Messung der Proteinbindung an F-Aktin durch Co-Sedimentation

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, um die Fähigkeit eines Proteins zu testen, mit filamentösem Actin (F-Aktin) zu coedimieren und, falls die Bindung beobachtet wird, die Affinität der Wechselwirkung zu messen.

Die filamentöse Aktin (F-Aktin) -Organisation innerhalb der Zellen wird durch eine große Anzahl von aktinbindenden Proteinen reguliert, die die Aktin-Keimbildung, das Wachstum, die Vernetzung und / oder die Demontage kontrollieren. Dieses Protokoll beschreibt eine Technik - die Aktin-Co-Sedimentation oder Pelletierung, Assay - um zu bestimmen, ob eine Protein- oder Proteindomäne F-Actin bindet und die Affinität der Wechselwirkung ( dh die Dissoziationsgleichgewichtskonstante) misst. Bei dieser Technik wird zunächst ein Protein von Interesse mit F-Actin in Lösung inkubiert. Dann wird eine Differentialzentrifugation verwendet, um die Aktinfilamente zu sedimentieren, und das pelletierte Material wird durch SDS-PAGE analysiert. Wenn das interessierende Protein F-Aktin bindet, wird es mit den Aktinfilamenten co-sedimentieren. Die Produkte der Bindungsreaktion ( dh F-Aktin und des Proteins von Interesse) können quantifiziert werden, um die Affinität der Wechselwirkung zu bestimmen. Der Aktin-Pelletierassay ist eine einfache Technik zur BestimmungWenn ein Protein von Interesse F-Aktin bindet und für die Beurteilung, wie Veränderungen an diesem Protein, wie Ligandenbindung, seine Wechselwirkung mit F-Actin beeinflussen.

Actin ist ein essentielles zytoskeletales Protein, das in zahlreichen zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle spielt, einschließlich Motilität, Kontraktion, Adhäsion und Morphologie ¹ . Actin besteht in zwei Formen: monomeres globuläres Actin (G-Actin) und polymerisiertes filamentöses Actin (F-Aktin). Innerhalb der Zellen wird die F-Aktin-Organisation durch eine große Sammlung von Proteinen kontrolliert, die die Keimbildung, das Wachstum, die Vernetzung und die Demontage der Aktinfilamente ^{2 , 3 , 4} regulieren. Doch wie viele aktinbindende Proteine ​​im Zusammenspiel zur Regulierung der Aktin-Netzwerkorganisation funktionieren, ist noch weitgehend unklar.

Die Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungen ist ein wichtiger Ansatz für das Verständnis, wie Proteine ​​ihre Auswirkungen auf das zelluläre Verhalten auf biochemischer Ebene ausüben. Viele verschiedene Assays können verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen gereinigten Proteinen zu detektieren.Häufige Ansätze für lösliche Proteine ​​umfassen Pull-Downs, Fluoreszenzpolarisation, isotherme Titrationskalorimetrie und Oberflächenplasmonenresonanz. Wichtig ist, dass alle diese Assays Proteine ​​benötigen, um löslich zu sein, und sind daher schwierig für die Verwendung mit einem polymeren, filamentösen Protein wie F-Actin anzupassen. Hier beschreiben wir eine Technik - die Aktin-Co-Sedimentation oder Pelletierung, Assay - um festzustellen, ob eine Protein- oder Proteindomäne F-Actin bindet und die Affinität der Wechselwirkung mißt.

Der Aktin-Pelletier-Assay ist eine relativ einfache Technik, die keine spezialisierte Ausrüstung erfordert, abgesehen von einer Ultrazentrifuge. Alle Reagenzien können hergestellt werden, die Kenntnis der Grundbiochemie annehmen oder erworben werden. Sobald die Bindung an F-Actin etabliert ist, kann der Assay verwendet werden, um die scheinbare Affinität ( dh die Dissoziationsgleichgewichtskonstante) zu messen. Auch wenn einmal eine Affinität festgestellt ist, wird der PelletierungsassayIst ein nützliches Werkzeug, um zu messen, wie sich Veränderungen des interessierenden Proteins ( dh posttranslationale Modifikationen, Mutationen oder Ligandenbindung) auf die Wechselwirkung mit F-Aktin ⁶ auswirken. Die Technik hat Einschränkungen (siehe die Diskussion ), die der Forscher sich bewusst sein sollte, bevor er den Test versuchte.

1. Vorbereiten der Materialien

1. Reinigen Sie das Protein von Interesse (siehe Abschnitt 2).
2. G-actin vorbereiten oder kaufen
   HINWEIS: G-Aktin kann aus mehreren Quellen isoliert werden ¹ ; Alternativ kann man auch gekauft werden. Rekonstituiertes G-Actin (in 5 mM Tris pH 8,0, 0,2 mM CaCl ₂ , 0,2 mM ATP (Adenosintriphosphat) und 0,5 mM Dithiothreitol (DTT)) sollten gefroren werden, bei -80 ° C und> 10 mg / ml gelagert werden In kleinen (10-20 μl) Aliquots und aufgetaut kurz vor Gebrauch. G-Aktin Aliquots sollten nicht refrozen werden.
3. Vorbereiten oder Kauf eines Kontrollproteins wie BSA (siehe Schritt 4.4).
4. 10x Polymerisationspuffer (200 mM Imidazol pH 7,0, 1 M KCl, 20 mM MgCl ₂ , 5 mM ATP und 10 mM EGTA (Ethylenglykol-bis (β-aminoethylether) -N, N, N ', N'- Tetraessigsäure)). Machen Sie einen 10fachen Vorrat und stellen Sie den pH-Wert nach der Zugabe von ATP ein, falls erforderlich. Aliquot (25 μl ist ein nützliches Volumen) und bei -80 & #176;
5. Bereiten Sie 10x Reaktionspuffer (200 mM Imidazol pH 7,0, 1,5 M NaCl, 20 mM MgCl ₂ , 5 mM ATP und 10 mM EGTA) vor. Machen Sie einen 10fachen Vorrat und stellen Sie den pH-Wert nach der Zugabe von ATP ein, falls erforderlich. Aliquot (50-100 μl ist ein nützliches Volumen) und bei -80 ° C lagern.
   HINWEIS: Die Zusammensetzung des Reaktionspuffers ist flexibel und muss angepasst werden, um die Hintergrundsedimentation zu reduzieren, die unspezifische Bindung zu begrenzen und / oder die Bindung zu verbessern (Schritte 1.5.1-1.5.3).
   1. Den pH-Wert des Reaktionspuffers zwischen 6 und 8 einstellen, um die Proteinstabilität zu optimieren. Bei einem niedrigeren oder höheren pH-Wert wird ein geeigneter Puffer für Imidazol ersetzt.
      HINWEIS: Verwenden Sie pH 7.0 als Ausgangspunkt, es sei denn, ein Protein benötigt einen niedrigeren oder höheren pH-Wert für die Stabilität. Verwenden Sie keinen Puffer mit einem pH-Wert unter 6,0 oder höher als 8,0, da dies das Actin stören kann. Empfohlene Puffer (Endkonzentration und optimaler pH-Wert) sind: 20 mM MOPS (3- ( N- Morpholino) propansulfonsäure), pH-Wert= 6,5; 20 mM Imidazol, pH = 7,0; 10 mM HEPES (4- (2-Hydroxyethyl) piperazin-1-ethansulfonsäure), pH = 7,5; Und 20 mM Tris, pH = 8,0.
   2. Variieren Sie die Salzkonzentration des Reaktionspuffers, abhängig von den Bedürfnissen des Assays.
      ANMERKUNG: Actin ist ein saures Protein, und fast alle Actin-bindenden Proteine ​​beruhen in gewissem Maße auf elektrostatischen Wechselwirkungen, um mit Actin assoziieren zu können. Daher verringert die Erhöhung der Salzkonzentration die Aktinbindung in den meisten Fällen. Der Reaktionspuffer verwendet einen physiologischen Gehalt an Salz (150 mM NaCl, Arbeitskonzentration), und dies ist der empfohlene Ausgangspunkt. Falls erforderlich, kann die Salzkonzentration gesenkt werden ( z. B. auf 100 mM), um die Bindung zu fördern oder zu erhöhen, um die Bindung zu begrenzen.
   3. Ändern Sie nicht die Konzentrationen von MgCl ₂ , ATP oder EGTA im Reaktionspuffer, es sei denn, es gibt einen bestimmten Grund dafür.

2. Bereiten Sie das Testprotein für den Assay vor

1. VorbereitungEa hochreines Protein mit Flüssigchromatographie für die besten Ergebnisse ⁷ .
   HINWEIS: Bei Verwendung von rekombinantem Protein sollten große Protein-Tags wie Glutathion-S-Transferase (GST) durch Protease-Spaltung aus dem Zielprotein entfernt werden, da sie die Bindung stören können. GST verursacht auch eine Homodimerisierung von Fusionsproteinen, die die Affinität der Aktinbindung künstlich erhöhen können.
2. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration durch Messung der Extinktion bei 280 nm. Durch den Auslöschungskoeffizienten dividieren; Kann der Extinktionskoeffizient aus der Proteinsequenz unter Verwendung von Sequenzanalyse oder Online-Tools berechnet werden. Alternativ kann die Proteinkonzentration unter Verwendung von Bradford- oder BCA-Verfahren (Bicinchoninsäure) bestimmt werden.
   HINWEIS: Für erste Experimente sind 50-100 μl Protein bei 20-40 μM in der Regel ausreichend. Dies ermöglicht die Analyse der Bindung im niedrigen Mikromolarbereich, ein nützlicher Ausgangspunkt für die meisten aktinbindenden Proteine. Eine größere quanUnd oftmals wird eine höhere Proteinkonzentration benötigt, um eine Bindungskurve zur Berechnung der Affinität zu erzeugen (siehe Abschnitt 5).
3. Vor dem Gebrauch hart das Protein (50.000-100.000 xg für 10 min bei 4 ° C), um die Aggregate von unlöslichem Protein zu entfernen. Wenn die Löslichkeit ein Anliegen ist, messen Sie die Proteinkonzentration (Schritt 2.2) nach der Zentrifugation neu.

3. Bereiten Sie das F-Aktin vor

1. Entfernen Sie ein Aliquot von G-Aktin aus dem -80 ° C Gefrierschrank und tauen Sie es schnell.
2. Füge den 10x Polymerisationspuffer dem G-Actin zu einer Endkonzentration von 1x hinzu. Stellen Sie sicher, dass die G-Aktin-Konzentration in 1x Polymerisationspuffer mindestens 10-20 μM, weit über der kritischen Konzentration liegt. Inkubieren für 1 h bei Raumtemperatur (RT), um das Actin zu polymerisieren.
3. Nach der Polymerisation das F-Aktin in Lösung bei 4 ° C aufbewahren, wo es für einige Wochen stabil bleibt. Bevor Sie den F-Aktin nach der Lagerung wieder einsetzen, sanft umkehrenOder um die Röhre mehrmals zu schlagen, um sicherzustellen, dass alle Aktin gelöst und gleichmäßig in Lösung verteilt werden.
   HINWEIS: (Optional) Füge Phalloidin hinzu, um ein 1: 1-Molverhältnis von G-Aktin: Phalloidin zu erreichen. Inkubieren für 30 min bei RT, damit das Phalloidin an das F-Aktin binden kann. Phalloidin stabilisiert F-Aktin und erreicht zwei Dinge: (i) es reduziert die Menge an Aktin, die während der Zentrifugation nicht sedimentiert und (ii) es ermöglicht, dass F-Aktin unterhalb der kritischen Konzentration (~ 0,5 μM) verdünnt wird, was häufig ist Notwendig, wenn man die Menge an F-Aktin variiert, um eine Bindungskurve zu erzeugen (siehe Abschnitt 5 zur Messung der Affinität).

4. Pelletierassay - Grundprotokoll

HINWEIS: Das in Abschnitt 4 beschriebene Grundprotokoll wird verwendet, um festzustellen, ob ein Protein von Interesse Co-Sedimente mit F-Actin ist. Sobald die Bindung an F-Aktin festgestellt ist, kann die Affinität dieser Wechselwirkung nach dem in Abschnitt 5 beschriebenen Protokoll gemessen werden.

1. Bereiten Sie den Reaktionspuffer am Tag der Anwendung vor, indem Sie den 10x-Vorrat auf 1x verdünnen und DTT zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzufügen.
   HINWEIS: (Optional) Fügen Sie Polidocanol zu einer abschließenden Arbeitskonzentration von 0,02% im Reaktionspuffer hinzu. Polidocanol ist ein Tensid, das die unspezifische Hintergrundbindung reduziert und dazu beiträgt, dass hydrophobe Proteine ​​an dem Ultrazentrifugenröhrchen haften.
2. Verdünnen Sie das interessierende Protein auf die gewünschten Konzentrationen in 1x Reaktionspuffer in Ultrazentrifugenröhrchen. Halten Sie die Probenvolumina niedrig (40-60 μl), um große Mengen an Protein zu vermeiden, indem Sie Ultrazentrifugenröhrchen mit kleinen Mindestvolumina verwenden ( z. B. 7 x 20 mm Röhrchen, die jeweils 0,2 ml enthalten).
   HINWEIS: Da viele aktinbindende Proteine ​​eine Affinität für F-Aktin im mikromolaren Bereich aufweisen, wird ein Protein von Interesse bei 2 und 10 μM empfohlen. Wenn die Bindung bei 10 & mgr; M nicht beobachtet wird, ist es unwahrscheinlich, dass die Bindung bei höheren Konzentrationen beobachtet wird. Wenn dieHinzugefügtes Protein macht mehr als 10-20% des endgültigen Reaktionsvolumens aus, es kann notwendig sein, das Protein vor der Durchführung des Experiments in den Reaktionspuffer zu dialysieren.
3. F-Aktin zur gewünschten Endkonzentration hinzufügen.
   HINWEIS: 2 μM ist eine sinnvolle Konzentration für Erstversuche, da sie weit über der kritischen Konzentration liegt, wodurch Actin im filamentösen Zustand erhalten wird. Bei der Analyse durch SDS-PAGE wird ein sichtbares Pellet produziert (Schritt 4.10).
4. Bereiten Sie die folgenden Kontrollen in Ultrazentrifugenröhrchen vor, um den Assay informativ zu machen.
   1. Vorbereitung der Probe (n), die das Protein von Interesse ohne F-Aktin enthält. Stellen Sie sicher, dass die Proteinkonzentration in diesen Proben mit der Konzentration in den "plus F-Aktin" -Proben übereinstimmt.
      HINWEIS: Diese Proben bestimmen die Menge an Protein, die aggregiert oder an den Seiten des Ultrazentrifugenröhrchens in Abwesenheit von F-Aktin geklebt wird.
   2. Vorbereiten der negativen KontrollprobenBei der gleichen oder ähnlichen Konzentration (en) für das Protein von Interesse verwendet. Verwenden Sie ein Kontrollprotein, das nicht an F-Aktin bindet, mit und ohne F-Aktin.
      HINWEIS: Dies ist eine wichtige Kontrolle, weil Proteine ​​in Aktinfilamenten "gefangen" und mit F-Actin pellet werden können, obwohl sie nicht an F-Aktin binden. Die Menge des Fangs kann in Abhängigkeit von der F-Aktin-Quelle, den Pufferbedingungen usw. variieren . Daher sollte diese Kontrolle in allen Experimenten enthalten sein. Idealerweise sollte das Kontrollprotein ein Molekulargewicht aufweisen, das dem interessierenden Protein ähnlich ist ( z. B. für αE-Catenin (~ 100 kDa), BSA (66 kDa) ist eine geeignete Kontrolle). Kommerziell erhältliche Gelfiltrationsstandards machen ausgezeichnete Kontrollproteine, da sie eine Reihe von Größen abdecken und dazu neigen, keine Aggregate zu enthalten.
   3. Gegebenenfalls präparieren Sie positive Kontrollproben, die ein Protein enthalten, das an F-Actin bindet, mit und ohne F-Aktin. Stellen Sie sicher, dass die Konzentration (en) denjenigen ähneltE Protein von Interesse.
      HINWEIS: Diese Kontrolle ist hilfreich, da sie zeigt, dass die experimentellen Bedingungen ( zB präpariertes F-Aktin, Reaktionspuffer und Zentrifugation) eine F-Aktinbindung ermöglichen. Da der Pelletier-Assay keine schwachen F-Aktin-Wechselwirkungen nachweisen kann (siehe Diskussion), empfiehlt es sich, dass das bekannte F-Actin-bindende Protein eine mäßig-schwache Affinität für F-Aktin ( dh im niedrigen Mikromolarbereich) aufweist ). Gereinigte F-Aktin-bindende Proteine ​​sind im Handel erhältlich.
5. Alle Proben für 30 min bei RT inkubieren.
   HINWEIS: Längere Inkubationszeiten sind gut, vorausgesetzt, dass das Protein von Interesse stabil ist, obwohl es wahrscheinlich unnötig ist. Wenn das Protein von Interesse bei RT nicht stabil ist, können Proben bei 4 ° C inkubiert werden. In diesem Fall können längere Inkubationszeiten erforderlich sein.
6. Legen Sie die Proben in den Zentrifugenrotor. Positionieren Sie die Rohre innerhalb des Rotors, um die Restenzierung des Pellets nach der Zentrifugation zu unterstützen.Hierzu alle Zentrifugenröhrchen ( z. B. mit einer Probennummer) markieren und alle Rohre in den Rotor in der gleichen Position stellen ( z. B. die Nummer nach außen).
7. Zentrifugieren bei 100.000 xg für 20 min bei 4 ° C in einer Ultrazentrifuge.
8. Nach der Zentrifugation 3/4 des Überstandes ( z. B. 45 μl, wenn das Ausgangsvolumen 60 μl) aus jedem Röhrchen entfernt und mit 1/3 Volumina 4x Probenpuffer (15 μl in diesem Fall) in einem separaten Mikrozentrifugenröhrchen vermischen.
   1. Den restlichen Überstand mit einer Gel-Ladespitze entfernen und darauf achten, das Pellet nicht zu stören (was als glasiger Fleck sichtbar ist).
      HINWEIS: Es ist wichtig, den Überstand aus den Röhrchen so schnell wie möglich nach Beendigung der Zentrifuge zu entfernen, um die Protein-Dissoziation nach der Trennung zu begrenzen. Auch das Pellet nicht mit dem Reaktionspuffer aus dem gleichen Grund waschen.
9. Füge 4/3 Volumina von 1x Probenpuffer zu jeder Pelle hinzuT ( z. B. 80 & mgr; l, wenn das Ausgangsvolumen 60 & mgr; l betrug).
   HINWEIS: Dies macht die Verdünnung genauso wie für den Überstand (Schritt 4.8, 1/3 Volumen von 4x Probenpuffer wurden zugegeben), was den direkten Vergleich zwischen Pellet- und Überstandsproben und die Bestimmung des prozentualen Anteils an Protein ermöglicht, das pelletiert wurde.
   1. Füge Probenpuffer zu allen Röhrchen hinzu und inkubiere für mindestens 5 min bei RT. Lassen Sie das Pellet in den Probenpuffer sitzen, um die Probengewinnung zu verbessern.
   2. Triturieren Sie die Probe 8-10 mal mit einer P200-Pipettenspitze, um das Pellet durch kontinuierliches Waschen des Pelletbereichs des Röhrchens zu resuspendieren. Die Pipettenspitze vorsichtig während des Triturations über die Pellets kratzen, um bei der Resuspension zu helfen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, dass Sie während der Verreibung keine Luft in die Probe einführen, da dies dazu führt, dass der Probenpuffer blättert und die Probengewinnung reduziert.
   3. Übertragen der resuspendierten Proben auf Mikrofugenröhrchen nach Verreiben.
   4. Analysieren Sie die überstehenden und Pelletproben durch SDS-PAGE und Coomassie-Färbung ⁸ durch Laden von 10-15 & mgr; l Probe pro Spur; Dies genügt, um die Proteine ​​zu visualisieren.
      HINWEIS: Proteine, die mit F-Actin co-sedimentieren, werden in den "plus F-Aktin" -Pelletproben über die "no F-actin" -Pelletproben angereichert ( Abbildung 1A ). Standard-Coomassie-Blau-Färbung ist für den Nachweis ausreichend, wenn die Proteinkonzentrationen im Bereich von 0,1-10 & mgr; M liegen. Kolloidale Coomassie ⁹ oder Western Blotting können verwendet werden, um die Empfindlichkeit zu erhöhen, wenn niedrigere Proteinkonzentrationen verwendet werden, um Verbindungen mit höherer Affinität zu messen.
   5. Bild Coomassie-gefärbte Gele mit einem Scanner oder Imaging-System (Schritt 5.12).

   5. Pelletierassay - Quantifizierung

   Anmerkung: Wenn eine spezifische Bindung an F-Aktin beobachtet wird, kann es nützlich sein, die Affinität von t zu messenEr interaktion Dies geschieht durch einige Änderungen und Ergänzungen des in Abschnitt 4 beschriebenen Protokolls. Für eine ausgezeichnete Anleitung zur Gestaltung und Interpretation von Bindungsassays siehe Pollard ¹⁰ . Ein Flussdiagramm (Abbildung 2 ) dient der Unterstützung bei der Analyse und Quantifizierung.

   1. Bestimmen Sie den zu testenden Konzentrationsbereich.
      HINWEIS: Der Konzentrationsbereich hängt vom Protein ab und sollte von einer Konzentration unterhalb des scheinbaren Kd ( zB 1 μM) bis zu Konzentrationen reichen, die hoch genug sind, um die Bindung zu sättigen. Es ist entscheidend, dass die Bindung die Sättigung in mehreren Proben am oberen Ende des Konzentrationsbereichs erreicht, um eine genaue Bindungskurve zu erzeugen (Abbildung 1C ). Wie oben erwähnt, haben viele aktinbindende Proteine ​​eine Affinität für F-Aktin im niedrigen Mikromolarbereich (1-5 & mgr; M). Für ein Protein mit einem Kd von 0,5-1 & mgr; M wäre ein nützlicher Ausgangskonzentrationsbereich 0,1-10 & mgr; M
   2. Hard Spin (Schritt 2.3) das Protein von Interesse, um Aggregate zu entfernen. Seriell verdünnen das Protein, um eine Konzentrationsreihe mit 7-8 Proben bei 2x der zu testenden Endkonzentration herzustellen. Wenn zum Beispiel der Testbereich 0,1-8 μM beträgt, werden die folgenden Verdünnungen in 1x Reaktionspuffer: 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 und 0,2 μM hergestellt.
      HINWEIS: Wie in Schritt 4.2 erwähnt, kann, wenn das hinzugefügte Protein mehr als 10% -20% der ersten Verdünnung ausmacht (die 16 μM Probe im obigen Beispiel), es notwendig sein, entweder das Protein weiter zu konzentrieren oder zu dialysieren Protein in 1x Reaktionspuffer. Achten Sie darauf, genug von jeder Verdünnung für "plus F-Aktin" und "keine F-Aktin" Proben vorzubereiten.
   3. Bereiten Sie Proben (wie in Abschnitt 4) vor, indem Sie das Protein von Interesse auf die gewünschten Konzentrationen in 1x Reaktionspuffer in Ultrazentrifugenröhrchen verdünnen. Halten Sie die Probenvolumen niedrig (40-60 μL), um zu vermeiden, dass große Mengen an Protein mit Ultracent verwendet werdenRifugenröhrchen mit kleinen Mindestvolumina ( zB 7 x 20-mm-Röhrchen, die jeweils 0,2 ml enthalten).
      1. F-Actin zu der gewünschten Endkonzentration zu den entsprechenden Proben hinzufügen und das Volumen mit 1x Reaktionspuffer aufbringen. Für 50-μL-Reaktionen unter Verwendung von 2 & mgr; M F-Aktin ist sicherzustellen, dass jede Probe 25 & mgr; l 2x Protein, 10 & mgr; l 10 & mgr; M F-Aktin und 15 & mgr; l 1x-Reaktionspuffer enthält. Steuerproben einbeziehen (Schritte 4.4.2 und 4.4.3).
         HINWEIS: Für negative und positive Kontrollen eine Konzentration innerhalb des zu testenden Bereichs verwenden (Schritt 5.1), idealerweise nahe der Mitte bis zum oberen Ende des Bereichs ( zB 4 μM, wenn der Konzentrationsbereich 0,1-10 μM beträgt).
   4. Alle Proben für 30 min bei RT inkubieren.
   5. Nach 30 min 1/5 jeder Probe ( zB 10 μl der 50 μl Reaktion) entfernen und mit 20 μl Wasser und 10 μl 4x Probenpuffer mischen.
      HINWEIS: Dies sind die "Total" sAmples und wird verwendet, um eine Standardkurve zu erzeugen.
   6. Legen Sie die Proben in den Ultrazentrifugenrotor. 20 min bei 100.000 xg und 4 ° C zentrifugieren.
   7. Gegebenenfalls nach der Zentrifugation 3/4 des Überstandes ( z. B. 30 & mgr; l, wenn das zentrifugierte Volumen 40 & mgr; l) aus jedem Röhrchen entfernt und mit 4 × Probenpuffer (10 & mgr; l in diesem Fall) in einem separaten Mikrofugenröhrchen vermischen. Den restlichen Überstand mit einer Gel-Ladeschale entfernen und darauf achten, das Pellet nicht zu stören.
      HINWEIS: Beim Messen der Bindungsaffinität ist es nicht notwendig, den Überstand zu führen. Trotzdem kann es sinnvoll sein, den Überstand zu retten, besonders beim Testen eines neuen Proteins.
   8. Entfernen Sie den Überstand, wenn Sie nicht analysieren (Schritt 5.7).
   9. Das Pellet wird in 1 Volumen von 1x Probenpuffer ( z. B. 40 & mgr; l, falls das zentrifugierte Volumen 40 & mgr; l beträgt) resuspendieren.
      1. Füge Probenpuffer zu allen Röhrchen hinzu und inkubiere für mindestens 5 min bei RT.
      2. TrDie Probe 8-10 mal mit einer P200-Pipettenspitze bestäuben, wobei der Pelletbereich des Röhrchens kontinuierlich gewaschen wird. Die Pipettenspitze vorsichtig während des Triturations über die Pellets kratzen, um bei der Resuspension zu helfen.
   10. Übertragen Sie das resuspendierte Protein in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
       HINWEIS: Dies sind die "Pellet" Proben.
   11. Analysieren Sie die Gesamt- und Pelletproben nach SDS-SEITE ⁸ . Führen Sie alle Proben auf einem Gel, wenn möglich; Wenn nicht, führen Sie die Pelletproben auf einem Gel und die Gesamtproben auf einer Sekunde.
       HINWEIS: Bei der Anzahl der Proben wird ein großes Gel-System zur Analyse empfohlen. Bei der Durchführung von Proben auf zwei oder mehr Gelen ist es wichtig, dass alle Gele identisch gefärbt werden ( dh die gleiche Coomassie-Lösung und eine identische Zeit in Flecken / Destain).
   12. Bild Coomassie-gefärbte Gele mit einem bildgebenden System, das Proteinbandintensitäten über einen breiten ( dh zwei- bis dreipoligen) und linearen Bereich misst. Stellen Sie sicher, dass die Bilder aGesammelt ohne gesättigte Pixel.
       HINWEIS: Laserbasierte Bildgebungssysteme bieten die besten Empfindlichkeits- und Signal-Rausch-Verhältnisse.
   13. Mit ImageJ oder einem ähnlichen Analyseprogramm messen Sie Proteinbandintensitäten und berechnen die Menge an gebundenem Protein.
       HINWEIS: Für alle Probenmessungen verwenden Sie das Auswahlwerkzeug in ImageJ, um eine Region von Interesse (ROI) um jedes Band zu zeichnen und zu messen (Analysieren> Messen) des Bereichs und des mittleren Grauwertes. Berechnen Sie den Hintergrund für jedes Gel, indem Sie den mittleren Grauwert aus einer Fläche ohne Probe messen. Subtrahieren Sie den Hintergrund-Mittelwert Grauwert von jedem ROI-Mittelwert Grauwert und multiplizieren Sie dann mit dem Bereich, um den integrierten Dichtewert für jedes Band zu erhalten.
       1. Messen Sie das Protein der interessanten Bandintensitäten aus den Gesamtproben (Abbildung 2A ).
       2. Generieren Sie eine Standardkurve, indem Sie die Bandintensität ( dh die integrierten Dichtemessungen) gegenüber der Proteinmasse ( Abb2B).
       3. Messen Sie die Menge an Protein von Interesse, die mit F-Aktin co-sedimentiert (Co-sedimentierte Protein, Abbildung 2C ).
       4. Messen Sie die Menge an Protein von Interesse, die in Abwesenheit von F-Aktin sedimentiert (Hintergrund Sedimentation, Abbildung 2D ).
       5. Subtrahieren Sie die Hintergrund-Sedimentation aus dem co-sedimentierten Protein ( dh, subtrahieren Sie die Werte aus Schritt 5.13.4 aus Schritt 5.13.3), um die Menge an Protein zu bestimmen, die an F-Aktin gebunden ist.
       6. Messen Sie die Menge an F-Aktin in jedem Pellet ( Abbildung 2E ). Bestimmen Sie die durchschnittliche Menge an F-Aktin pro Probe und teilen Sie dann jede Probe mit dem Mittelwert, um das Verhältnis von F-Aktin in jeder Probe relativ zu dem Durchschnitt zu bestimmen ( dh die Zahlen unterhalb der Banden).
       7. Für jede Probe teilen Sie die Menge an gebundenem Protein (berechnet in Schritt 5.13.5) durch das F-Aktin-Aktin-Pellet-Verhältnis (Schritt 5.13.6), um die Unterschiede im Pellet anzupassen.
          NOTE: Dieser Wert ist das normalisierte gebundene Protein.
       8. Verwenden Sie die Standardkurve (Schritt 5.13.2), um die Menge (Masse) des normalisierten gebundenen Proteins (Schritt 5.13.7) in jeder Probe zu berechnen.
          HINWEIS: Das anfangs entfernte Protein (die "Gesamt" -Probe) sowie die beladene Menge (die, wenn nicht das gesamte Pellet beladen wurde, ein Teil des Pellets sein wird), muss bei der Berechnung der Gesamtmenge an Protein berücksichtigt werden Das pelletiert
       9. Bestimmen Sie die Konzentration des gebundenen Proteins in jeder Probe aus der Gesamtmasse des Proteins im Pellet (berechnet in Schritt 5.13.8) und dem Volumen der Probe. Subtrahieren Sie diesen Wert von der Ausgangskonzentration, um die Menge an freiem Protein zu bestimmen. Teilen Sie die Konzentration des gebundenen Proteins durch die Konzentration von Actin (μM / μM Actin) und Plot gegenüber der Konzentration des freien Proteins, um eine Bindungskurve zu erzeugen (Abbildung 1C ).
          HINWEIS: Da F-Aktin nicht eine einzige, einheitliche Spezies ist, ist es diffusKult, um die molare Konzentration von F-Aktin aus der G-Aktin-Konzentration zu extrapolieren. Verwenden Sie die Ausgangs-G-Aktin-Konzentration, um die Menge an gebundenem Protein (μM / μM Actin) zu bestimmen und die scheinbare Konzentration an Bindungsstellen in der Reaktion zu schätzen. Die Konzentration der Bindungsstellen ist gewöhnlich geringer als die Konzentration der Aktinmonomere in der Reaktion, da nicht alle Aktinpolymere und weil ein einzelnes aktinbindendes Proteinmolekül mit mehreren Monomeren auf dem Aktinfaden in Kontakt kommen kann.
   14. Mit Hilfe eines statistischen Programms bestimmen Sie die Affinität (K _d ) und B _max aus der Bindungskurve unter Verwendung der nichtlinearen Minimal-Quadrate-Regression.
       HINWEIS: Scatchard-Plots sind für die Analyse von Bindungsdaten entmutigt, zum Teil weil sie verdecken können, ob die Bindung gesättigt ist und weil sie den experimentellen Fehler verzerren können ¹⁰ .

Wir untersuchten die αE-Catenin-Homodimer-Bindung an F-Actin im Co-Sedimentationstest. Da vergangene Experimente gezeigt haben, dass die Affinität des αE-Catenin-Homodimers für F-Aktin etwa 1 μM und der B _max bei 1 ^{11 liegt} , haben wir den Assay mit einer geringen Konzentration an F-Aktin (0,2 μM anstatt 2 μM) durchgeführt die Diskussion). Da 0,2 μM unterhalb der kritischen Konzentration liegt, wurde Phalloidin zugegeben, um das aus dem Kaninchen-Skelettmuskel G-Actin polymerisierte F-Aktin zu stabilisieren (Schritt 3.3). Zunehmende Konzentrationen von & agr; E-Catenin-Homodimeren (0,125 & ndash; 12,0 & mgr; M) wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,2 & mgr; M F-Aktin inkubiert. Die Proben wurden zentrifugiert und die resultierenden Pellets wurden analysiert ( Fig. 1A ). Wie erwartet, wurde der αE-Catenin-Homodimer mit F-Aktin über dem Hintergrund co-sedimentiert (Abbildung 1A , Vergleich der F-Aktin-Pelletproben mit dem No-F-acZinnpelletproben). BSA wurde als Negativkontrolle ausgeführt ( Abbildung 1B ). Das gebundene Protein wurde quantifiziert und über freies Protein aufgetragen, um die Affinität der Wechselwirkung zu berechnen (Abbildung 1C ). Die geplante Daten passen am besten zu einer Hill-Gleichung. Das berechnete K _d betrug 2,9 & mgr; M, das B _max betrug 0,2 und der Hill-Koeffizient (h) betrug 4,8. Somit bindet das αE-Catenin-Homodimer F-Actin kooperativ mit einer geringen mikromolaren Affinität, konsistent mit früheren Arbeiten (ein Kd von 2,9 & mgr; M gegenüber & ndash; 1,0 & mgr; M) ¹¹ .

Abbildung 1: Hochgeschwindigkeits-F-Aktin-Co-Sedimentationstest ( A ) Zunehmende Konzentrationen (0,125-12,0 μM) des αE-Catenin-Homodimers wurden mit (linken Tafeln) oder ohne (rechte Tafeln) mit 0,2 & mgr; M F-Aktin, stabilisiert mit Phalloidi, inkubiertN. Sie wurden für 30 min bei RT inkubiert und zentrifugiert. Die Gesamtmenge (7,5% des Ausgangsmaterials) und das pelletierte Material (50% des pelletierten Materials) wurden durch SDS-PAGE getrennt und mit Coomassie-Farbstoff gefärbt. ( B ) 4 & mgr; M BSA wurde als Negativkontrolle durchgeführt. Gesamt- und Pelletproben mit (+) oder ohne (-) F-Aktin wurden durch SDS-PAGE getrennt und mit Coomassie-Farbstoff gefärbt. ( C ) Das gebundene αE-Catenin (μM / μM Actin) aus A wurde gegen freies αE-Catenin (μM) aufgetragen und die Daten passen zu einer Hill-Gleichung (rote Linie). Der K _d , B _max und der Hill-Koeffizient (h) sind aufgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Aktin-Pelletierung Quantifizierung - Flussdiagramm In diesem Schema werden die wichtigsten Schritte in Abschnitt 5 mit Beispielen für Total- und Pelletproben ( A , CE ) und der zur Quantifizierung verwendeten Standardkurve ( B ) erläutert. 5.13 Schritte: 1 ) Messen Sie die Menge des Proteins von Interesse in den Gesamtproben (A). 2 ) Erzeugen Sie eine Standardkurve, indem Sie die Bandintensität gegenüber der Proteinmasse (B) aufzeichnen. 3 ) Messen Sie die Menge an Interesse von Interesse, die mit F-Aktin ( C ) co-sedimentiert wurde . 4 ) Messen Sie die Menge an Interesse von Interesse, die in Abwesenheit von F-Aktin ( D ) pelletiert. 5 ) Subtrahieren Sie D von C, um die Menge an Protein zu bestimmen, die an F-Actin gebunden ist. 6 ) Messen Sie die Menge an F-Aktin in jedem Pellet (E), berechnen Sie die durchschnittliche Menge an F-Aktin pro Probe und teilen Sie jede Probe mit dem Durchschnitt (die Zahlen unten zeigen das Verhältnis). 7 )Für jede Probe teilen Sie die Menge an gebundenem Protein (berechnet in Schritt 5) durch das F-Aktin-Pellet-Verhältnis (berechnet in Schritt 6), um die Unterschiede im Pellet einzustellen. 8 ) Verwenden Sie die Standardkurve ( B ), um die Menge (Masse) des normalisierten gebundenen Proteins in jeder Probe zu berechnen (Schritt 7). 9 ) Bestimmen Sie die Konzentration von freiem Protein und gebundenem Protein, um eine Bindungskurve zu erzeugen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Der Actin-Co-Sedimentationstest ist eine einfache Technik, die schnell bestimmen kann, ob ein Protein F-Actin bindet. Mit einigen Modifikationen kann die Technik auch verwendet werden, um die Affinität der Wechselwirkung zu messen. Zusätzlich zu den im oben genannten Protokoll aufgeführten Punkten sollten bei der Gestaltung, Durchführung und Interpretation des Assays die folgenden Punkte berücksichtigt werden.

Protein von Interesse

Frisch zubereitetes oder gefrorenes Protein kann im Assay verwendet werden. Wenn gefrorenes Protein verwendet wird, wird dringend empfohlen, dass die Ergebnisse mit frischem (nie gefrorenem) Protein verglichen werden, um sicherzustellen, dass das Einfrieren die F-Aktinbindung nicht beeinflusst.

G-Aktin Quelle

Viele Pelletierexperimente verwenden G-Actin, das aus dem Muskel isoliert ist, wegen seiner relativen Häufigkeit. Es gibt drei Haupt-Actin-Isotypen bei Säugetieren - Alpha, Beta und Gamma - das sind bemerkenswert ähnlich (> 90% Sequenz identiTy) Dennoch gibt es funktionale Unterschiede zwischen den Isotypen ^{12 , 13} . Wenn möglich, sollte der in dem Bindungsassay verwendete G-Aktin-Isotyp mit dem in vivo- Isotyp übereinstimmen. Zum Beispiel, wenn ein Protein im Skelettmuskel exprimiert wird, ist Alpha-Aktin die beste Wahl; Bei der Untersuchung eines in Fibroblasten exprimierten Proteins wird Beta-Actin empfohlen.

Phalloidin Gebrauch

Da Phalloidin F-Actin bindet, kann es die Bindung einiger F-Aktin-bindender Proteine ​​stören oder sogar blockieren ( z. B. Phalloidin-Blöcke cofilin aus Bindung an Aktin-Filamente) ¹⁴ . So sollte Phalloidin mit Vorsicht verwendet werden und die Ergebnisse im Vergleich zu Nicht-Phalloidin-behandelten Proben, wenn möglich.

Hoher hintergrund

Es ist nicht ungewöhnlich, daß Proteine ​​in Abwesenheit von F-Aktin sedimentieren ( Fig. 1A , keine F-Aktin-PelletprobeS). Allerdings können hohe Niveaus der Hintergrund-Sedimentation die echte Aktin-Co-Sedimentation maskieren und es schwierig machen, wenn nicht gar unmöglich zu bestimmen, ob ein Protein F-Actin bindet oder die Affinität der Wechselwirkung mißt. Das Hinzufügen von Polidicanol zum Reaktionspuffer (Schritt 4.1) kann den Hintergrund erheblich reduzieren und ist eine einfache Lösung. Wenn das nicht den Hintergrund verringert, kann die Einstellung des Reaktionspuffers, der Salzkonzentration und / oder der Inkubationstemperatur helfen.

Bindekurve

Um eine Bindungskurve zu erzeugen, ist es notwendig, die Konzentration von entweder dem interessierenden Protein oder dem F-Aktin über eine Reihe von Reaktionen zu variieren. In der Praxis ist es einfacher und bevorzugt, F-Aktin in einer festen Konzentration aufrechtzuerhalten und die Konzentration des interessierenden Proteins zu variieren. Die Aufrechterhaltung von F-Aktin in einer festen Konzentration ( z. B. 2 & mgr; M) im Pelletier-Assay begrenzt das unspezifische Fallen bei höheren Konzentrationen von F-Aktin und verhindertDepolymerisation bei niedrigeren (<0,5 μM) Konzentrationen von F-Aktin. Die Depolymerisation kann mit Phalloidin verhindert werden, obwohl dies einen potentiellen komplizierenden Faktor in das System einführt (siehe Schritt 3.3 und darüber). Die Aufrechterhaltung von F-Aktin in einer festen Konzentration erlaubt es auch, das F-Aktin-Pellet über Proben zu vergleichen (und zu normalisieren) und um fehlgeschlagene Experimente zu identifizieren ( dh wo das F-Aktin-Pellet sehr variabel ist und eine Analyse über Konzentrationen hinweg verhindert). Schließlich ermöglicht die Aufrechterhaltung von F-Aktin in einer festen Konzentration, dass man bestimmt, ob die Bindung an den Aktin-Filament kooperativ ist ( 1C ).

Gesättigte Bindung

Wie bei allen Bindungsexperimenten ist es entscheidend, dass die Bindung an F-Actin gesättigt ist und dass die Konzentration von Protein plus F-Aktin-Plateaus (Abbildung 1C ). Ohne Plateau ist es nicht möglich, eine genaue Dissoziationsgleichgewichtskonstante zu berechnen. Also, esIst wichtig, die zu testende Verdünnungsreihe sorgfältig zu planen und immer höhere Protein-Konzentrationen ( dh mindestens 5- bis 10-fach höher als die erwarteten K _d ) zu enthalten.

Bindungsanalyse

Damit die gemessenen Dissoziationskonstanten schlüssig sind, sollte der Assay unter Verwendung einer F-Aktin-Konzentration durchgeführt werden, die es ermöglicht, dass die Konzentration von Bindungsstellen auf F-Aktin für das interessierende Protein viel niedriger als die Affinität ist. Um zu prüfen, ob dieses Kriterium erfüllt ist, schätzen Sie die Konzentration der Bindungsstellen von B _max . Zum Beispiel, wenn [F-Aktin] 2 μM und B _max = 0,5 war, dann [Bindungsstellen] ≈ 1 μM. Das K _d sollte mindestens 5- bis 10-fach größer sein als [Bindungsstellen]. Ist das gemessene K _d in der gleichen Größenordnung wie [Bindungsstellen], so ist es möglich, dass die beobachtete Bindungskurve eine Titration der hochaffinen Bindungsstelle darstelltEher als eine echte Bindungsisotherme. Wenn dies beobachtet wird, wiederholen Sie den Assay mit einer 10-fach niedrigeren F-Aktin-Konzentration, um eine genaue Affinität zu messen. Für hochaffine Wechselwirkungen kann eine Phalloidin-Stabilisierung (Schritt 3.3) notwendig sein, um eine F-Aktin-Konzentration zu erreichen, die niedrig genug ist, um die Affinität genau zu messen.

Schließlich gibt es grundsätzliche Einschränkungen mit dem Co-Sedimentationstest, den die Forscher bei der Durchführung und Bewertung des Assays bewusst sein sollten. Am wichtigsten ist, dass der Co-Sedimentationstest keine echte Gleichgewichtskonstante ergibt. Die Produkte der Bindung ( dh Protein plus F-Aktin) werden bei der Zentrifugation von den Reaktanten abgetrennt, woraufhin die Produkte dann dissoziieren können, um ein neues Gleichgewicht zu erzeugen. Infolgedessen kann der Co-Sedimentations-Assay die Wechselwirkung mit geringer Affinität fiskussieren oder nicht erkennen. Da viele aktinbindende Proteine ​​eine niedrige ( dh mikromolare) Affinität für F-Aktin aufweisen , ist ein negatives Ergebnis ( dh keine nachweisbare Bindung) im Assay bedeutet nicht zwangsläufig, dass ein Protein nicht F-Actin bindet. Als Alternative sind TIRF-Mikroskopie-basierte Einzelfilament-Bindungsassays empfindlicher und genauer für die Bestimmung einer Dissoziationskonstante (für Rezensionen zu dieser Technik siehe Literatur ^15,16 ). Trotz dieser Einschränkungen liegt der Pelletierassay innerhalb der Mittel der meisten Forscher und ist ein wirksames Instrument, um festzustellen, ob ein Protein F-Aktin bindet und die Affinität der Wechselwirkung misst.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Grant HL127711 an AVK unterstützt.