pelleT ( por ejemplo , 80 μl si el volumen de partida era 60 μl).
   NOTA: Esto hace que la dilución sea la misma que para el sobrenadante (paso 4.8, 1/3 de volúmenes de tampón de muestra 4x), permitiendo la comparación directa entre las muestras de pellets y sobrenadantes y la determinación del porcentaje de proteína que se sedimentó.
   1. Añadir tampón de muestra a todos los tubos e incubar durante al menos 5 min a RT. Permitir que el sedimento para sentarse en el buffer de muestra para mejorar la recuperación de la muestra.
   2. Triturar la muestra 8-10 veces con una punta de pipeta p200 para resuspender el gránulo lavando continuamente el área de gránulo del tubo. Raspe suavemente la punta de la pipeta sobre el pellet durante la trituración para ayudar con la resuspensión.
      NOTA: Tenga cuidado de evitar la introducción de aire en la muestra durante la trituración, ya que esto hará que el buffer de muestra burbujee y reducirá la recuperación de la muestra.
   3. Transferir las muestras resuspendidas a tubos de microcentrífuga después de la trituración.
   1. Analizar las muestras de sobrenadante y sedimento por SDS-PAGE y tinción ⁸ de Coomassie cargando 10-15 μl de muestra por carril; Esto es suficiente para visualizar las proteínas.
      NOTA: Las proteínas que co-sedimentan con F-actina se enriquecerán en las muestras de píldoras "más F-actina" sobre las muestras de pellet "sin F-actina" ( Figura 1A ). La tinción con azul de Coomassie estándar es suficiente para la detección si las concentraciones de proteína están en el intervalo de 0,1-10 μM. Coloidal Coomassie ⁹ o Western blot puede ser utilizado para aumentar la sensibilidad si se utilizan concentraciones de proteínas más bajas para medir las interacciones de mayor afinidad.
   2. Image Coomassie-geles manchados utilizando un escáner o sistema de imágenes (paso 5.12).

   5. Ensayo de granulación - Cuantificación

   Nota: Si se observa la unión específica a F-actina, puede ser útil medir la afinidad de tInteracción. Esto se logra haciendo algunos cambios y adiciones al protocolo descrito en la sección 4. Para una guía excelente para diseñar e interpretar ensayos de unión, vea Pollard ¹⁰ . Un diagrama de flujo ( Figura 2 ) se proporciona para la ayuda con el análisis y la cuantificación.

   1. Determine el rango de concentración a probar.
      NOTA: El intervalo de concentración dependerá de la proteína y deberá extenderse desde una concentración por debajo de la Kd aparente ( por ejemplo, 1 μM) a concentraciones suficientemente altas para saturar la unión. Es crítico que la unión alcance la saturación en múltiples muestras en el extremo superior del intervalo de concentración para generar una curva de unión precisa ( Figura 1C ). Como se ha indicado anteriormente, muchas proteínas de unión a actina tienen afinidad por la actina F en el intervalo micromolar bajo (1-5 μM). Para una proteína con K _{$ _} { _{d} $} de 0,5-1 mu M, un intervalo útil de concentración inicial sería 0,1-10 mu M.
   2. Hard spin (etapa 2.3) la proteína de interés para eliminar los agregados. Serialmente diluir la proteína para hacer una serie de concentración que contiene 7-8 muestras a 2x la concentración final a ser probado. Por ejemplo, si el intervalo a ensayar es de 0,1 a 8 μM, se preparan las siguientes diluciones en tampón de reacción 1x: 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 y 0,2 μM.
      NOTA: Como se mencionó en el paso 4.2, si la proteína añadida constituye más del 10% -20% de la primera dilución (la muestra de 16 μM en el ejemplo anterior), puede ser necesario concentrar la proteína más lejos o dializar la De proteína en tampón de reacción 1x. Asegúrese de preparar suficiente cantidad de cada dilución para muestras "más F-actina" y "sin F-actina".
   3. Preparar las muestras (como en la sección 4), diluyendo la proteína de interés a las concentraciones deseadas en tampón de reacción 1x en tubos de ultracentrífuga. Mantenga los volúmenes de muestra bajos (40-60 μL) para evitar el uso de grandes cantidades de proteína mediante el uso de ultracentTubos de rifugas con pequeños volúmenes mínimos ( por ejemplo , tubos de 7 x 20 mm que contienen 0,2 ml cada uno).
      1. Añadir F-actina a la concentración final deseada a las muestras apropiadas y aumentar el volumen utilizando 1x buffer de reacción. Por ejemplo, para reacciones de 50 μl usando actina F 2 μM, asegúrese de que cada muestra tenga 25 μl de proteína 2x, 10 μl de actina F 10 μM y 15 μl de tampón de reacción 1x. Incluir muestras de control (pasos 4.4.2 y 4.4.3).
         NOTA: Para controles negativos y positivos, use una concentración dentro del rango a ser probado (paso 5.1), idealmente cerca del rango medio a alto del rango ( por ejemplo, 4 μM si el rango de concentración es 0.1-10 μM).
   4. Incubar todas las muestras durante 30 min a RT.
   5. Después de 30 min, retire 1/5 de cada muestra ( por ejemplo, 10 μL de la reacción de 50 μl) y mezcle con 20 μl de agua y 10 μl de tampón de muestra 4x.
      NOTA: Estos son los "Total" sY se utilizará para generar una curva estándar.
   6. Cargar las muestras en el rotor de la ultracentrífuga. Centrifugar durante 20 minutos a 100.000 xg y 4 ° C.
   7. Opcionalmente, después de la centrifugación, retirar 3/4 del sobrenadante ( por ejemplo, 30 μL si el volumen centrifugado es 40 μl) de cada tubo y mezclar con tampón de muestra 4x (10 μL en este caso) en un tubo de microcentrífuga separado. Retire el sobrenadante restante con una punta de carga de gel, teniendo cuidado de no alterar el gránulo.
      NOTA: Cuando se mide la afinidad de unión, no es necesario ejecutar el sobrenadante. No obstante, puede ser útil para salvar el sobrenadante, especialmente cuando se prueba una nueva proteína.
   8. Eliminar el sobrenadante si no se analiza (paso 5.7).
   9. Resuspender el gránulo en 1 volumen de 1x tampón de muestra ( por ejemplo, 40 μl si el volumen centrifugado era 40 μl).
      1. Añadir tampón de muestra a todos los tubos e incubar durante al menos 5 min a RT.
      2. TrIturate la muestra 8-10 veces con una extremidad de la pipeta de p200, lavando continuamente el área del gránulo del tubo. Raspe suavemente la punta de la pipeta sobre el pellet durante la trituración para ayudar con la resuspensión.
   10. Transferir la proteína resuspendida a un tubo de microcentrífuga.
       NOTA: Estas son las muestras "Pellet".
   11. Analizar las muestras de Total y Pellet mediante SDS-PAGE ⁸ . Ejecutar todas las muestras en un gel si es posible; Si no, ejecutar las muestras de pellets en un gel y el total de las muestras en un segundo.
       NOTA: Dado el número de muestras, se recomienda un sistema de gel grande para el análisis. Si se realizan muestras en dos o más geles, es importante que todos los geles estén teñidos de forma idéntica ( es decir, la misma solución de Coomassie y un tiempo idéntico en tinción / destain).
   12. Image Coomassie-geles manchados utilizando un sistema de imágenes que mide las intensidades de banda de proteínas en un amplio ( es decir, un dos a tres log) y rango lineal. Asegúrese de que las imágenesSe recogen sin píxeles saturados.
       NOTA: Los sistemas de imágenes basados ​​en láser ofrecen la mejor sensibilidad y relación señal / ruido.
   13. Utilizando ImageJ o un programa de análisis similar, mida las intensidades de la banda de proteínas y calcule la cantidad de proteína unida.
       NOTA: Para todas las mediciones de muestra, utilice la herramienta de selección en ImageJ para dibujar una región de interés (ROI) alrededor de cada banda y medir (área de medición) el área y el valor de gris medio. Calcular el fondo de cada gel midiendo el valor de gris medio de un área sin muestra. Restar el valor de gris medio de fondo de cada valor de gris medio ROI y luego multiplicar por el área para obtener el valor de densidad integrado para cada banda.
       1. Mida las intensidades de banda de proteína de interés de las muestras Total ( Figura 2A ).
       2. Generar una curva estándar trazando la intensidad de banda ( es decir, las mediciones de densidad integrada) versus masa de proteína ( Figura2B).
       3. Medir la cantidad de proteína de interés que co-sedimentado con F-actina (proteína co-sedimentada, Figura 2C ).
       4. Mida la cantidad de proteína de interés que sedimentó en ausencia de F-actina (sedimentación de fondo, Figura 2D ).
       5. Restar la sedimentación de fondo de la proteína co-sedimentada ( es decir, restar los valores de la etapa 5.13.4 de la etapa 5.13.3) para determinar la cantidad de proteína que se unen a F-actina.
       6. Mida la cantidad de F-actina en cada pellet ( Figura 2E ). Determine la cantidad promedio de actina F por muestra y luego divida cada muestra por el promedio para determinar la proporción de F-actina en cada muestra con relación al promedio ( es decir, los números por debajo de las bandas).
       7. Para cada muestra, divida la cantidad de proteína unida (calculada en el paso 5.13.5) por la proporción de píldoras de actina F actina (paso 5.13.6) para ajustar las diferencias en el gránulo.
          norteOTE: Este valor es la proteína unida normalizada.
       8. Utilice la curva estándar (paso 5.13.2) para calcular la cantidad (masa) de proteína unida normalizada (paso 5.13.7) en cada muestra.
          NOTA: La proteína eliminada inicialmente (la muestra "Total"), así como la cantidad cargada (que, a menos que se haya cargado el gránulo entero, será una fracción del gránulo), debe tenerse en cuenta al calcular la cantidad total de proteína Que sedimentaba.
       9. Determine la concentración de proteína unida en cada muestra de la masa total de proteína en el gránulo (calculada en el paso 5.13.8) y el volumen de la muestra. Restar este valor de la concentración inicial para determinar la cantidad de proteína libre. Se divide la concentración de proteína unida por la concentración de actina (μM / μM de actina) y la gráfica frente a la concentración de proteína libre para generar una curva de unión ( Figura 1C ).
          NOTA: Dado que la F-actina no es una especie única y uniforme es diffiCulto de extrapolar la concentración molar de F-actina de la concentración de actina G. Utilizar la concentración de G-actina inicial para determinar la cantidad de proteína unida (μM / μM de actina) y estimar la concentración aparente de sitios de unión en la reacción. La concentración de sitios de unión es usualmente menor que la concentración de monómeros de actina en la reacción porque no toda la actina se polimeriza y porque una sola molécula de proteína de unión a actina puede hacer contacto con múltiples monómeros sobre el filamento de actina.
   14. Utilizando un programa estadístico, determine la afinidad (K _d ) y _Bmax de la curva de unión usando la regresión no lineal de mínimos cuadrados.
       NOTA: Las parcelas de Scatchard se desalientan para analizar los datos de unión, en parte porque pueden oscurecer si la unión está saturada y porque pueden distorsionar el error experimental ¹⁰ .

Se examinó αE-catenina homodímero vinculante a F-actina en el co-sedimentación ensayo. Dado que los experimentos anteriores han demostrado que la afinidad del homodímero αE-catenina para la actina F es alrededor de 1 μM y el _Bmax cerca de ¹¹ , se realizó el ensayo con una concentración baja de actina F (0,2 μM en lugar de 2 μM; La discusión). Puesto que 0,2 μM está por debajo de la concentración crítica, se añadió faloidina para estabilizar la F-actina polimerizada a partir de G-actina de músculo esquelético de conejo (etapa 3.3). Se incubaron concentraciones crecientes de homodímero αE-catenina (0,125-12,0 μM) en presencia o ausencia de actina F 0,2 μM. Las muestras fueron centrifugadas, y los pellets resultantes se analizaron ( Figura 1A ]. Como era de esperar, el homodímero αE-catenina co-sedimentado con F-actina por encima del fondo ( Figura 1A , compara las muestras de pellet de F-actina con el no-F-acMuestras de pellets de hojalata). BSA se ejecutó como un control negativo ( Figura 1B ]. La proteína unida se cuantificó y se trazó sobre proteína libre para calcular la afinidad de la interacción ( Figura 1C ). Los datos trazados se ajustan mejor a una ecuación Hill. El Kd calculado fue de 2,9 mu M, el _Bmax fue de 0,2 y el coeficiente de Hill (h) fue de 4,8. Por tanto, el homodímero αE-catenina se une a la actina F cooperativamente con una afinidad micromolar baja, consistente con el trabajo previo (un Kd de 2,9 μM frente a 1,0 μM) ¹¹ .

Figura 1: Ensayo de co-sedimentación de F-actina de alta velocidad. ( A ) Se incubaron concentraciones crecientes (0,125-12,0 mu M) de homodímero de alpha - catenina con (paneles de la izquierda) o sin (paneles de la derecha) 0,2 mu M de actina F estabilizada con phalloidinorte. Se incubaron durante 30 min a TA y se centrifugaron. El total (7,5% del material de partida) y el material granulado (50% del material en forma de gránulo) se separaron por SDS-PAGE y se tiñeron con colorante Coomassie. ( B ) 4 μ M BSA se ejecutó como un control negativo. Las muestras totales y de pellets, con (+) o sin (-) F-actina, se separaron por SDS-PAGE y se tiñeron con colorante de Coomassie. ( C ) La α-catenina unida (μM / μM de actina) de A se representó contra la α-catenina libre (μM) y los datos se ajustaron a una ecuación de Hill (línea roja). Se enumeran los coeficientes Kd, _Bmax y Hill (h). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Cuantificación de la peletización con actina - diagrama de flujo. Este esquema describe los pasos clave en la sección 5, con ejemplos de muestras de Total y Pellet ( A , CE ) y la curva estándar ( B ) utilizada para la cuantificación. 5.13 pasos: 1 ) Medir la cantidad de proteína de interés en las muestras totales (A). 2 ) Genere una curva estándar trazando la intensidad de banda frente a la masa de proteína (B). 3 ) Medir la cantidad de proteína de interés que co-sedimentado con F-actina ( C ). 4 ) Mida la cantidad de proteína de interés que sedimentó en ausencia de F-actina ( D ). 5 ) Sustraiga D de C para determinar la cantidad de proteína unida a F-actina. 6 ) Mida la cantidad de F-actina en cada pellet (E), calcule la cantidad promedio de F-actina por muestra y divida cada muestra por el promedio (los números abajo muestran la relación). 7 )Para cada muestra, divida la cantidad de proteína unida (calculada en el paso 5) por la proporción de gránulos de actina F (calculada en el paso 6) para ajustar las diferencias en el gránulo. 8 ) Utilice la curva estándar ( B ) para calcular la cantidad (masa) de proteína unida normalizada en cada muestra (paso 7). 9 ) Determine la concentración de proteína libre y proteína unida para crear una curva de unión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El ensayo de co-sedimentación de actina es una técnica sencilla que puede determinar rápidamente si una proteína se une a la F-actina. Con algunas modificaciones, la técnica también puede usarse para medir la afinidad de la interacción. Además de los puntos planteados en el protocolo anterior, los siguientes aspectos deben ser considerados al diseñar, conducir e interpretar el ensayo.

Proteína de Interés

En el ensayo se puede usar proteína recién preparada o congelada. Si se usa proteína congelada, se recomienda que los resultados se comparen con proteínas frescas (nunca congeladas) para asegurar que la congelación no afecta a la unión de F-actina.

G-actina Fuente

Muchos experimentos de granulación utilizan G-actina aislada del músculo debido a su abundancia relativa. Hay tres principales isotipos de actina en mamíferos - alfa, beta y gamma - que son notablemente similares (> 90% de la secuencia identiTy). No obstante, existen diferencias funcionales entre los isotipos ^{12 , 13} . Si es posible, el isotipo G-actina usado en el ensayo de unión debe coincidir con el isotipo in vivo . Por ejemplo, si se prueba una proteína expresada en el músculo esquelético, la alfa-actina es la mejor opción; Si se examina una proteína expresada en fibroblastos, se recomienda la beta-actina.

Uso de Phalloidin

Dado que la faloidina se une a la actina F, puede interferir o incluso bloquear la unión de algunas proteínas de unión a la actina F ( p. Ej., La faloidina bloquea la cofilina de la unión a los filamentos de actina) ¹⁴ . Por lo tanto, la faloidina debe utilizarse con precaución y los resultados en comparación con las muestras no tratados con faloidina cuando sea posible.

Fondo alto

No es infrecuente que las proteínas sedimenten en ausencia de actina F ( Figura 1A , ninguna muestra de pellet de F-actinaS). Sin embargo, altos niveles de sedimentación de fondo pueden enmascarar la verdadera co-sedimentación de actina y dificultar, si no imposible, determinar si una proteína se une a F-actina o para medir la afinidad de la interacción. La adición de polidicanol al tampón de reacción (paso 4.1) puede reducir significativamente el fondo y es una solución fácil. Si esto no reduce el fondo, el ajuste del tampón de reacción, la concentración de sal y / o la temperatura de incubación pueden ayudar.

Curva de encuadernación

Para generar una curva de unión, es necesario variar la concentración de la proteína de interés o de la F-actina sobre una serie de reacciones. En la práctica, es más fácil y preferible mantener F-actina a una concentración fija y variar la concentración de la proteína de interés. El mantenimiento de la actina F a una concentración fija ( por ejemplo, 2 μM) en el ensayo de granulación limita la captura no específica a concentraciones más altas de actina F y previeneDespolimerización a concentraciones menores (<0,5 μM) de F-actina. La despolimerización puede evitarse utilizando la faloidina, aunque esto introduce un factor de complicación potencial en el sistema (ver paso 3.3 y anteriores). El mantenimiento de la actina F a una concentración fija también permite comparar (y normalizar) el sedimento de actina F entre muestras e identificar experimentos fallidos ( es decir, donde el sedimento de actina F es altamente variable, evitando el análisis a través de las concentraciones). Por último, el mantenimiento de la actina F a una concentración fija permite determinar si la unión al filamento de actina es cooperativa ( Figura 1C ).

Unión saturada

Como en todos los experimentos de unión, es crítico que la unión a F-actina esté saturada y que la concentración de proteína más platinas de F-actina ( Figura 1C ). Sin una meseta, no es posible calcular una constante de equilibrio de disociación precisa. Por lo tanto,Es importante planificar cuidadosamente la serie de dilución a ensayar e incluir siempre concentraciones más altas de proteína ( es decir, por lo menos 5- a 10 veces mayor que la Kd esperada).

Análisis de encuadernación

Para que las constantes de disociación medidas sean concluyentes, el ensayo debe realizarse usando una concentración de actina F que permita que la concentración de sitios de unión en la actina F para la proteína de interés sea mucho menor que la afinidad. Para comprobar si este criterio se cumplió, estimar la concentración de sitios de unión de B _max . Por ejemplo, si [F-actina] era 2 μM y _Bmax = 0,5, entonces [sitios de unión] ≈ 1 μM. El Kd debe ser al menos 5- a 10 veces mayor que [sitios de unión]. Si el Kd medido es del mismo orden de magnitud que [sitios de unión], entonces es posible que la curva de unión observada represente una titulación de unión de alta afinidad siMás que una verdadera isoterma vinculante. Si esto se observa, repetir el ensayo utilizando una concentración de actina F 10 veces menor para medir una afinidad precisa. Para las interacciones de alta afinidad, la estabilización de la faloidina (etapa 3.3) puede ser necesaria para lograr una concentración de actina F lo suficientemente baja como para medir con precisión la afinidad.

Finalmente, existen limitaciones fundamentales con el ensayo de co-sedimentación que los investigadores deben tener en cuenta al realizar y evaluar el ensayo. Más importante aún, el ensayo de co-sedimentación no produce una constante de equilibrio real. Los productos de unión ( es decir, proteína más F-actina) se separan de los reactivos durante la centrifugación, después de lo cual los productos pueden disociarse para crear un nuevo equilibrio. Como resultado, el ensayo de co-sedimentación puede calcular erróneamente o no detectar interacciones de baja afinidad. Puesto que muchas proteínas de unión a actina tienen una afinidad baja ( es decir, micromolar) para la actina F, un resultado negativo es decir, ninguna unión detectable) en el ensayo no significa necesariamente que una proteína no se une a F-actina. Como alternativa, los ensayos de unión a un solo filamento basados ​​en microscopía TIRF son más sensibles y más precisos para determinar una constante de disociación (para revisiones sobre esta técnica, véanse las referencias ¹⁵ , ¹⁶ ). A pesar de estas limitaciones, el ensayo de granulación está dentro de los medios de la mayoría de los investigadores y es una herramienta eficaz para determinar si una proteína se une a la actina F y para medir la afinidad de la interacción.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Este trabajo fue apoyado por el National Institutes of Health Grant HL127711 a AVK.