Estudos de estrutura e função em células-tronco embrionárias de camundongos usando troca de cassete mediada por recombinase

Proteínas, muitas vezes contêm vários domínios que podem exercer diferentes funções celulares. Gene knock-out (KO) não consideram essa diversidade funcional. Aqui, relatamos uma abordagem de estrutura-função com base na troca de cassete mediada por recombinação (RMCE) em KO células estaminais embrionárias que permite a dissecação molecular de vários domínios funcionais ou variantes de uma proteína.

engenharia genética em embriões de ratinho ou células estaminais embrionárias (mESCs) permite o estudo da função de uma dada proteína. As proteínas são os laboriosos da célula e frequentemente consistem em vários domínios funcionais, que podem ser influenciados por modificações pós-traducionais. O esgotamento de toda a proteína em condicional ou constitutiva knock-out ratos (KO) não leva em conta essa diversidade funcional e regulação. Uma linha MESC e um modelo de ratinho derivado, em que um local de acoplamento para FLPe troca cassete mediada por recombinação (RMCE) foi inserida dentro do locus ROSA26 (R26), foi anteriormente relatado. Aqui, nós relatamos em uma abordagem de estrutura-função que permite a dissecção molecular das diferentes funcionalidades de uma proteína de múltiplos domínios. Para este fim, os ratos RMCE-compatível deve ser cruzados com ratinhos KO e mESCs KO então RMCE-compatíveis devem ser isoladas. Em seguida, um painel de construções de salvamento putativos pode ser introduzida no locus de R26 via RMCE targeting. Os cDNAs candidatos de resgate pode ser facilmente inserido entre os locais RMCE do vector de direccionamento utilizando recombinação clonagem. Em seguida, mESCs KO são transfectadas com o vector de direccionamento, em combinação com um plasmídeo de expressão da recombinase FLPe. RMCE reativa o gene de resistência à neomicina promotor-menos nos locais de ancoragem ROSA26 e permite a seleco do evento de direccionamento correcto. Desta forma, a eficiência elevada de segmentação perto de 100% são obtidas, permitindo a inserção de várias construções de salvamento putativos de uma forma semi-elevado rendimento. Finalmente, um grande número de construções de salvamento R26 accionadas podem ser testados quanto à sua capacidade para resgatar o fenótipo que foi observada em mESCs KO parentais. Apresenta-se um estudo de estrutura-função de prova de princípio em catenina p120 (p120ctn) mESCs KO usando diferenciação endoderme em corpos embrióides (EBS) como a leitura fenotípica. Esta abordagem permite a identificação de domínios importantes, vias a jusante putativos, e ponto de doença relevantesmutações que estão subjacentes fenótipos KO para uma determinada proteína.

Estima-se que os genomas de mamíferos contêm cerca de 20.000 genes codificadores de proteínas. O splicing alternativo e modificações pós-tradução aumentam ainda mais o repertório de proteínas. As proteínas têm uma estrutura modular de ^um e muitas vezes conter vários domínios de interacção, que permitem o seu recrutamento para complexos proteicos diferentes e a sua participação em vários processos celulares ^2. Um exemplo é a proteína multi-funcional chamado p120ctn. p120ctn é codificada pelo gene Ctnnd1 e consiste de um grande domínio central tatu repetição flanqueado por um N-terminal e uma região C-terminal. O domínio de tatu p120ctn se liga a um domínio justamembranar altamente conservado de caderinas clássicas, que estão envolvidos na adesão célula-célula, mas que também se liga ao repressor transcricional Kaiso. O domínio N-terminal de p120ctn interage com diferentes quinases, fosfatases, pequenas RhoGTPases, e associada a microtúbulos proteins ^3. Curiosamente, como um resultado de splicing alternativo, isoformas p120ctn podem ser gerados a partir de quatro codões de iniciação alternativos ^4. p120ctn isoforma 1A é a mais longa, uma vez que é traduzida a partir da maioria-5' do codão de iniciação e contém o segmento de comprimento completo N-terminal. Em p120ctn isoformas de 3 e 4, este segmento N-terminal é eliminado parcialmente e completamente, respectivamente. Compreendendo o papel preciso de proteínas (ou isoformas de proteas) e os seus domínios em diferentes funções celulares continua a ser um desafio.

Direccionamento de genes em mESCs permite o estudo da função de uma proteína através da deleco genica do gene correspondente e tem amplamente contribuiu para a identificação de genes e vias developmentally importantes e doenças relevantes. Esta descoberta em engenharia genica inversa foi o resultado de avanços em campos de isolamento MESC e direccionamento de genes devido à recombinação homóloga ⁵ . A recombinação homóloga é um processo no qual fragmentos de ADN são trocadas entre duas porções nucleicos semelhantes ou idênticas depois de cadeia dupla (ds) quebras de ADN. Normalmente, RH é ineficiente porque quebras ADNcd são pouco frequentes. Recentemente, a eficiência do gene dirigida por homologia de segmentação pode ser aumentada usando nucleases específicas do local ^{6, 7,} mas, infelizmente, estes são propensas a efeitos fora do alvo ^8. Uma técnica mais fiável para permitir o direccionamento gico é RMCE, que é baseado em sistemas de recombinação específicos do local tais como Cre / loxP ou FLPe / Frt. LoxP e sequência DRF são encontrados no bacteriago P1 e Saccharomyces cerevisiae, respectivamente, e consistem de 34 pb, incluindo uma sequência de pb assimétrica 8 que determina a orientação do local. Por outro lado, a orientação de, por exemplo, dois sítios loxP no interior de um trecho de ADN irá determinar se o ADN floxed torna-se excisado ou inversed após recombinação mediada por Cre ^9. Além disso, Cre também pode induzir uma translocação se dois locais estão localizados em diferentes cromossomas. RMCE leva vantagem de locais de recombinação heteroespecíficos que não reagem de forma cruzada e que são incorporados no locus genómico. Na presença de um plasmídeo dador que contém um fragmento de ADN flanqueada pelos mesmos locais heteroespecíficos, a recombinase irá inserir este fragmento de ADN no locus genómico RMCE-compatíveis, porque de translocação duplo simultâneo (Figura 1). Aqui, os clones única correctamente RMCE orientadas podem tornar de resistência a drogas, graças a um promotor no vector de entrada que restaura um "preso", gene de resistência à Neomicina promotor-menos (Neo ^R) presente no genoma R26 das células de encaixe (Figura 1) ^{10, 11.} Isto resulta numa eficiência muito alta segmentação, muitas vezes perto de 100% ^{11, <}/ sup> ^12. Em conclusão, a segmentação baseada RMCE é altamente eficiente e pode ser usada para a estrutura-funções estudos; no entanto, requer um local genómico pre-engenharia.

Figura 1. Representação esquemática da orientação para as mediada por RMCE. RMCE permite a troca de segmentos de ADN a partir de um vector de abordagem selectiva de entrada para um local genómico definido se tanto abrigar dois locais DRF heteroespecíficos (representados por triângulos brancos e vermelhos). Além disso, o locus genómico engenharia contém um promotor e um gene truncado de resistência à neomicina ^(NeoR). Ao fornecer um promotor e do codão de iniciação no fragmento de DNA de entrada, os eventos de recombinação única correcção restaurar a resistência a neomicina, resultando em altas eficiências de segmentação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior do tsua figura.

engenharia genoma em mESCs permite a geração de ratinhos RMCE-compatível. Em 1981, dois grupos conseguiram capturar células pluripotentes a partir da massa celular interna (ICM) de blastocistos e em mantê-las em cultura ^{13, 14.} mESCs são capazes de auto-renovação e diferenciação em todos os tipos de células embrionárias e adultos, incluindo a linhagem de células germinativas. Portanto, o direccionamento gico em mESCs permite estudos inverter-genéticas através do desenvolvimento de ratinhos KO constitutivos ou condicional (utilizando o sistema cre / loxP). No entanto, a forma clássica de isolar as células ES de ratinho é muito ineficiente. Várias melhorias importantes têm aumentado grandemente a taxa de sucesso para derivar linhas Mesc, incluindo o uso de um soro de substituição definidos (SR) de meio ^15, alternando entre médio MESC contendo soro de bovino fetal e SR (FBS) a ^16, e o uso de farmacocompostos lógicas tais como pluripotin ou 2i ^17. Pluripotin, uma molécula pequena sintética, permite a propagação de mESCs num estado indiferenciado, na ausência do factor inibidor da leucemia (LIF) e fibroblastos de rato embrionários (MEFs) ^18. Finalmente, foi demonstrado que mESCs pode ser isolado com um rendimento muito elevado (perto de 100%) quando um / FBS a meio protocolo alternância SR é combinado com LIF e pluripotin ^{19, 20.} Estes protocolos permitem o isolamento eficiente de mESCs KO RMCE-compatível que pode subsequentemente ser utilizados para estudos estrutura-função.

Este documento descreve um método que permite que um para identificar os domínios de chave ou resíduos dentro de uma proteína que é responsável por processos celulares específicos. Para este fim, uma reserva de tecnologias avançadas que permitem o isolamento eficiente MESC, visando a montagem do vetor, e MESC segmentação era criard. Como tal, os grandes painéis com isoformas de proteas, mutantes de domínio, e efectores a jusante podem ser introduzidos em mESCs KO e podem ser avaliados pela sua capacidade para resgatar o fenótipo in vitro KO.

Todos os experimentos com ratos foram conduzidos de acordo com os regulamentos animais institucionais, nacionais e europeus.

1. Isolamento de mESCs KO RMCE compatíveis

1. Raça ratinhos KO heterozigicos com ratinhos RMCE-compatíveis, tais como ratinhos ROSALUC ¹⁰ ou ROSA26-iPSC ratos ^21. Ambos os ratinhos RMCE-compatível foram mantidos num 129 / C57BL6 / fundo Swiss misto.
   NOTA: Cruzando com KO heterozigotos é aconselhado para superar letalidade embrionária em ratos KO homozigotos.
2. Utilizar PCR para selecionar ratinhos KO heterozigicos contendo uma cassete de RMCE no locus R26 ^12.
3. Raça, os ratinhos KO heterozigicos RMCE-compatível com ratinhos KO heterozigicos e isolar, blastocistos KO homozigicos RMCE-compatível.
   1. Configure acasalamentos tempo à noite e verificar a cópula conecta na manhã seguinte.
      NOTA: As fichas são feitos de secreções coagulado do coagulantes e vesiculares glândulas do sexo masculino.Estes tampões de preencher a vagina da fêmea e persistem durante 8 - 24 h após o acasalamento. fêmeas conectados são consideradas transportando 0,5 dpc (dias post coitum) embriões.
      1. Para verificar se há fichas, levantar a fêmea pela base de sua cauda e examinar por sua abertura vaginal para uma massa esbranquiçada. Espalhe os lábios da vulva ligeiramente com uma sonda angular quando a ficha é difícil de ver. fêmeas ligados separar de seus masculina.
   2. Recolhe blastocistos em 3,5 dpc.
      1. Eutanásia fêmeas grávidas pelo método aprovado (por exemplo, deslocamento cervical). Faça uma incisão médioventral e dissecar o útero e oviduto (ainda ligados uns aos outros), utilizando tesoura fina e fórceps.
      2. Dobrar uma agulha de calibre 26 num ângulo de 45 °. Anexar uma seringa de 1 ml, cheio com meio M2 para esta agulha dobrada e usá-lo para lavar os blastocistos do útero para a tampa de uma placa de 10 cm.
         1. Inserir a agulha no final do útero que está mais próximooviduto. Segure a agulha no lugar com uma pinça fina enquanto empurra o êmbolo; inchaço do útero indica uma descarga bem sucedida.
      3. Usar uma pipeta de boca (com um diâmetro entre 100 - 200 um) para recolher todos os embriões e lavar duas vezes em uma gota de meio M2 fresco. Imediatamente após a lavagem eles, transferir os blastocistos para as placas de cultura (ver abaixo).
         NOTA: A dissecção e manuseio de blastocistos de deve ser feito em fluxo de ar laminar.
4. Isolar mESCs RMCE compatível KO
   1. Prepara-se uma placa de 12 poços com MEFs DR4 tratados com mitomicina-C (ver a Tabela de Materiais) um dia antes do isolamento de blastocisto.
      NOTA: Estes MEFs foram isoladas a partir de ratinhos Tg (DR4) 1Jae / J que contêm quatro genes droga seleccionável e conferem resistência à neomicina, puromicina, higromicina, e 6-tioguanina ^22.
      1. Revestir todas as placas de cultura com 0,1% de gelatina. Adiciona-se 0,1% de gelatinapara as placas de cultura, incubar durante 5 min a 37 ° C em 5% de CO _2, e aspirar a solução de gelatina. Semente quarto de um frasco de P2 MEFs em uma placa de 12 poços e crescem-los em 2 mL de meio de MEF (ver Tabela 1, a Tabela de Materiais) para uma monocamada confluente ^19.
      2. Inactivar os com mitomicina-C (10 ug / ml) durante 3 h e lave-se duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) ^19.
   2. Usando uma pipeta de boca, a chapa blastocistos em placas de 12 poços gelatinizados (1 bem / embrião), com as MEFs tratados com mitomicina-C em meio de células EL-ES (2 mL / poço) suplementado com 2 pluripotin uM ou com 2i (PD0325901 inibidor Erk 1 uM e 3 | iM GSK3 inibidor CHIR99021). Incubar a 37 ° C em 5% de CO _2.
   3. Refrescar o meio de células EL-ES (suplementado com pluripotin ou 2i) a cada 2 - 3 dias.
   4. Examine cada blastocisto sob uma stereomicroescopo em 4.0X ampliação e vá para incubação e de fixação à camada de MEF.
      NOTA: Quando blastocistos escotilha, eles perdem a zona pelúcida que os encapsula. Wells com blastocistos não anexados precisam ser atualizados usando o pipetagem boca.
   5. Escolha outgrowths ICM individuais (usando um microscópio estereoscópico) após 10 - 12 dias de cultura, utilizando uma pipeta P10 com pontas descartáveis. Transferir o crescimento em cerca de 10 uL de meio a uma placa em forma de V, de 96 poços contendo 30 uL / ​​poço de PBS (à temperatura ambiente).
   6. Adicionar 50 mL de 0,25% de tripsina a cada poço utilizando uma pipeta de canais múltiplos e incubar durante 3 min a 37 ° C em 5% de CO _2.
   7. Adicionar 100 uL de SBF contendo meio MESC; dissociar as excrescências ICM em células individuais pipetando 10-15 vezes; e transferir as células dissociadas a mitomicina-C-tratados, placas de 96 poços MEF que foram preparadas um dia antes de as colónias são colhidas ICM.
   8. A partir desta etapa em diante, omi t pluripotin ou 2i a partir do meio MESC. No dia seguinte, mudar o meio de FBS- a forma MESC SR contendo (100 / po).
   9. Expandir as linhas Mesc estabelecidas a partir de 96- para o formato de 24 poços ^19.
      1. Lavam-se as células com 200 uL de PBS, adicionar 50 ul de tripsina e incubar durante 5 min a 37 ° C em 5% de CO Adicionam-se 100? L de meio base MESC-FBS.; dissociar por pipetagem de 10 - 15 vezes usando uma pipeta de canais múltiplos; e transferir as células dissociadas a mitomicina-C-tratado, 24 bem placas MEF.
      2. Alterar a médio SR-base no dia seguinte. Expandir os mESCs em uma forma similar a partir de 24 de formato de 6 poços. Adicione 3 - 4 freezings de um confluente de 6 poços da placa ^19.
   10. Identificar RMCE-compatível, mESCs KO homozigicos utilizando iniciadores de PCR para o locus ²³ R26 e alelo KO de escolha (neste caso, p120ctn; PCRs para p120ctn nulo e alelos floxed foram descritos anteslass = "xref"> 12).

Tabela 1. Meios de Cultura. Todos os meios foram armazenadas a 4 ° C e aquecida até 37 ° C, 30 min antes da utilização.

2. Geração de um vector de segmentação RMCE compatível com a utilização da recombinação Clonagem

1. Clonar o resgate construes em vectores de recombinação-compatível, utilizando a enzima de restrição (RE) -based ou PCR com base em ²⁴ técnicas de clonagem. Certifique-se de que os cDNAs conter um códon de parada.
   1. Iniciadores ²⁴ projeto attB-marcados. Certifique-se de que o iniciador directo contém os seguintes elementos: um estiramento GGGG, um sítio attB1, um ligante, uma sequência de Kozak, e cerca de 25 nucleótidos de ADNc de salvamento (começando com o ATG). Certifique-se de que o primer reverso tem uma composição semelhante: um trecho GGGG, um site attB2, um elemento de ligação, e cerca de 25 nucleotides de ADNc de salvamento (complemento inverso).
   2. Amplificar o ADNc de salvamento através de PCR para se obter ADNc de attB-flanqueadas.
   3. Executar uma reacção de 10 ul BP com 100 ng de ADNc de attB-flanqueado e 150 ng do vector dador de recombinação-compatível, que contém um gene de resistência à canamicina.
   4. Transform 5 ul das misturas de PA em MC1061 de Escherichia coli heat-shock-competente (E. coli) (semelhantes aos descritos no passo 2.3).
   5. Identificar colónias contendo os vectores contendo ADNc de salvamento correcção (semelhantes às descritas no passo 2.4)
2. Executar uma reacção de LR-10 ul usando 100 ng de resgate do vector contendo ADNc; 150 ng do vector excisado Cre-pRMCE-DV1 ¹¹ (LMBP 8195); e 2 uL da mistura de recombinase, a qual contém uma integrase codificada-fago e excisionase e um factor de integração hospedeiro bacteriano. Incubar durante 2 horas a 25 ° C.
   NOTA: Uma reação LR é uma recombinação reagirde iões em que um clone de entrada contendo locais attL e um vector de destino contendo locais attR são recombinados pela LR mistura de enzima clonase. Isto resulta num clone de expressão contendo os locais attB que flanqueiam o gene de interesse.
3. Transform 5 ul das misturas de LR em bactérias coli MC1061 de E.-de choque térmico competente.
   1. Adicionar 5 uL de LR misturas para um nervuras, contornado, tubo de 2 mL com tampa de rosca com 40 uL de bactérias de E. coli de choque térmico-competentes e incubar durante 20 min em gelo. Incubar durante 5 min a 37 ° C.
   2. Adicionar 1 mL de meio de caldo de Luria (LB) e incubar durante 1 h a 37 ° C. Placa 50 uL sobre ampicilina (Amp; 100 / mL) molecular contendo placas de agar e crescer durante a noite a 37 ° C.
4. Identificar as colónias com o vector de direccionamento correcto.
   1. Escolha 5 colónias aleatoriamente utilizando uma ponta de p200. Transferir a ponta de um tubo de ensaio de vidro contendo 2-5 mL de meio LB e crescer durante a noite a 37 ° C.
   2. Extrato do DNA de plasmídeo a partir de culturas bacterianas utilizando kits disponíveis comercialmente.
   3. Validá-los usando digere RE e sequenciamento. Cortar 0,5-2 ug de plasmídeo utilizando 0,2 uL de RE (20 U / mL) e 1 uL do tampão 10x correspondente numa reacção de 10 uL. Incuba-se durante pelo menos 1 h a 37 ° C e separado num gel de agarose a 1%. Escolha de colónias com o padrão previsto de fragmentos de ADN.
      1. Analisar os vectores confirmados (50 ng / mL) com Tlox F (ATC ATG TCT GGA TCC CCA TC) e IRES R (GGG GCG GAA TTC GAT ATC AAG), iniciadores (5 pmol /), utilizando sequenciação de Sanger.

3. MESC mediada por RMCE Segmentação de salvamento Constrói para o R26 Locus

1. Iniciar uma cultura de mESCs e passagem deles KO RMCE compatível com pelo menos duas vezes em MEFs em meio MESC baseado em FBS. Dividir os mESCs em uma placa de 6 poços gelatinizado.
2. No dia seguinte, refrescar as células, em cerca de 50% de confluência, com 1,5ml de meio de base MESC-FBS e transfectar as mESCs com um pRMCE-DV1 Cre-excisada vector de direccionamento que contém o ADNc de resgate.
   1. Faça uma mistura de DNA. Adicionar 1 ug de vector de direccionamento e 1 ug de plasmídeo de expressão ^FLPe-25-250 uL de meio DMEM puro.
   2. Faça uma mistura lipofecção. Adicionar 7 mL de reagente de transfecção à base de lipofecção (por exemplo, Lipofectamine 2000) para 250? L de meio DMEM puro e incubar durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
      NOTA: RMCE similares direccionamento eficiências foram obtidos utilizando outros reagentes à base de lipofecção (por exemplo, Lipofectamina LTX e Effectene).
   3. Misturar a mistura de ADN com a mistura de lipofecção e incubar durante 20 min à TA. Pipetar a mistura de transfecção para as mESCs refrescadas. Agite bem e deixe durante a noite.
3. Um dia após a transfecção, todos os dividir mESCs da placa de 6 pos para uma placa de cultura de 10 cm com uma camada confluente de MEFs DR4 e m baseado em FBS a 10 mL deCES meio.
4. Dois dias após a transfecção, seleccionar clones Mesc com a troca correcta cassete mediada por FLPe por adição de 0,2 mg / mL de G418 (100x) ao meio.
   NOTA: Faça uma curva de mortalidade para cada lote de G418 para identificar a menor concentração de G418 que mata todos os mESCs.
5. Recarregar os mESCs diariamente com meio MESC contendo G418. Colônias deve aparecer após 7 - 10 dias, assim que escolher e expandir estes como por passo 1.4.
6. Confirmar os clones correctos por meio de PCR ^{de 11.}

4. Diferenciação de mESCs em corpos embrióides (EB)

1. Iniciar uma cultura de mESCs KO com construções de resgate R26-driven e passagem deles pelo menos duas vezes em MEFs em meio MESC baseado em FBS. A passagem mESCs uma vez em 6 bem-placas gelatinizadas para se livrar das MEFs.
2. Lava-se com PBS e as culturas trypsinize Mesc quase confluentes. Placa dissociado mESCs em diferentes diluições (1/20 e 1/40) sobre não-aderente, para animais de estimação bacteriana de grauRI-pratos em meio de diferenciação.
3. Permitir EBs para formar nestes pratos por 30 dias. Refrescar o meio a cada 2 - 3 dias usando o seguinte procedimento: transferir a suspensão EB para um tubo de 50 mL, deixe os CEs assentar por gravidade, remover o sobrenadante, adicionar meio fresco, e transferir a suspensão EB volta para um grau bacteriana prato.
4. Analisar os mESCs segmentados e EBs por microscopia de imunofluorescência e electrónica de transmissão usando protocolos que foram descritos anteriormente ^12.

O procedimento para isolar linhas KO Mesc RMCE-compatível está representado na Figura 2. Dois cruzamentos consecutivos são necessários para obter blastocistos KO RMCE compatível. Primeiro, os ratinhos KO heterozigicos são cruzados com ratinhos RMCE-compatível, para obter ratinhos KO heterozigicos RMCE-compatível. Estes ratinhos são então utilizados para acasalamentos programados com outros ratinhos KO heterozigicos para se obter 3,5-DPC, RMCE-compatível, blastocistos KO homozigicos. A possibilidade de obtenção de um embrião tais é um em oito, como previsto por herança mendeliana. Por conseguinte, um protocolo eficiente isolamento MESC é necessária. Usando protocolos baseados em pluripotin ou à base de 2i, somos capazes de isolar mESCs linhas, incluindo RMCE-compatível p120ctn mESCs KO, com uma eficiência de cerca de 94% (n = 114 blastocistos) e 64% (n = 22 blastocistos), respectivamente ^{12, 19.} Tipicamente, os blastocistos de escotilha depois entre 3 e 6 dias em em vitro (DIV) cultura; isto é seguido pela ligação de excrescências ICM para MEFs ou aos pratos revestidos com gelatina. No dia 12, as grandes excrescências ICM são formados que fielmente dar origem a linhas Mesc (Figura 2). Devido a este procedimento de isolamento MESC altamente eficiente, é possível obter mESCs KO RMCE compatível de uma ou duas fêmeas conectados.

Figura 2. Isolamento de mESCs KO RMCE compatível. (A) Estratégia para a criação de obter homozigotos, RMCE compatível mESCs KO. (B) Esquema de procedimento de isolamento MESC pluripotin- ou à base de 2i. barra de escala branco: 25 mm. barras de escala Preto: 100. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para mapear os domínios ou amino ácidos dentro de uma proteína que é importante para as funções celulares específicas, pode-se agora reintroduzir, através RMCE, de comprimento completo ou em construções mutantes mESCs KO e testá-los quanto à sua capacidade para reverter o fenótipo KO. Os vectores de direccionamento para diversos mutantes de domínio e mutantes pontuais podem ser eficientemente gerada por clonagem recombinatória (Figura 3A). clonagem recombinatória baseia-se no reconhecimento de sequências de ADN específicas de fixação (TCA) pela mistura de recombinase, a qual medeia a troca de fragmentos de ADN flanqueados-Att entre diferentes plasmídeos. O sistema de clonagem recombinatória selecciona vectores única correctamente recombinados, alternando entre vectores que contêm diferentes genes de resistência a antibióticos e através da inserção de um marcador contra-selecionável, o "controlo de morte de células B" (ccdB) do gene, no vector de destino (Figura 3A) . Geramos mais de 25 Cre-excisada pRMCE-DV1 vectores de direccionamento com uma perto de 100% de eficiência (alguns exemplos dere mostrado na Tabela 2).

Tabela 2. Visão geral de Segmentação Assembléia Vector e RMCE mediada MESC segmentação.

Diferentes construções de salvamento embebidas numa pRMCE-DV1 excisada-cre vector de direccionamento pode ser facilmente orientada para mESCs KO usando RMCE (Figura 3B). Nós anteriormente relatado na geração de 133 clones Mesc orientadas para 19 construtos de salvamento diferentes que foram introduzidas no locus R26 da p120ctn mESCs KO através RMCE com um rendimento médio de 93% ^12. Aqui, relatamos o direccionamento de construções adicionais com altas eficiências semelhantes, incluindo uma CAAX-tagged p120ctn 1A, epitelial-a-mesenquimal transição (EMT) indutores da família da SNAI e ZEB, e N-caderina, em p120ctn mESCs KO ( mesa 2).

Figura 3. RMCE baseada-Targeting em mESCs KO. (A) conjunto mediada por recombinase de vectores de direccionamento RMCE-compatível. (B) Selecção das construções de salvamento putativos para o locus de R26 mESCs KO homozigicos através RMCE. Validação com base em PCR (C) de clones Mesc RMCE segmentados. O DNA foi extraído a partir de clones Mesc alvo-RMCE e foi amplificada por PCR utilizando um iniciador directo que está incorporado no locus endógeno R26 e um iniciador inverso que está localizado na construo pRMCE-DV1 de entrada. Uma banda de 560 pb é observada para os clones correctamente orientados. Os clones não confirmados são mostrados no vermelho. M1: escada de DNA 1 kb. M2: 1 kb escada de DNA Plus. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Uma vez que um painel de mESCs salvamento é obtido, ele precisa ser rastreados para a sua capacidade de inverter o fenótipo induzido por KO. Foi mostrado recentemente que p120ctn mESCs KO não conseguem diferenciar-se em EBs císticas como uma consequência de polarização endoderme defeituoso ^12. Morfologia cística EB pode ser usada como uma leitura fenotípica para rastrear diferentes construções de salvamento (Figura 4A). Como prova de conceito, mostramos que R26-driven p120ctn isoformas 1A (R_p120_1A) poderia resgatar o p120ctn KO fenótipo (Figura 4B, 4C) ^12. Além disso, este identificado com ecrã de E-caderina, mas não RhoA, é um parceiro importante de p120ctn durante especificação endoderme (Figura 4B e C) ^12. A facilidade de introdução de resgate constrói a p120ctn KO mESCs nos permitiu testar hipóteses adicionais. Em primeiro lugar, seria de e-caderina-independente de ancoragem de membrana de p120ctn permitir a formação EB cística? Testareste, que fundiu o motivo de direccionamento membrana K-Ras (CAAX) para o terminal carboxi de p120ctn, introduziu-lo via RMCE para p120ctn mESCs KO, e fez CEs a partir deles. No entanto, esta construo serve um dominante negativo que não permitir a ligação e estabilização da E-caderina (Figura 4D) e, como consequência, não resgatar o fenótipo p120ctn KO (Figura 4C). Em segundo lugar, são indutores de EMT envolvidos? EMT é um processo de desenvolvimento essencial que também ocorre durante a diferenciação MESC e é orquestrada pela família SNAI e ZEB de factores de transcrição, que reprimem directamente vários genes marcadores epiteliais como a E-caderina ^{26, 27.} De acordo com estas descobertas, a expressão de EMT indutor ZEB2 foi encontrado em EBs de controlo, mas não na EBs p120ctn-nula (Figura 4E). No entanto, mESCs p120ctn KO com a expressão baseada em ROSA26 de EMT indutores ZEB1, ZEB2, ou caracol não conseguiu restabelecer cistoformação ic EB (Figura 4C). Em terceiro lugar, pode outras caderinas clássicas, tais como N-caderina, funcionalmente substituir E-caderina durante a especificação endoderme? Para lidar com isto, as linhas de salvamento N-caderina foram gerados. Anteriormente, foi demonstrado que a expressão ectópica de E-caderina em p120ctn KO EBs resgatado parcialmente a formação de EBs cística ^12. Curiosamente, numa configuração semelhante, forçado a expressão de N-caderina falhou para resgatar (Figura 4C e F), indicando que o E-caderina é o subtipo caderina necessária para EB adesão e não pode ser substituído por N-caderina. Estes exemplos acima referidos destacar a facilidade com que questões biológicas podem ser resolvidas pelo sistema.

Figura 4. Caracterização fenotípica Triagem de mESCs salvamento alvo-RMCE. (A) A formação de EBs cística (capturadas por microscopia de luz; painel superiorls) e polarização adequada endoderme em EBs (capturado por microscopia electrónica de transmissão, painéis inferiores) foram utilizados como a leitura fenotípica para testar a capacidade de mESCs orientadas para resgatar o fenótipo p120ctn KO. barra de escala branco: 25 mm. barra de escala preta: 200 mm. (B) Visão de construções de resgate p120ctn. p120ctn contém um domínio tatu central, que consiste em nove repetições tatu (caixas azuis), que é flanqueado por um domínio N-terminal (NTD) e domínio C-terminal (CTD). isoformas p120ctn conter um em cada quatro codões de iniciação alternativos (setas), possivelmente possuem sequências codificadas pelos exões alternativamente utilizados A e C (caixas pretas), e incluir ou excluir dois domios de ligao de Rho GTPase (RBDs). p120ctn isoformas 1A e 4A utilizar o primeiro e quarto local de iniciação da tradução, respectivamente. A posição de mutações de AA importante e a adição artificial de um motivo de direccionamento de membrana (CAAX) são mostrados. CAE: E-caderina domínio de ligação. (C) Representação gráficaque descreve a percentagem de morfologia de base ou cística EB em p120ctn células KO que expressam diferentes construções de salvamento R26-impulsionadas. (D) A coloração por imunofluorescência para p120ctn (monoclonal de ratinho anti-p120ctn) e E-caderina (monoclonal de ratinho anti-caderina-E) em mESCs G4 controlo ou em p120ctn mESCs KO com a expressão R26-driven de CAAX-tagged p120ctn isoforma 1A. As inserções mostram toda a colônia MESC. Barra de escala: 10? m. (E) para imuno-histoquímica ZEB2 (monoclonal de ratinho anti-ZEB2; 7F7; feitas em casa) em floxed (controlo) e p120ctn KO EBS. Uma ampliação de 3,5 vezes é mostrado nos painéis de fundo. Barra de escala: 200? m (topo), 100 um (em baixo). (F) A microscopia electrónica de transmissão de DIV12 CEs a partir de células que expressam E-KO p120ctn ou N-caderina a partir do promotor R26. Barra de escala: 10? m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior do this figura.

Para concluir, nós relatamos em um gasoduto de tecnologias robustas que combina uma eficiência de quase 100% em isolamento MESC com direcionamento montagem vector e MESC alvo. Este oleoduto nos permite desvendar a versatilidade de proteínas por meio de estudos de função-estrutura em mESCs.

Nosso método de isolamento MESC é user-friendly e não requer habilidades avançadas ou equipamentos, tais como a microcirurgia de blastocistos. Assim, esta tecnologia é acessível a uma grande parte da comunidade científica. Qualquer pessoa com experiência básica de cultura celular pode propagar outgrowths ICM e estabelecer mESCs linhas. No entanto, a lavagem e manuseio de blastocistos requer alguma prática. Uma pipeta de boca é usado para transferir os blastocistos e consiste de uma micropipeta, um suporte de micropipeta, tubagem, e um bocal de aspiração ^28. Micropipetas pode ser feito por encomenda aquecendo a parte mais fina de uma pipeta Pasteur por alguns segundos, retirando a pipeta da chama, e puxando ambas as extremidades. Seleccione agulhas com um diâmetro ligeiramente maior do que um blastocisto (100-200 um). As agulhas podem ser reutilizado depois de ser lavado com água destilada (3x) e EtOH (3 x). Em nossa experiência, a eficiência do isolamento MESC baseada pluripotin é maior em comparação com 2¹² i protocolos baseados no. No entanto, o uso de pluripotin a concentrações elevadas tem sido mostrado induzir instabilidade genómica ^19.

baseada em RMCE R26-segmentação em mESCs produz tipicamente 20 - 40 colónias após selecção com G418. Se mais colónias são observados, o que implica que a concentração de G418 não é óptima e permite mESCs não-alvo para sobreviver, que afecta a eficiência global segmentação. Portanto, recomenda-se que, para cada linha MESC e para cada novo lote de G418, uma curva de mortalidade é feito para identificar a concentração mais baixa de G418 que mata todos os mESCs não-alvo. Se não há colónias são observados, esta é indicativa de uma transfecção ineficiente. Nesse caso, é vantajoso para optimizar o processo de transfecção utilizando plasmídeos repórter que permitem a expressão da EGFP ou LacZ. Se as obras protocolo de transfecção, mas ainda não são observadas colônias, verifique o vetor pRMCE-DV1 RMCE compatível e cre-excisadas e o FLPe eplasmídeo xpression com RE digestão e sequenciação. É aconselhável fazer um lote grande de mESCs parentais e FLPe vector e para congelar várias aliquotas de eles para reduzir a variação entre experiências.

Uma desvantagem desta estratégia de estrutura-função é que as construções de salvamento não são expressos a partir do locus endeno, mas, em vez de dentro do locus ROSA26, com um promotor ubíquo, moderadamente activo. Em comparação com outras tecnologias, em que os níveis sobre-expressão são muitas vezes suprafisiológicas visto, este sistema permite a expressão do transgene fisiológico, o qual é estável durante em experiências in vitro de diferenciação e em várias linhagens celulares. Observou-se que heterozigoto, ROSA26 mediadas por expressão do transgene resulta numa expressão da proteína p120ctn que era cerca de metade dos níveis endógenos de p120ctn mESCs de controlo de tipo selvagem, mas que foi suficiente para resgatar o p120ctn observado KO fenótipos ^12. Da mesma forma, foi Demonstrated anteriormente que um heterozigoto, ROSA26 mediada nível de expressão do transgene Zeb2 é suficiente para resgatar os fenótipos knockout Zeb2 observadas in vitro e in vivo em diferentes linhagens celulares ^29. Outra armadilha potencial é o facto de que os genes que são indispensáveis ​​para MESC auto-renovação não são propícios para tais estudos de estrutura-função. Para excluir isso, é aconselhável para caracterizar mESCs recém-criadas KO para os seguintes critérios: a proliferação, morfologia da colônia, e expressão de genes stemness. Também é recomendado para verificar a expressão do gene de interesse, tanto em mESCs e em células comprometida-linhagem.

Para além de realizar os estudos de estrutura-função em mESCs KO constitutivos, também se poderia ter uma abordagem condicional utilizando o sistema Cre / loxP. A última abordagem permite um KO de linhagem específica, sem afectar as células vizinhas e de apoio. Além disso, mESCs KO condicionais allow para a realização de estudos de estrutura-função, se houver um fenótipo nas mESCs KO constitutivos. Para gerar RMCE-compatível, condicionais-KO mESCs, os ratinhos homozigóticos floxed com um controlador de Cre específica de células-tipo são criados com ratinhos RMCE-compatível; MESC são isolados de seus descendentes. A vantagem deste sistema é que a recombinase Cre não é expressa em mESCs e apenas se torna activo quando os mESCs são diferenciados na respectiva linhagem celular. Em RMCE-compatível, condicional-KO mESCs, Cre recombinação irá induzir a inactivação simultânea do gene endógeno e a expressão R26 accionada do construto salvamento usando um vector condicional pRMCE-DV1 segmentação (LMBP 08870) ^11.

Além disso, o sistema de estrutura-função permite o estudo de mutações que são encontrados em várias doenças e permite-nos testar o impacto destas mutações sobre as funções da proteína. Como exemplo, temos identificado ZEB2 mutatiões em pacientes com neoplasia mieloproliferativa, feito vectores de direccionamento que contêm estes ZEB2 mutantes, Transportado-los para o R26-locus da mESCs Zeb2 KO através RMCE, e examinaram o efeito das mutações sobre a estabilidade da proteína em si ^30. Esta tecnologia dá uma maior compreensão da bioquímica de tais mutantes na mESCs, bem em qualquer linhagem, desde mESCs são pluripotentes.

Em conclusão, esta abordagem estrutura-funo baseado no MESC depende de isolamento MESC eficiente e tecnologia de segmentação e permite a identificação de domínios e funções de uma dada proteína importantes dentro de um contexto biológico definido. Através da partilha de ratos (esperma congelado está disponível mediante solicitação) e plasmídeos (distribuído a partir de BCCM / LMBP e Addgene), queremos abrir essa tecnologia para toda a comunidade científica.

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecemos Jinke D'Hont, Frederique Van Rockeghem, Natalie Farla, Kelly Lemeire e Riet De Rycke por sua excelente suporte técnico. Agradecemos também a EEF Parthoens, Evelien Van Hamme, e Amanda Goncalves do Mecanismo BioImaging Núcleo do Centro de Pesquisa Inflamação por sua assistência especializada. Reconhecemos membros do nosso grupo de pesquisa para discussões valiosas. Este trabalho foi apoiado pela Política belga Science (Belspo Interuniversitário de atração poloneses - Prêmio IAP VII-07 DevRepair; https://devrepair.be), pela Fundação Rainha Elisabeth Medical, Bélgica (GSKE para 2008-2010; http: // www .fmre-gske.be), e pelas acções concertadas de pesquisa (GOA 01G01908) da Universidade de Ghent, Bélgica (http://www.ugent.be/en/ghentuniv). SG é uma pós-bolseiro dos meios de investigação Flandres (FWO-V).