Struktur-Funktions-Studien in embryonalen Maus-Stammzellen Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch

Proteine ​​enthalten oft mehrere Domänen, die verschiedene zelluläre Funktionen ausüben kann. Gen-Knock-outs (KO) nicht über diese funktionelle Vielfalt berücksichtigen. Hier berichten wir über eine Rekombination vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) -basierte Struktur-Funktions-Ansatz in KO embryonalen Stammzellen, die für die molekulare Präparation von verschiedenen funktionellen Domänen oder Varianten eines Proteins ermöglicht.

Gentechnik in Maus-Embryonen oder embryonale Stammzellen (mESCs) ermöglicht die Untersuchung der Funktion eines bestimmten Proteins. Proteine ​​sind die Arbeitspferde der Zelle und bestehen oft aus mehreren funktionellen Domänen, die durch posttranslationale Modifikationen beeinflusst werden kann. Die Verarmung des gesamten Proteins in bedingten oder konstitutiv Knock-out (KO) Mäusen nimmt nicht berücksichtigt diese funktionale Vielfalt und Regulierung. Eine MESC Linie und ein abgeleitetes Mausmodell, in dem eine Andockstelle für FLPe Rekombination vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) innerhalb des ROSA26 (R26) Locus eingefügt wurde, wurde bereits berichtet. Hier berichten wir über eine Struktur-Funktions-Ansatz, der für die molekulare Zerlegung der verschiedenen Funktionalitäten eines Multi-Domain Protein ermöglicht. Zu diesem Zweck RMCE-kompatible Mäuse müssen mit KO-Mäusen gekreuzt werden und dann RMCE-kompatibel KO mESCs isoliert werden müssen. Als nächstes kann ein Panel von putativen rescue-Konstrukten in die R26-Locus über RMCE targeti eingeführt werdenng. Die Kandidaten rescue cDNAs kann leicht zwischen RMCE Seiten des Targeting-Vektors unter Verwendung von Rekombinations-Klonierung eingefügt werden. Als nächstes wird KO mESCs mit dem Targeting-Vektor in Kombination transfiziert mit einer FLPe Rekombinase Expressionsplasmid. RMCE reaktiviert die promotorlose Neomycin-Resistenz-Gene in den ROSA26 Andockstellen und ermöglicht die Auswahl des korrekten Targeting-Ereignisses. Auf diese Weise werden hohe Wirkungsgrad Targeting von nahezu 100% erzielt, so dass zum Einsetzen mehrerer putativen rescue Konstrukte in eine halb-hohen Durchsatz Weise. Schließlich kann eine Vielzahl von R26 getriebenen Rettungs Konstrukte auf ihre Fähigkeit getestet werden, um den Phänotyp zu retten, die in Eltern KO mESCs beobachtet wurde. Wir präsentieren eine Proof-of-Principle-Struktur-Wirkungs-Studie in p120 Catenin (p120ctn) KO mESCs mit endoderm Differenzierung in Embryoidkörpern (EVG) als phänotypische Anzeige. Dieser Ansatz ermöglicht die Identifizierung von wichtigen Domänen, putative nachgeschaltete Wege und krankheitsrelevanten PunktMutationen, die KO-Phänotypen für ein bestimmtes Protein zu Grunde liegt.

Es wird geschätzt, dass etwa 20.000 Säugergenomen Protein-kodierenden Gene enthalten. Alternatives Spleißen und posttranslationale Modifikationen erhöhen die Proteinrepertoires. Proteine haben einen modularen Aufbau ¹ und häufig mehrere Wechselwirkungsdomänen enthalten, die ihre Einstellung ² in verschiedene Proteinkomplexe und ihre Beteiligung an mehreren zellulären Prozesse ermöglichen. Ein Beispiel dafür ist das multifunktionale Protein namens p120ctn. p120ctn wird durch das CTNND1 Gen codiert und besteht aus einer großen zentralen Domäne Armadillo - Repeat flankiert von einem N-terminalen und C-terminalen Region. Die Armadillo-Domäne von p120ctn bindet an eine hoch konservierten Juxtamembrandomäne der klassischen Cadherine, die in Zell-Zell-Adhäsion beteiligt sind, aber es bindet auch an den Repressor Kaiso. Die N-terminale Domäne von p120ctn interagiert mit verschiedenen Kinasen, Phosphatasen, kleinen RhoGTPasen und Mikrotubuli-assoziierte proteins ^3. Interessanterweise als Ergebnis des alternativen Spleißens, p120ctn Isoformen können ⁴ aus vier alternativen Startcodons erzeugt werden. p120ctn Isoform 1A ist die längste, wie es aus dem am meisten 5' translatiert wird Startcodon und enthält die Volllängen-N-terminales Segment. In p120ctn Isoformen 3 und 4 ist dieses N-terminale Segment teilweise gelöscht und vollständig sind. die genaue Rolle von Proteinen (oder Protein-Isoformen) und die Domänen in verschiedenen zellulären Funktionen zu verstehen, bleibt eine Herausforderung.

Gen-Targeting in mESCs ermöglicht die Untersuchung der Funktion eines Proteins durch die genetische Deletion des entsprechenden Gens und hat weitgehend dazu beigetragen, die Identifizierung von entwicklungs wichtig und krankheitsrelevanten Genen und Wegen. Dieser Durchbruch in der reversen Genetik war das Ergebnis der Fortschritte in den Bereichen der MESC Isolierung und Gene aufgrund homologer Rekombination Targeting ⁵ . Homologe Rekombination ist ein Verfahren, bei der DNA-Fragmenten zwischen zwei ähnlichen oder identischen Nukleins Einheiten nach doppelsträngige (ds) DNA-Brüchen ausgetauscht werden. Normalerweise ist HR ineffizient, weil dsDNA Pausen selten sind. Seit kurzem wird die Effizienz der Homologie-directed gene targeting könnte unter Verwendung von ortsspezifischen Nucleasen erhöht ^{6, 7,} aber unglücklicherweise sind diese anfällig für Nebeneffekte ^8. Eine zuverlässigere Technik zu ermöglichen, Gen-Targeting ist RMCE, die auf ortsspezifische Rekombinationssysteme, wie Cre / loxP oder FLPe / FRT-basiert. LoxP und Frt - Sequenz werden in Bakteriophage P1 und Saccharomyces cerevisiae, bzw., und aus 34 bp, einschließlich einer asymmetrischen 8 - bp - Sequenz gefunden, die die Orientierung der Website festlegt. Auf der anderen Seite ist die Orientierung von, zum Beispiel, zwei loxP-Stellen innerhalb einer DNA-Strecke werden bestimmen, ob die floxed DNA exzidiert wird oder i⁹ nversed nach Cre-vermittelter Rekombination. Darüber hinaus kann Cre induziert auch eine Translokation, wenn zwei Standorte auf verschiedene Chromosomen befinden. RMCE nutzt artfremden Rekombinationsstellen, die nicht kreuzreagieren und das in einer genomischen Locus eingebettet sind. In Anwesenheit eines Donator - Plasmid , das ein DNA - Fragment mit den gleichen hetero Stellen flankierte enthält, fügt die Rekombinase dieses DNA - Fragment in den kompatibelen RMCE genomischen Locus durch doppelte versetzte Translokation (Abbildung 1). Hier wird nur richtig RMCE gezielte Klone können drug resistance dank eines Promotors auf dem ankommenden Vektor rendern , die ein „gefangen“ , stellt promotorlose Neomycinresistenzgen (Neo ^R) in der R26 Genom der Docking - Zellen (Abbildung 1) ^{10, 11.} Daraus ergibt sich eine sehr hohe Targeting Effizienz, oft nahe 100% ^{11 <}/ sup> ^12. Abschließend ist RMCE basierte Targeting sehr effizient und kann für Struktur-Funktionen Studien verwendet werden; Jedoch erfordert es eine vorgefertigte genomischen Locus.

Abbildung 1 : Schematische Darstellung der RMCE Vermittelte Targeting. RMCE ermöglicht den Austausch von DNA-Segmenten aus einem ankommenden Targeting-Vektor zu einem definierten genomischen Locus, wenn sowohl zwei hetero FRT-Stellen Harbor (dargestellt durch weiße und rote Dreiecke). Darüber hinaus enthält das manipulierte genomischen Locus und ein promotorloses Neomycin-Resistenz verkürztes (Neo ^R) -Gen. Durch die Bereitstellung von Wiederherstellung einen Promotor und Startcodon in dem ankommenden DNA-Fragmente, nur korrekte Rekombinationsereignisse Neomycin-Resistenz, was zu hohen Effizienzen Targeting. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version t anzuzeigenseine Figur.

Genomtechnik in mESCs ermöglicht die Erzeugung von RMCE-kompatible Mäuse. Im Jahr 1981 gelang es zwei Gruppen von pluripotenten Zellen der inneren Zellmasse (ICM) von Blastozysten in Erfassung und in Kultur ^{13, 14} aufrechtzuerhalten. mESCs der Lage ist, die Selbsterneuerung und Differenzierung in alle Arten von embryonalen und adulten Zellen, einschließlich der Keimzelllinie. Daher Gene in mESCs Targeting ermöglichen Reverse genetische Studien über die Entwicklung von konstitutiven oder bedingten KO-Mäusen (die Cre / loxP-System verwendet wird). Allerdings ist die klassische Art und Weise Maus-ES-Zellen zu isolieren, ist sehr ineffizient. Verschiedene Verbesserungen haben große stark erhöht die Erfolgsrate für die Ableitung MESC Linien, einschließlich der Verwendung eines definierten serum-Ersatz (SR) Medium ^15, im Wechsel zwischen MESC Medium SR und fötales Rinderserum (FBS) , ^16, und die Verwendung von pharmakodynamischen enthaltendlogische Verbindungen wie pluripotin oder 2i ^17. Pluripotin, ein kleines synthetisches Molekül, ermöglicht die Ausbreitung von mESCs in einem undifferenzierten Zustand in Abwesenheit von Leukämie - Hemmfaktor (LIF) und embryonalen Mausfibroblasten (MEFs) ^18. Schließlich hat es sich gezeigt , dass mESCs kann mit einem sehr hohen Wirkungsgrad ( in der Nähe von 100%) isoliert werden , wenn ein SR / FBS - Medium Wechsel - Protokoll mit LIF kombiniert und pluripotin ^{19, 20.} Diese Protokolle ermöglichen die effiziente Isolierung von RMCE-kompatibel KO mESCs, die anschließend für Struktur-Funktions-Studien verwendet werden können.

Dieses Dokument beschreibt ein Verfahren, das man die Schlüssel-Domänen oder Reste innerhalb eines Proteins zu identifizieren, ermöglicht es, die für spezifische zelluläre Prozesse verantwortlich sind. Zu diesem Zweck wird eine Pipeline von fortschrittlichen Technologien, die eine effiziente MESC Isolierung ermöglichen, Targeting-Vektor Montage und MESC Targeting war erstellend. Als solche großen Platten mit Proteinisoformen, Domain - Mutanten und Effektoren können in KO mESCs eingeführt werden können und für ihre Fähigkeit , die in - vitro - KO - Phänotyp zu retten ausgewertet werden.

Alle Versuche an Mäusen wurden nach institutionellen, nationalen und europäischen Tiere Vorschriften durchgeführt.

1. Isolierung von RMCE-kompatibel KO mESCs

1. Breed heterozygot KO - Mäuse mit RMCE-kompatible Mäuse, wie ROSALUC Mäuse ¹⁰ oder ROSA26-iPS - Mäuse ^21. Beide RMCE-kompatible Mäuse wurden auf einem Misch 129 / C57BL6 / Swiss Hintergrund gehalten.
   HINWEIS: Kreuzung mit heterozygot KO-Mäusen wird empfohlen, embryonale Letalität in homozygot KO-Mäusen zu überwinden.
2. Verwenden PCR heterozygot KO - Mäuse wählen ¹² eine RMCE Kassette im R26 - Locus enthält.
3. Breed RMCE-kompatibel, heterozygot KO-Mäuse mit heterozygot KO-Mäusen und isolieren RMCE-kompatibel, homozygot KO Blastozysten.
   1. Legen Sie Zeit Paarungen am Abend und prüfen für Kopulation am nächsten Morgen eingesteckt wird.
      HINWEIS: Die Stecker sind aus geronnenem Absonderungen aus den koagulierenden und vesikuläre Drüsen der männlichen gemacht.Diese Stecker füllen die Vagina des Weibchens und bleiben für 8-24 Stunden nach der Züchtung. Plugged Frauen gelten als 0,5 dpc (Tage post coitum) Embryonen zu tragen.
      1. Um Stecker zu prüfen, heben Sie das Weibchen durch die Basis ihres Schwanzes und durch ihre vaginale Öffnung für eine weißliche Masse untersuchen. Verbreitet die Lippen der Vulva leicht mit einer abgewinkelten Sonde, wenn der Stopfen nur schwer zu sehen. Separate gesteckt Frauen von ihren männlichen.
   2. Sammeln Sie Blastozysten bei 3,5 dpc.
      1. Euthanize trächtige Weibchen von den zugelassenen Verfahren (zB Genickbruch). Machen Sie einen midventral Schnitt und sezieren die Gebärmutter und Eileiter (noch aneinander befestigt) mit feinen Schere und Pinzette.
      2. Biegen, um eine 26-Gauge-Nadel in einem Winkel von 45 °. Anhänge eine 1-ml-Spritze mit M2-Medium auf diese gebogene Nadel gefüllt und es verwendet, die Blastozysten aus dem Gebärmutter in den Deckel einer 10-cm-Schale zu spülen.
         1. Führen Sie die Nadel in das Ende des Uterus, die am nächstendie Eileiter. Halten Sie die Nadel an Ort und Stelle mit einer feinen Pinzette während Schieben des Kolbens; zeigt eine erfolgreiche Spülung der Gebärmutter Schwellung.
      3. Verwenden, um eine Mundpipette (mit einem Durchmesser von 100 bis 200 um) alle Embryonen zu sammeln und waschen, sie zweimal in einem Tropfen frischen Mediums M2. Unmittelbar nach dem Waschen sie übertragen die Blastozysten zu den Kulturplatten (siehe unten).
         HINWEIS: Die Präparation und Handhabung von Blastozysten sollte in laminarer Luftströmung erfolgen.
4. Isolieren RMCE-kompatibel KO mESCs
   1. Vorbereiten einer 12-Well - Platte mit Mitomycin-C-behandelten DR4 MEFs (siehe Tabelle of Materials) einen Tag vor der Blastozyste Isolation.
      ANMERKUNG: Diese MEFs wurden isoliert aus Tg (DR4) 1Jae / J - Mäusen , die vier arzneimittel selektierbare Gene enthalten , und verleihen eine Resistenz gegen Neomycin, Puromycin, Hygromycin, und 6-Thioguanin ^22.
      1. Coat alle Kulturplatten mit 0,1% Gelatine. In 0,1% Gelatinefür 5 min bei 37 ° C in 5% CO ₂ und aspirieren die Gelatinelösung zu den Kulturplatten, inkubieren. Seed ein Viertel einer Phiole P2 MEFs in einer 12-Well - Platte und wächst sie in 2 ml MEF - Medium (siehe Tabelle 1, die Tabelle der Materialien) zu einer konfluenten Monoschicht ^19.
      2. Inaktivieren sie mit Mitomycin C (10 ug / ml) für 3 h und wäscht sie zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ^19.
   2. Verwendung einer Mundpipette Platte, die die Blastozysten auf gelatinisierte 12-well-Platten (1 Vertiefung / Embryo), mit Mitomycin-C-behandelten MEFs in SR-ES-Zell-Medium (2 ml / Vertiefung), ergänzt mit entweder 2 uM pluripotin oder mit 2i (1 & mgr; M Inhibitor Erk PD0325901 und 3 uM GSK3-Inhibitor CHIR99021). Inkubieren bei 37 ° C in 5% CO _2.
   3. Aktualisieren Sie die SR-ES-Zellmedium (ergänzt mit pluripotin oder 2i) alle 2 - 3 Tage.
   4. Untersuchen Sie jeden Blastozyste unter einem stereomicroAnwendungsbereich bei 4,0X Vergrößerung und prüfen die Schraffur und die Befestigung an der MEF-Schicht.
      HINWEIS: Wenn Blastozysten Luke, sie verlieren die Zona pellucida, die sie kapselt. Wells mit ungebunden Blastozysten müssen das Pipettieren mit dem Mund aufgefrischt werden verwendet wird.
   5. Wählen Sie einzelne ICM Auswüchsen (ein Stereomikroskop mit) nach 10 bis 12 Tagen Kultur eine P10-Pipette mit Einwegspitzen verwenden. Übertragen, das Auswachsen in etwa 10 & mgr; l Medium zu einer V-förmigen, 96-Well-Platte, enthaltend 30 & mgr; l / Vertiefung PBS (bei Raumtemperatur).
   6. Je 50 ul 0,25% Trypsin in jede Vertiefung einer Multikanalpipette und Inkubation für 3 min bei 37 ° C in 5% CO _2.
   7. In 100 ul FBS enthaltenden MESC Medium; die ICM Auswüchse in einzelne Zellen dissoziiert von 10-15 mal pipettiert; und übertragen Sie die dissoziierten Zellen zu Mitomycin-C-behandeln 96-Well-Platten MEF, die einen Tag vorbereitet wurden, bevor die ICM Kolonien gepickt werden.
   8. Von diesem Schritt vorwärts, omi t pluripotin oder 2i vom MESC Medium. Am nächsten Tag, ändern Sie das Medium aus FBS- auf SR-haltigen MESC Medium (100 & mgr; l / Well).
   9. Erweitern Sie die etablierten MESC Linien von 96- bis 24-Well - Format ^19.
      1. Waschen Sie die Zellen mit 200 ul PBS, werden 50 & mgr; l Trypsin und Inkubation für 5 min bei 37 ° C in 5% CO 100 l FBS-basiertes MESC Mediums. dissoziieren durch Pipettieren von 10 - 15 mal unter Verwendung einer Mehrkanalpipette; und übertragen die dissoziierten Zellen zu Mitomycin-C-behandelten 24-Well-Platten MEF.
      2. Wechseln Sie auf SR-basierten Medium am nächsten Tag. Erweitern Sie die mESCs in ähnlicher Weise von 24- bis 6-Well-Format. Machen Sie 3 bis 4 Frost aus einer konfluenten 6-Well - Platte ^19.
   10. Identifizieren RMCE-kompatibel, homozygot KO mESCs unter Verwendung von PCR - Primern für die R26 - Locus ²³ und KO - Allel der Wahl (in diesem Fall p120ctn; PCRs für p120ctn null und floxed Allele wurde beschrieben , bevorlass = "xref"> 12).

Tabelle 1. Nährmedien. Alle Medien wurden bei 4 ° C gelagert und erwärmt auf 37 ° C 30 min vor der Verwendung.

2. Erzeugung eines RMCE-kompatiblen Vektor-Targeting Rekombinationsklonierung Verwendung

1. Klon , der die Rettungs Konstrukte in Rekombinations-kompatible Vektoren Restriktionsenzym (RE) -basierte oder ²⁴ Klonierungstechniken-PCR basiert. Stellen Sie sicher, dass die cDNAs ein Stop-Codon enthalten.
   1. Design AttB-markierte Primer ^24. Sicherzustellen, dass der Vorwärtsprimer enthält die folgenden Elemente: a stretch GGGG, eine Stelle attB1, ein Linker, eine Kozak-Sequenz und etwa 25 Nucleotide der cDNA rescue (beginnend mit ATG). Achten Sie darauf, dass der Reverse-Primer eine ähnliche Zusammensetzung hat: eine GGGG Strecke, eine attB2 Website, einen Linker, und etwa 25 Nukleotides von Rettungs cDNA (reverse Komplement).
   2. Amplify die Rettung cDNA über PCR AttB-flankierten cDNA zu erhalten.
   3. Durchführen einer 10-ul BP-Reaktion mit 100 ng AttB-flankierten cDNA und 150 ng der Rekombination-kompatiblen Donorvektor, der ein Kanamycin-Resistenz-Gen enthält.
   4. Transformieren 5 ul der BP in Mischungen Hitzeschock-kompetente MC1061 Escherichia coli (E. coli) Bakterien (ähnlich wie in Schritt 2.3 beschrieben).
   5. Identifizieren Kolonien mit dem korrekten rescue cDNA enthaltenden Vektoren (ähnlich wie in Schritt 2.4 beschrieben)
2. Durchführen einer 10-ul LR-Reaktion unter Verwendung von 100 ng von Rettungs- cDNA enthaltenden Vektor; 150 ng des Cre-exzidiert pRMCE DV1-Vektor ¹¹ (LMBP 8195); und 2 ul Rekombinase-Mischung, die enthält eine Phagen-codierte Integrase und Excisionase und ein bakterielles Integration Host Factor. bei 25 ° C für 2 h inkubiert.
   HINWEIS: Eine LR-Reaktion ist eine Rekombination reagierenIons in der ein Eintrag Klon attL-Stellen und einen Zielvektor, enthaltend attR-Stellen enthalten, wird durch den LR CLONASE Enzymmix rekombiniert. Dies führt zu einem Ausdruck Klon, attB-Stellen das Gen von Interesse flankieren.
3. Transformieren 5 ul der LR Mischungen in Hitzeschock-kompetenten MC1061 E. coli - Bakterien.
   1. Zugabe von 5 & mgr; l LR - Mischungen zu einem gerippten, umging, 2-ml - Schraubdeckel Rohr mit 40 ul Hitzeschock-kompetenter E. - coli - Bakterien und Inkubation für 20 min auf Eis. Inkubieren Sie für 5 min bei 37 ° C.
   2. 1 ml Luria-Brühe (LB) Medium und Inkubation für 1 h bei 37 ° C. Platte 50 & mgr; l auf Ampicillin (Amp; 100 ug / ml) enthaltenden Agarplatten wachsen und über Nacht bei 37 ° C.
4. Identifizieren Sie die Kolonien mit dem richtigen Zielvektor.
   1. Pick-5 Kolonien zufällig eine p200 Spitze verwenden. Übertragen, um die Spitze zu einem Glasteströhrchen, das 2 bis 5 ml LB-Medium wachsen und über Nacht bei 37 ° C.
   2. ExTrakt den Plasmid-DNA aus den Bakterienkulturen im Handel erhältliche Kits.
   3. Validieren RE verdaut und Sequenzierung verwendet. Geschnitten 0,5-2 ug Plasmid unter Verwendung von 0,2 & mgr; L RE (20 U / ul) und 1 ul des entsprechenden 10-fach-Puffers in einer 10-ul-Reaktion. mindestens 1 h inkubieren bei 37 ° C und getrennt auf einem 1% Agarosegel. Wählen für Kolonien, die mit dem vorhergesagten Muster von DNA-Fragmenten.
      1. Analysieren der Vektoren bestätigt (50 ng / & mgr; l) mit Tlox F (ATC ATG TCT GGA TCC CCA TC) und IRES R (GGG GCG GAA TTC GAT ATC AAG) Primer (5 pmol / & mgr; l) unter Verwendung von Sanger-Sequenzierung.

3. RMCE vermittelte MESC Rescue Targeting Konstrukten der R26 Locus

1. Starten Sie eine Kultur der RMCE-kompatibel KO mESCs und Passage sie mindestens zweimal auf MEFs in-FBS Basis MESC Medium. Teilen Sie die mESCs auf einem verkleistert 6-Well-Platte.
2. Am nächsten Tag, aktualisieren Sie die Zellen, bei etwa 50% Konfluenz, mit 1,5ml FBS-basierte MESC Medium und transfektieren die mESCs mit einem Cre-exzidiert pRMCE DV1-Targeting-Vektor rescue cDNA enthält.
   1. Machen Sie einen DNA-Mix. 1 ug Targeting - Vektor und 1 & mgr; g FLPe-Expressionsplasmid ²⁵ bis 250 & mgr; l reinen DMEM - Medium.
   2. Machen Sie eine Lipofektion Mix. ADD 7 uL Lipofektion basierte Transfektionsreagenz (zB Lipofectamine 2000) zu 250 & mgr; l reinem DMEM - Medium , und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur (RT).
      Hinweis: ähnliche RMCE Targeting - Effizienz wurden mit anderen Lipofektion Basis erhalten Reagenzien (zB Lipofectamin LTX und Effectene).
   3. Mischen Sie das DNA-Gemisch mit der Lipofektion Mischung und Inkubation für 20 min bei RT. Pipette, um die Transfektion Mischung auf die aufgefrischt mESCs. Vorsichtig schwenken und lassen Sie über Nacht.
3. Ein Tag nach der Transfektion aufgeteilt alle mESCs aus der 6-Well-Platte auf eine 10-cm-Kulturschale mit einer konfluenten Schicht von DR4 MEFs und 10 ml FBS-basiertem mESC Medium.
4. Zwei Tage nach der Transfektion auszuwählen MESC Klont mit dem korrekten FLPe-vermittelten Kassettenaustausch durch Zugabe von 0,2 mg / ml G418 (100-fach) auf das Medium.
   HINWEIS: Stellen Sie eine Kill-Kurve für jede Charge von G418 die niedrigste Konzentration von G418 zu identifizieren, die alle mESCs töten.
5. Aktualisieren Sie die mESCs täglich mit G418-haltigem MESC Medium. 10 Tage, so dass diese auswählen und erweitern gemäß Schritt 1.4 - Kolonien sollen nach 7 erscheinen.
6. Bestätigen Sie die richtige Klone mittels PCR ^11.

4. Differenzierung von mESCs in Embryoid Bodies (EBs)

1. Starten Sie eine Kultur der KO mESCs mit R26 getriebenen Rettungs Konstrukte und Passage sie mindestens zweimal auf MEFs in-FBS Basis MESC Medium. Passage die mESCs einmal auf verkleistert 6-Well-Platten erhalten der MEFs befreien.
2. Waschen mit PBS und trypsinize die fast-konfluenten MESC Kulturen. Platte dissoziiert mESCs in verschiedenen Verdünnungen (1/20 und 1/40) auf nicht-adhärenten, bakteriell-grade petri-Gerichte in Differenzierungsmedium.
3. Lassen Sie EBs in diese Gerichte für 30 Tage zu bilden. Aktualisieren Sie das Medium alle 2 - 3 Tage nach dem folgende Verfahren: Übertragung der EB Suspension auf ein 50-ml-Röhrchen, lassen Sie die EBs durch die Schwerkraft, Entfernen des Überstandes, fügen Sie frisches Medium, und übertragen Sie die EB Suspension zurück zu einer bakteriellen Qualität Gericht.
4. Analysiert die gezielten mESCs und EBs durch Immunofluoreszenz und Transmissionselektronenmikroskopie unter Verwendung von Protokollen , die zuvor ¹² beschrieben wurden.

Das Verfahren RMCE-kompatiblen KO MESC Linien zu isolieren , ist in Abbildung 2 dargestellt. Zwei aufeinanderfolgende Züchtungen sind erforderlich RMCE-kompatibel KO Blastozysten zu erhalten. Zunächst werden heterozygot KO-Mäuse mit RMCE-kompatibelen Mäusen gekreuzt RMCE-kompatibel, heterozygot KO-Mäuse zu erhalten. Diese Mäuse werden dann für zeitlich Paarungen mit anderen heterozygot KO-Mäusen verwendet, zu erhalten, 3,5-dpc, RMCE-kompatibel, homozygot KO Blastozysten. Die Wahrscheinlichkeit eines solchen Embryos zu erhalten, ist eine von acht, wie sie durch Mendelsche Vererbung vorhergesagt. Daher ist ein effizientes MESC Isolierungsprotokoll erforderlich. Verwendung pluripotin basierte oder 2i-basierten Protokolle, sind wir in der Lage mESCs Linien, einschließlich RMCE-kompatibelen p120ctn KO mESCs, mit einem Wirkungsgrad von etwa 94% (n = 114 Blastozysten) und 64% (n = 22 Blastozysten) zu isolieren, die jeweils ^{12, 19.} Typischerweise Blastozysten Luke nach 3 bis 6 Tagen in vitro (DIV) Kultur; Dies wird durch die Befestigung von ICM Auswüchsen auf MEFs oder Gelatine-beschichteten Schalen folgt. Am Tag 12 werden große ICM Auswüchse gebildet , dass getreu entstehen lassen MESC Linien (Abbildung 2). Durch diese hocheffiziente MESC Isolierungsverfahren ist es möglich, RMCE-kompatibel KO mESCs von einem oder zwei gesteckt Weibchen zu erhalten.

Abbildung 2. Isolierung von RMCE-kompatibel KO mESCs. (A) Zuchtstrategie homozygot, RMCE-kompatibel KO mESCs zu erhalten. (B) Schematische Darstellung pluripotin- oder 2i-basierte MESC Isolierungsverfahren. Weiß Maßstab: 25 & mgr; m. Schwarz Maßstabsbalken: 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

So ordnen Sie die Domänen oder amino Säuren innerhalb eines Proteins, das für spezifische zelluläre Funktionen wichtig sind, kann man jetzt wieder einführen, über RMCE, in voller Länge oder mutierten Konstrukte in KO mESCs und prüfen sie auf ihre Fähigkeit, die KO-Phänotyp wiederherzustellen. Targeting - Vektoren für viele verschiedene Domänen Mutanten und Punktmutanten können effizient durch rekombinatorische Klonieren (3A) erzeugt werden. Rekombinatorischen Klonen beruht auf der Erkennung spezifischer Befestigung (ATT) DNA-Sequenzen, die durch die Rekombinase-Mischung, die einen Austausch von Att-flankierten DNA-Fragmente zwischen verschiedenen Plasmiden vermittelt. Das Rekombinationsereignis Klonierungssystem wählt nur korrekt Vektoren rekombinierte durch zwischen Vektoren Schalen , die verschiedene Antibiotika-Resistenz - Gene enthalten und durch einen Gegenselektionsmarker eingesetzt wird , die „Kontrolle des Zelltods B“ (ccdB) -Gen, in den Zielvektor (3A) . Wir haben mehr als 25 erzeugten Cre-exzidiert pRMCE DV1-Vektoren mit einer nahezu 100% Effizienz Targeting (einige Beispiele Are in Tabelle 2 gezeigt).

Tabelle 2. Überblick über die Targeting - Vektor Montage und RMCE-vermittelte MESC Targeting.

Verschiedene rescue Konstrukte in einem cre-exzidiert pRMCE-DV1 eingebetteten Vektor - Targeting können leicht an KO mESCs abgezielt werden unter Verwendung von RMCE (3B). Wir zuvor für 19 verschiedene rescue Konstrukte auf der Erzeugung von 133 gezielter MESC Klont berichtet, das in die Locus von R26 p120ctn KO mESCs über RMCE mit einem durchschnittlichen Wirkungsgrad von 93% ¹² eingeführt wurde. Hier berichten wir über die Ausrichtung der zusätzlichen Konstrukte mit ähnlichen hohen Effizienzen, darunter ein CAAX-tagged p120ctn 1A, epithelial-to-mesenchymale Transition (EMT) Inducer der SNAI und ZEB Familie und N-Cadherin, in p120ctn KO mESCs ( Tabelle 2).

Abbildung 3. RMCE-basierte Targeting in KO mESCs. (A) Rekombinase-vermittelte Montage von RMCE-kompatiblen Zielvektoren. (B) Targeting of putative rescue Konstrukten auf den R26 - Locus von homozygoten KO mESCs über RMCE. (C) PCR-basierte Validierung von RMCE-bezogenen MESC Klone. DNA wurde aus RMCE-bezogenen MESC Klone extrahiert und wurde durch PCR amplifiziert unter Verwendung eines Vorwärts-Primers, der in der endogenen Locus R26 und einem Rückwärtsprimer eingebettet ist, die in dem eingehenden pRMCE DV1-Konstrukts befindet. Eine 560-bp-Bande wird für richtig gezielte Klone beobachtet. Unconfirmed Klone werden in rot dargestellt. M1: 1 kb DNA-Leiter. M2: 1 kb Plus-DNA-Leiter. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Sobald eine Gruppe von Rettungs mESCs erhalten wird, muss es auf seine Fähigkeit, um die KO-induzierte Phänotyp zu umkehren. Es wurde vor kurzem , dass p120ctn KO mESCs nicht gezeigt in zystische EBs als Folge defekter endoderm Polarisation ¹² zu unterscheiden. Cystic EB Morphologie kann als phänotypische Auslesen verwendet werden , um verschiedene Rettungs Konstrukte (4A) durchmustern. Als Beweis des Konzeptes haben wir gezeigt, dass R26 getriebene p120ctn Isoform 1A (R_p120_1A) das p120ctn KO Phänotyp retten könnte (4B, 4C) ^12. Darüber hinaus dieser Bildschirm identifizierte E-Cadherin, aber nicht RhoA, ist ein wichtiger Partner von p120ctn während endoderm Spezifikation (4B und C) ^12. Die Leichtigkeit der Rettung Einführung baut KO mESCs p120ctn uns weitere Hypothesen zu testen erlaubt. Zuerst würde, E-Cadherin-unabhängige Membran Verankerung von p120ctn zystische EB Bildung ermöglichen? Zu testenDabei fusionierten wir die K-Ras-Membran-Targeting-Motiv (CAAX) an den Carboxy-Terminus von p120ctn führte sie über RMCE KO mESCs p120ctn und machte EBs von ihnen. Allerdings dient dieses Konstrukt ein dominant negativ , die nicht der Bindung und Stabilisierung von E-Cadherin (4D) , und als Folge erlaubt, nicht das p120ctn KO Phänotyp (4C) zu retten. Zweitens sind Induktoren der EMT beteiligt? EMT ist ein wesentlicher Entwicklungsprozeß, der während MESC Differenzierung tritt auch auf und wird durch die SNAI und ZEB Familie von Transkriptionsfaktoren orchestriert, die direkt verschiedene epitheliale Marker - Gene , wie E-Cadherin - ^{26, 27} unterdrücken . In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen wurde die Expression von EMT - Induktor ZEB2 in Steuer EBs gefunden, aber nicht in p120ctn-null EBs (4E). Dennoch p120ctn KO mESCs mit der ROSA26-basierten Expression von EMT-Induktoren ZEB1, ZEB2 oder Schnecke gescheitert Zyste wiederherstellenIC - EB - Bildung (4C). Drittens können andere klassische Cadherine, wie N-Cadherin, funktionell E-Cadherin während endoderm Spezifikation ersetzen? Um dem abzuhelfen, N-Cadherin Rettungslinien wurden erzeugt. Zuvor wurde gezeigt , dass die ektopische Expression von E-Cadherin in p120ctn KO EBs teilweise die Bildung von zystischen EBs ¹² gerettet. Interessanterweise wird in einer ähnlichen Einrichtung, Zwang N-Cadherin - Expression (4C und F) zu retten fehlgeschlagen, was darauf hinwies , dass die E-Cadherin - Cadherin Hauptsubtyp für EB Adhäsion erforderlich ist , und kann nicht durch N-Cadherin ersetzt werden. Diese oben genannten Beispiele unterstreichen die Leichtigkeit, mit der biologischen Fragen können durch das System angesprochen werden.

Abbildung 4. phänotypische Screening von RMCE gezielte Rettung mESCs. (A) Die Bildung von zystischer EBs (durch Lichtmikroskopie erfasst; obere Bereichls) und richtige Endoderm Polarisation in EBs (erfaßt durch Transmissions-Elektronenmikroskopie und die Boden-Platten) wurden als die phänotypische Auslesung zum Testen der Fähigkeit der gezielten mESCs verwendet, um den p120ctn KO Phänotyp zu retten. Weiß Maßstab: 25 & mgr; m. Schwarz Maßstab: 200 & mgr; m. (B) im Überblick p120ctn Rettungs Konstrukte. p120ctn enthält eine zentrale Armadillo-Domäne, bestehend aus neun Armadillo-Wiederholungen (blau-Boxen), ist, dass, flankiert von einer N-terminalen Domäne (NTD) und C-terminalen Domäne (CTD). p120ctn Isoformen enthalten eine von vier alternative Startcodons (Pfeile), gegebenenfalls Sequenzen, die durch alternativ verwendet Exons A und C (schwarze Kästchen) codiert Feature und einschließen oder ausschließen zwei Rho-GTPase-Bindungsdomänen (FGE). p120ctn Isoformen 1A und 4A verwenden, um die erste und die vierte Translationsinitiations sind. Die Position der Mutationen wichtigen AA und die künstlichen Zugabe eines Membran-Targeting-Motiv (CAAX) gezeigt. EBD: E-Cadherin-Bindungsdomäne. (C) Graphzeigt den prozentualen Anteil der basischen oder zystische EB Morphologie in p120ctn KO-Zellen, die verschiedene R26 getriebenen rescue Konstrukte exprimieren. (D) Immunfluoreszenzfärbung für p120ctn (monoklonaler Maus - anti-p120ctn) und E-Cadherin (monoklonaler Maus - Anti-E-Cadherin) auf Steuer G4 mESCs oder p120ctn KO mESCs mit der R26-driven Expression von CAAX-tagged p120ctn Isoform 1A. Die Einschübe zeigen die gesamte MESC Kolonie. Maßstabsbalken: 10 & mgr; m. (E) Immunhistochemie für ZEB2 (monoklonalen Maus - anti-ZEB2; 7F7, hergestellt in-house) auf floxed (Kontrolle) und p120ctn KO EBs. Eine 3,5-facher Vergrößerung ist in den Bodenplatten gezeigt. Maßstabsbalken: 200 & mgr; m (oben), 100 & mgr; m (unten). (F) Die Transmissionselektronenmikroskopie von DIV12 EBs aus p120ctn KO - Zellen, die E- oder N-Cadherin - Promotor aus dem R26. Maßstabsbalken: 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version zu sehen thiWert.

Abschließend berichten wir über eine Pipeline von robusten Technologien, die mit Targeting-Vektor Montage und MESC Targeting eine nahezu 100% Effizienz in MESC Isolation kombiniert. Diese Pipeline ermöglicht es, die Vielseitigkeit von Proteinen mit Hilfe von Struktur-Funktions-Studien in mESCs zu entwirren.

Unsere MESC Isolationsmethode ist benutzerfreundlich und erfordert keine fortgeschrittenen Fähigkeiten oder Ausrüstung, wie Mikrochirurgie von Blastozysten. Somit ist diese Technologie zu einem großen Teil der wissenschaftlichen Gemeinschaft zugänglich. Jeder, der Grundzellkultur Erfahrung kann ICM Auswüchse propagieren und mESCs Linien etablieren. Allerdings erfordert die Spülung und die Handhabung von Blastozysten etwas Übung. Ein Mundpipette wird verwendet Blastozysten zu übertragen und besteht aus einer Mikropipette, einer Mikropipette Halter, Schläuche und einem Aspirator Mundstück ^28. Mikropipetten können durch Erhitzen der feinste Teil einer Pasteur-Pipette für einige Sekunden, Entfernen der Pipette aus der Flamme und zieht die beiden Enden maßgefertigte werden. Wählen Nadeln mit einem Durchmesser, der etwas größer ist als eine Blastozyste (100-200 um). Nadeln können nach dem Waschen mit destilliertem Wasser (3x) und EtOH (3 x) wiederverwendet werden. Nach unserer Erfahrung ist die Effizienz der pluripotin-basierte MESC Isolation höher im Vergleich zu 2i-basierte Protokolle ^12. Allerdings hat die Verwendung von pluripotin bei hohen Konzentrationen wurde genomische Instabilität ¹⁹ gezeigt zu induzieren.

RMCE basierte R26-Targeting in mESCs ergibt typischerweise 20 bis 40 Kolonien nach der G418-Selektion. Wenn mehr Kolonien beobachtet werden, bedeutet dies, dass die G418-Konzentration nicht optimal ist und erlaubt nicht gezielte mESCs, um zu überleben, die allgemeine Ausrichtung Effizienz zu beeinflussen. Daher ist es ratsam, dass für jede MESC Linie und für jeden neuen G418 Charge wird eine Tötungskurve macht die niedrigste G418-Konzentration zu identifizieren, die alle nicht gezielt mESCs tötet. Wenn keine Kolonien beobachtet werden, ist dies ein Hinweis auf eine ineffiziente Transfektion. In diesem Fall ist es sinnvoll, die Transfektionsverfahren unter Verwendung von Reporter-Plasmide zu optimieren, die der Expression von EGFP oder LacZ ermöglichen. Wenn die Transfektion Protokoll funktioniert, aber noch keine Kolonien beobachtet werden, überprüfen Sie die RMCE-kompatibel und cre ausgeschnittenen pRMCE-DV1-Vektor und die FLPe expression Plasmid mit RE-Verdau und Sequenzierung. Es ist ratsam, eine große Charge von elterlicher mESCs und FLPe Vektor zu machen und mehrere Teilmengen von ihnen zu reduzieren Variation zwischen den Experimenten gefrieren.

Ein Nachteil dieser Struktur-Funktions-Strategie ist, dass die Rettungs Konstrukte nicht von dem endogenen Locus exprimiert werden, sondern von innerhalb der ROSA26 Locus, mit einem ubiquitären, mäßig aktiven Promotor. Im Vergleich zu anderen Technologien, in denen supraphysiologische Überexpression Ebene oft gesehen werden, ermöglicht dieses System physiologische Transgen - Expression, die während der in vitro Differenzierung Experimenten und in verschiedenen Zelllinien stabil ist. Es war , dass heterozygot, ROSA26 vermittelte Transgen - Expression führt zu einer p120ctn Protein - Expression beobachtet , die etwa die Hälfte der endogenen p120ctn Ebenen des Wildtyp - Kontroll mESCs waren , aber das war ausreichend , um die beobachteten Phänotypen p120ctn KO ¹² zu retten. In ähnlicher Weise wurde es demonstrated zuvor dass eine heterozygote, in vitro ROSA26 vermittelte Zeb2 Transgen - Expressionsniveau ausreichend ist , beobachtet die Zeb2 knockout Phänotypen zu retten und in vivo in verschiedenen Zelllinien ^29. Eine weitere potentielle Gefahr ist die Tatsache, dass Gene, die für MESC unverzichtbar sind Selbsterneuerung nicht zugänglich sind für eine solche Struktur-Funktions-Studien. Um auszuschließen, dies ist es ratsam, neu gegründete KO mESCs für folgende Kriterien zu charakterisieren: Proliferation, Koloniemorphologie und die Expression von Genen stemness. Es ist auch die Expression des Gens von Interesse zu überprüfen, sowohl in mESCs und in abstammungs determinierten Zellen empfohlen.

Zusätzlich Struktur-Funktions-Studien in konstitutiven KO mESCs durchzuführen, könnte man auch einen bedingten Ansatz des Cre / loxP-System. Der letztere Ansatz ermöglicht eine linienspezifische KO, ohne die umgebenden und Stützzellen zu beeinflussen. Darüber hinaus bedingt KO mESCs allow für die Durchführung von Struktur-Funktions-Studien, wenn es ein Phänotyp in dem konstitutiven KO mESCs. Zur Erzeugung RMCE-kompatibel, bedingte-KO mESCs, homozygot floxed Mäuse mit zelltypspezifische Cre-Treiber mit RMCE-kompatible Mäuse gezüchtet; MESC von ihren Nachkommen isoliert. Der Vorteil dieses Systems ist, dass die Cre-Rekombinase nicht in mESCs exprimiert wird, und wird nur dann aktiv, wenn die mESCs in der jeweiligen Zelllinie differenziert werden. In RMCE-kompatibel, bedingte-KO mESCs wird Cre die Rekombination der gleichzeitige Inaktivierung des endogenen Gens induzieren , und die R26-driven Expression des rescue Konstrukts durch einen bedingten pRMCE DV1-Targeting - Vektor (LMBP 08870) ¹¹ verwendet wird .

Darüber hinaus ermöglicht die Struktur-Funktionssystem für die Untersuchung von Mutationen, die bei Erkrankungen des Menschen zu finden sind und ermöglicht es uns, die Auswirkungen dieser Mutationen auf die Funktionen des Proteins zu testen. Als Beispiel haben wir ZEB2 mutat identifiziertIonen bei Patienten mit myeloproliferative Neoplasma aus Targeting - Vektoren , die diese Mutanten ZEB2, pendelte sich an den R26-Lokus von Zeb2 KO mESCs über RMCE, und untersuchte die Wirkung der Mutationen auf der Stabilität des Proteins selbst ³⁰ enthalten. Diese Technologie gibt ein besseres Verständnis der Biochemie solcher Mutanten in mESCs sowie in einer bestimmten Abstammungslinie, da mESCs pluripotent ist.

Abschließend Dies beruht MESC basierte Struktur-Funktions-Ansatz auf effizienter MESC Isolierung und Targeting-Technologie und ermöglicht die Identifizierung von wichtigen Domänen und Funktionen eines bestimmten Proteins in einem definierten biologischen Kontext. Durch den Austausch von Mäusen (Gefriersperma ist auf Anfrage erhältlich) und Plasmide (verteilt von BCCM / LMBP und Addgene), wollen wir diese Technologie auf die gesamte wissenschaftliche Gemeinschaft öffnen.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir danken Jinke D'Hont, Frederique Van Rockeghem, Natalie Farla, Kelly Lemeire und Riet De Rycke für ihre hervorragende technische Unterstützung. Wir danken auch Eef Parthoens, Evelien Van Hamme und Amanda Goncalves vom Bioimaging Core Facility des Inflammation Research Center für ihre Unterstützung von Experten. Wir erkennen an Mitglieder unserer Forschungsgruppe für wertvolle Diskussionen. Diese Arbeit wurde von der belgischen Wissenschaftspolitik unterstützt (BELSPO Interuniversitäre Anziehungsschwerpunkte - Preis IAP VII-07 DevRepair; https://devrepair.be), von der Königin Elisabeth-Stiftung für Medizin, Belgien (GSKE 2008-2010; http: // www .fmre-gske.be) und der konzertierten Forschungsaktionen (GOA 01G01908) der Universität Gent, Belgien (http://www.ugent.be/en/ghentuniv). SG ist ein Postdoctoral Fellow der Flandern Forschungsfonds (FWO-V).