Studi struttura-funzione nel topo cellule staminali embrionali Uso ricombinasi mediata Cassette Scambio

Le proteine ​​contengono spesso più domini che possono esercitare diverse funzioni cellulari. Gene knock-out (KO) non considerano questa diversità funzionale. Qui riportiamo un cambio cassette ricombinazione mediata (RMCE) approccio basato lo struttura-funzione in cellule staminali embrionali KO che consente la dissezione molecolare dei vari domini funzionali o varianti di una proteina.

ingegneria gene in embrioni di topo o cellule staminali embrionali (mESCs) permette per lo studio della funzione di una data proteina. Le proteine ​​sono i cavalli della cellula e spesso costituiti da più domini funzionali, che possono essere influenzate da modificazioni post-traduzionali. La riduzione dello intera proteina in condizionale o costitutiva knock-out (KO) topi non tiene conto di questa diversità funzionale e regolazione. Una linea Mesc e un modello di topo derivato, in cui è stato inserito un sito di attracco per FLPE scambio cassette ricombinazione mediata (RMCE) all'interno del locus ROSA26 (R26), è stato riportato in precedenza. Qui riportiamo un approccio struttura-funzione che permette di dissezione molecolare delle diverse funzionalità di una proteina multidominio. A tal fine, i topi RMCE-compatibili devono essere incrociati con topi KO e mESCs KO quindi compatibili con RMCE devono essere isolati. Successivamente, un gruppo di costrutti di soccorso putativi può essere introdotto nel locus R26 via RMCE targeting. I cDNA di soccorso candidati possono essere facilmente inseriti tra i siti RMCE del vettore targeting utilizzando la ricombinazione clonazione. Successivamente, mESCs KO sono transfettate con il vettore targeting in combinazione con un'espressione ricombinasi plasmide FLPE. RMCE riattiva il gene neomicina-resistenza promotore-meno negli attracco siti ROSA26 e consente la selezione della manifestazione di targeting corretto. In questo modo, l'efficienza elevata di targeting vicino al 100% si ottengono, consentendo l'inserimento di diversi costrutti salvataggio putativi in ​​modo semi-alta produttività. Infine, un gran numero di costrutti di soccorso R26-driven possono essere testati per la loro capacità di salvare il fenotipo che è stato osservato in parentali mESCs KO. Presentiamo uno studio struttura-funzione a prova di principio in p120 catenina (p120ctn) mESCs KO utilizzando differenziazione endoderma in corpi embrionali (EBS) come la lettura fenotipica. Questo approccio consente l'identificazione di domini importanti vie a valle putativi, e punto malattie rilevantimutazioni che sono alla base fenotipi KO per una data proteina.

Si stima che i genomi dei mammiferi contengono circa 20.000 geni codificanti proteine. Lo splicing alternativo e modificazioni post-aumentare ulteriormente il repertorio di proteine. Proteine hanno una struttura modulare ¹ e spesso contengono più domini di interazione, che permettono la loro assunzione in diversi complessi proteici e la loro partecipazione molteplici processi cellulari ^2. Un esempio è la proteina multi-funzionale chiamato p120ctn. p120ctn è codificata dal gene Ctnnd1 e consiste in una grande dominio centrale armadillo ripetizione affiancato da un N-terminale ed una regione C-terminale. Il dominio di armadillo p120ctn lega ad un dominio juxtamembrana altamente conservata caderine classiche, che sono coinvolti nella adesione cellula-cellula, ma si lega anche al repressore trascrizionale Kaiso. Il dominio N-terminale di p120ctn interagisce con diverse chinasi, fosfatasi, piccoli RhoGTPases e associata ai microtubuli proteins ^3. È interessante notare che, a seguito di splicing alternativo, isoforme p120ctn possono essere generati da quattro codoni di inizio alternativi ^4. p120ctn isoforma 1A è la più lunga, come viene tradotto da più-5' codone di inizio e contiene il segmento N-terminale full-length. In p120ctn isoforme 3 e 4, questo segmento N-terminale è soppresso parzialmente e completamente, rispettivamente. Comprendere il ruolo preciso delle proteine ​​(o isoforme della proteina) ed i loro domini in diverse funzioni cellulari rimane una sfida.

Gene targeting in mESCs consente lo studio della funzione di una proteina attraverso la delezione genetica del gene corrispondente ed ha ampiamente contribuito alla identificazione di evolutivamente importanti e malattie rilevanti geni e vie. Questo importante passo avanti nel campo della genetica inversa è il risultato di progressi nel campo di isolamento Mesc e gene targeting grazie alla ricombinazione omologa ⁵ . ricombinazione omologa è un processo in cui vengono scambiati frammenti di DNA tra due porzioni nucleici simili o identici dopo doppio stranded (ds) DNA si rompe. Normalmente, HR è inefficiente perché pause dsDNA sono frequenti. Recentemente, l'efficienza del gene omologia-diretto mira potrebbe essere aumentato utilizzando nucleasi site-specific ^{6, 7,} ma purtroppo, questi sono inclini a effetti fuori bersaglio ^8. Una tecnica più affidabile per abilitare gene targeting è RMCE, che si basa su sistemi di ricombinazione sito-specifica, come Cre / loxP o FLPE / Frt. LoxP e sequenza Frt si trovano in P1 batteriofago e Saccharomyces cerevisiae, rispettivamente, e consistono di 34 bp, compresa una sequenza bp asimmetrica 8 che determina l'orientamento del sito. D'altra parte, l'orientamento, ad esempio, due siti loxP all'interno di un tratto di DNA a stabilire se il DNA floxed viene escisso o inversed upon ricombinazione mediata da Cre ^9. Inoltre, Cre può anche indurre una traslocazione se due siti si trovano su cromosomi diversi. RMCE sfrutta siti di ricombinazione heterospecific che non cross-reagiscono e che sono incorporati in un locus genomico. In presenza di un plasmide donatore che contiene un frammento di DNA fiancheggiata da siti stessi heterospecific, la ricombinasi inserirà questo frammento di DNA nel locus genomico RMCE compatibile causa della traslocazione doppio simultaneo (Figura 1). Qui, cloni correttamente solo RMCE targeting possono rendere farmacoresistenza grazie ad un promotore sul vettore entrante che restituisce una "trappola" promotore-minore resistenza neomicina gene (Neo ^R) presenti nel genoma R26 delle cellule di aggancio (figura 1) ^{10, 11.} Questo si traduce in un rendimento di targeting molto alta, spesso vicino al 100% ^{11, <}/ sup> ^12. In conclusione, il targeting RMCE-based è molto efficace e può essere utilizzato per studi struttura-funzioni; tuttavia, richiede un locus genomico pre-ingegnerizzato.

Figura 1. Schema del Targeting RMCE-mediata. RMCE permette lo scambio di segmenti di DNA da un vettore targeting in ingresso a un locus genomico definito se entrambi nutrono due siti FRT heterospecific (rappresentate da triangoli bianchi e rossi). Inoltre, il locus genomico ingegnerizzato contiene un promoterless e gene troncato resistenza alla neomicina (Neo ^R). Fornendo un promotore e codone di inizio nel frammento di DNA in entrata, eventi di ricombinazione solo corretti restauro resistenza neomicina, con conseguente elevate efficienze di targeting. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di tla sua figura.

ingegneria del genoma in mESCs consente la generazione di topi RMCE-compatibili. Nel 1981, due gruppi sono riusciti a catturare cellule pluripotenti dalla massa cellulare interna (ICM) di blastocisti e mantenendoli in coltura ^{13, 14.} mESCs sono in grado di auto-rinnovamento e la differenziazione in tutti i tipi di cellule embrionali e adulte, tra cui il lignaggio cellule germinali. Pertanto, gene targeting in mESCs consente studi reverse-genetici attraverso lo sviluppo di topi costitutivi o condizionali (utilizzando il sistema / LoxP Cre) KO. Tuttavia, il modo classico per isolare cellule di topo ES è molto inefficiente. Diversi importanti miglioramenti hanno notevolmente aumentato il tasso di successo per derivare linee Mesc, compreso l'uso di un siero sostituzione definito (SR) medium ^15, alternando mezzo Mesc contenente siero bovino fetale e SR (FBS) ^16, e l'uso di farmacocomposti logici quali pluripotin o 2i ^17. Pluripotin, una piccola molecola sintetica, consente la propagazione di mESCs in uno stato indifferenziato in assenza del fattore inibitorio della leucemia (LIF) e fibroblasti embrionali di topo (MEF) ^18. Infine, è stato dimostrato che mESCs possono essere isolati con un'efficienza molto elevata (vicina al 100%) quando un / FBS protocollo mezzo alternanza SR è combinato con LIF e pluripotin ^{19, 20.} Questi protocolli consentono l'isolamento efficace di mESCs KO RMCE compatibili che possono successivamente essere utilizzati per studi struttura-funzione.

Questo documento descrive un metodo che permette di identificare i settori chiave o residui all'interno di una proteina che sono responsabili per i processi cellulari specifici. A tal fine, una pipeline di tecnologie avanzate che permettono l'isolamento efficiente Mesc, mira assemblaggio vettoriale, e Mesc il targeting è stato creared. Come tali, i grandi pannelli con isoforme della proteina, i mutanti di dominio e effettori a valle possono essere introdotti in mESCs KO e possono essere valutati per la loro capacità di salvare la vitro KO fenotipo in.

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati condotti secondo le norme animali istituzionali, nazionali, ed europei.

1. Isolamento di mESCs KO-compatibili RMCE

1. Razza topi eterozigoti KO con i topi RMCE-compatibile, come ad esempio i topi ROSALUC ¹⁰ o topi ROSA26-IPSC ^21. Entrambi i topi RMCE-compatibili sono stati mantenuti su un 129 / C57BL6 / sfondo misto svizzero.
   NOTA: L'incrocio con topi KO eterozigoti si consiglia di superare letalità embrionale nei topi KO omozigoti.
2. Utilizzare PCR per selezionare topi KO eterozigoti che contengono una cassetta RMCE nel locus R26 ^12.
3. Razza, topi KO eterozigoti RMCE-compatibile con i topi KO eterozigoti e isolare RMCE-compatibile, omozigoti blastocisti KO.
   1. Impostare accoppiamenti tempo la sera e verificare la presenza di copulazione si inserisce la mattina successiva.
      NOTA: Le spine sono fatte di secrezioni coagulate dalle coagulazione e vescicolari ghiandole del maschio.Queste spine riempiono la vagina della femmina e persistono per 8 - 24 ore dopo l'allevamento. femmine Plugged si considerano trasportare 0,5 DPC (giorni dopo coitum) embrioni.
      1. Per verificare la presenza di spine, sollevare la femmina dalla base della coda e da esaminare la sua apertura vaginale per una massa biancastra. Stendere le labbra della vulva po 'con una sonda angolata quando la spina è difficile da vedere. femmine separati collegati da loro maschile.
   2. Raccogliere blastocisti al 3,5 DPC.
      1. Eutanasia femmine gravide dal metodo approvato (ad esempio, dislocazione cervicale). Effettuare un'incisione midventral e sezionare l'utero ed ovidotto (ancora attaccato gli uni agli altri) utilizzando forbice fine e pinze.
      2. Piegare un ago 26-gauge in un angolo di 45 °. Attaccare una siringa da 1 ml riempito con mezzo M2 per questo ago piegato e utilizzarla per irrigare le blastocisti dall'utero nel coperchio di un piatto 10 cm.
         1. Inserire l'ago nell'estremità dell'utero che più si avvicina aovidotto. Tenere l'ago in posizione con una pinza sottile mentre si spinge il pistone; gonfiore dell'utero indica un risciacquo di successo.
      3. Utilizzare una pipetta bocca (con un diametro di 100-200 micron) per raccogliere tutti gli embrioni e lavarli due volte in una goccia di mezzo di M2 fresca. Subito dopo il lavaggio, trasferire le blastocisti verso le piastre di coltura (vedi sotto).
         NOTA: La dissezione e la manipolazione di blastocisti di dovrebbe essere fatto nel flusso d'aria laminare.
4. Isolare mESCs RMCE compatibile KO
   1. Preparare una 12-pozzetti con mitomicina-C-trattati DR4 MEF (vedere la tabella dei materiali) un giorno prima l'isolamento blastocisti.
      NOTA: Questi MEF sono stati isolati da topi Tg (DR4) 1Jae / J contenenti quattro geni droga selezionabili e conferiscono resistenza a neomicina, puromicina, igromicina, e 6-tioguanina ^22.
      1. Rivestire tutte piastre di coltura con 0,1% di gelatina. Aggiungere 0,1% di gelatinaalle piastre di coltura, incubare per 5 min a 37 ° C in 5% CO _2, ed aspirare la soluzione di gelatina. Seme un quarto di una fiala di P2 MEF in un 12-pozzetti e crescere in 2 mL di terreno MEF (vedi Tabella 1, la tabella dei materiali) ad un monostrato confluente ^19.
      2. Li inattivare con mitomicina-C (10 ug / mL) per 3 ore e lavare due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) ^19.
   2. Usando una pipetta bocca, piastra blastocisti Onto gelatinizzazione piastre da 12 pozzetti (1 pozzetto / embrione), con i MEF mitomicina-C-trattati in terreno cella SR-ES (2 mL / pozzetto) integrato sia con 2 mM pluripotin o con 2i (1 uM inibitore Erk PD0325901 e 3 pM GSK3 inibitore CHIR99021). Incubare a 37 ° C in 5% CO _2.
   3. Aggiornare la media delle cellule SR-ES (integrato con pluripotin o 2i) ogni 2 - 3 giorni.
   4. Esaminare ogni blastocisti sotto uno stereomicroportata a 4.0X ingrandimenti e controllare cova e l'attaccamento allo strato MEF.
      NOTA: quando blastocisti portellone, perdono la zona pellucida che li racchiude. Wells con blastocisti senza legami devono essere aggiornati utilizzando il pipettaggio bocca.
   5. Scegli i singoli escrescenze ICM (utilizzando uno stereomicroscopio) dopo 10 - 12 giorni di coltura con una pipetta P10 con puntali monouso. Trasferire la conseguenza in circa 10 ml di mezzo di una piastra a 96 pozzetti a V contenente 30 pl / pozzetto di PBS (a temperatura ambiente).
   6. Aggiungere 50 ml di 0,25% tripsina ad ogni pozzetto usando una pipetta multicanale e incubare per 3 minuti a 37 ° C in 5% CO _2.
   7. Aggiungere 100 ml di FBS contenente medio Mesc; dissociare le escrescenze ICM in singole cellule pipettando 10-15 volte; e trasferire le cellule dissociate per mitomicina-C-trattata, 96-pozzetti MEF che sono stati preparati un giorno prima colonie ICM vengono raccolte.
   8. Da questa fase in poi, omi t pluripotin o 2i dal mezzo Mesc. Il giorno successivo, cambiare il supporto da FBS- medio Mesc SR-contenenti (100 pl / pozzetto).
   9. Ampliare le linee Mesc stabilite da 96- a 24 pozzetti formato ^19.
      1. Lavare le cellule con 200 microlitri di PBS, aggiungere 50 ml di tripsina, e incubare per 5 min a 37 ° C in 5% CO Aggiungere 100 pl di mezzo Mesc FBS-based.; dissociarsi pipettando 10 - 15 volte con una pipetta multicanale; e trasferire le cellule dissociate a mitomicina-C-trattati, 24-pozzetti MEF.
      2. Passare alla media SR-base il giorno successivo. Ampliare le mESCs in modo simile da 24- formato 6 pozzetti. Fare 3 - 4 gelate da un confluenti 6 pozzetti ^19.
   10. Identificare RMCE-compatibile, mESCs omozigoti KO utilizzando primer PCR per il locus R26 ²³ e KO allele di scelta (in questo caso, p120ctn; PCR per p120ctn nullo e alleli floxed stati descritti primalass = "xref"> 12).

Tabella 1. Culture Media. Tutti i mezzi sono stati conservati a 4 ° C e riscaldati a 37 ° C 30 minuti prima dell'uso.

2. Generazione di un vettore targeting RMCE-compatibile tramite ricombinazione Clonazione

1. Clone salvato costruisce in vettori di ricombinazione compatibile con enzima di restrizione (RE) a base di o PCR-basato ²⁴ tecniche di clonazione. Assicurarsi che i cDNA contengono un codone di stop.
   1. Progettazione primer ²⁴ ATTB-tagged. Assicurarsi che il primer forward contiene i seguenti elementi: un tratto GGGG, un sito AttB1, un linker, una sequenza di Kozak, e circa 25 nucleotidi di cDNA soccorso (iniziano con il suo ATG). Assicurarsi che il primer inverso ha una composizione simile: un tratto GGGG, un sito attB2, un linker, e circa 25 NUCleotides di cDNA salvataggio (complemento inverso).
   2. Amplificare il cDNA di soccorso tramite PCR per ottenere il cDNA ATTB-fiancheggiati.
   3. Eseguire una reazione di 10 microlitri BP con 100 ng di ATTB-fiancheggiato cDNA e 150 ng del vettore donatore ricombinazione-compatibile, che contiene un gene di kanamicina-resistenza.
   4. Trasformare 5 microlitri delle miscele BP in heat-shock-competenti MC1061 Escherichia coli (E. coli) batteri (simili a quelle descritte nel passo 2.3).
   5. Identificare colonie contenenti le corrette soccorso vettori di cDNA contenente (simili a quelli descritti nello stadio 2.4)
2. Eseguire una reazione LR 10 microlitri con 100 ng di salvataggio cDNA contenente vettoriale; 150 ng di pRMCE-DV1 Cre-escissa vettoriale ¹¹ (LMBP 8195); e 2 microlitri di miscela ricombinasi, che contiene un'integrasi fago-codificato e excisionase e fattore ospitante integrazione batterica. Incubare per 2 ore a 25 ° C.
   NOTA: Una reazione LR è una ricombinazione reagireionico in cui un clone di voce contenente siti Attl e un vettore di destinazione contenente siti attr vengono ricombinati dal mix clonase enzima LR. Ciò si traduce in un clone di espressione contenente siti attB che fiancheggiano il gene di interesse.
3. Trasformare 5 ml di miscele LR in MC1061 batteri E. coli heat-shock-competente.
   1. Aggiungere 5 ml di LR miscele a coste, costeggiato, tubo 2 mL tappo a vite con 40 ml di heat-shock-competenti di E. coli e incubare per 20 min in ghiaccio. Incubare per 5 min a 37 ° C.
   2. Aggiungere 1 ml di Luria Broth (LB) media e incubare per 1 ora a 37 ° C. Piastra 50 microlitri di ampicillina (Amp; 100 ug / mL) -contenente piastre di agar e crescere durante la notte a 37 ° C.
4. Identificare le colonie con la corretta vettore targeting.
   1. Scegliere 5 colonie casualmente usando una punta p200. Trasferire la punta di una provetta di vetro contenente 2 - 5 ml di terreno LB e crescere durante la notte a 37 ° C.
   2. ExTract il DNA plasmidico da colture batteriche utilizzando kit disponibili in commercio.
   3. Convalida utilizzando digerisce RE e sequenziamento. Tagliare, 0,5 - 2 pg di plasmide utilizzando 0,2 ml di RE (20 U / ml) e 1 ml di tampone 10x corrispondente in una reazione di 10 microlitri. Incubare per almeno 1 ora a 37 ° C e separato su un gel di agarosio all'1%. Selezionare per le colonie con il modello previsto di frammenti di DNA.
      1. Analizzare i vettori confermati (50 ng / ml) con (GGG GCG GAA TTC GAT ATC AAG) primer (5 pmol / mL) Tlox F (ATC ATG TCT GGA TCC CCA TC) e IRES R utilizzando sequenziamento Sanger.

3. Mesc RMCE mediata Targeting di Rescue Costruisce al R26 Locus

1. Avviare una cultura di mESCs e il passaggio li KO RMCE-compatibile almeno due volte il MEF a medio Mesc FBS-based. Dividere i mESCs su un 6-pozzetti gelatinizzato.
2. Il giorno successivo, aggiornare le cellule, a circa il 50% di confluenza, con 1.5mL di terreno Mesc FBS-based e trasfezione delle mESCs con Cre-escisso pRMCE-DV1 di targeting vettore contenente cDNA di soccorso.
   1. Fare un mix di DNA. Aggiungere 1 mg di colpire vettoriale e 1 mg di FLPE-plasmide di espressione ^25-250 ml di terreno DMEM puro.
   2. Fare un mix lipofezione. Aggiungere 7 ml di reagente trasfezione lipofezione-based (ad esempio, Lipofectamine 2000) a 250 ml di terreno DMEM pura e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
      NOTA: RMCE simile mira efficienze sono stati ottenuti utilizzando altri reagenti lipofezione-based (ad esempio, Lipofectamine LTX e Effectene).
   3. Mescolare il mix di DNA con il mix lipofezione e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Pipettare la miscela di trasfezione sulle mESCs rinfrescati. Agitare delicatamente e lasciare per una notte.
3. Un giorno dopo la trasfezione, raggruppati tutti mESCs dal 6 pozzetti di una piastra di coltura da 10 cm con uno strato confluenti di MEF DR4 e m 10 ml di FBS-basedmedia ESC.
4. Due giorni dopo la trasfezione, selezionare cloni Mesc con il corretto scambio cassette FLPE mediata aggiungendo 0,2 mg / ml di G418 (100x) al mezzo.
   NOTA: Fare una curva uccidere per ogni lotto di G418 per identificare la più bassa concentrazione di G418 che uccide tutti i mESCs.
5. Aggiornare i mESCs quotidiano con il mezzo Mesc G418 contenente. Le colonie dovrebbero apparire dopo 7 - 10 giorni, in modo da raccogliere ed espandere questi come per step 1.4.
6. Confermare i cloni corretti tramite PCR ^11.

4. Differenziazione di mESCs in corpi embrionali (EBS)

1. Avviare una cultura di mESCs KO con costrutti di soccorso R26-driven e il passaggio di loro almeno due volte il MEF a medio Mesc FBS-based. Passage le mESCs una volta su gelatinizzati 6 pozzetti per sbarazzarsi dei MEF.
2. Lavare con PBS e trypsinize culture Mesc quasi confluenti. Piastra dissociato mESCs in diverse diluizioni (1/20 e 1/40) sulla non aderente, pet batterica gradori-piatti in terreno di differenziamento.
3. Lasciare EBS per formare in questi piatti per 30 giorni. Aggiornare la media ogni 2 - 3 giorni con la seguente procedura: trasferire la sospensione EB ad un tubo da 50 ml, lasciate che i EBs depositano per gravità, rimuovere il surnatante, aggiungere mezzo fresco, e trasferire la sospensione EB di nuovo ad un batterica-grade piatto.
4. Analizzare i mESCs mirati e EBs mediante immunofluorescenza e microscopia elettronica a trasmissione utilizzando protocolli che sono stati descritti in precedenza ^12.

La procedura di isolare linee KO Mesc RMCE-compatibile è illustrato nella figura 2. Due allevamenti consecutivi devono ottenere RMCE compatibile blastocisti KO. In primo luogo, i topi KO eterozigoti sono incrociate con i topi RMCE-compatibile, per ottenere topi KO eterozigoti RMCE-compatibili. Questi topi sono poi utilizzati per accoppiamenti a tempo con altri topi KO eterozigoti per ottenere 3,5-DPC, compatibile con RMCE, omozigoti blastocisti KO. La possibilità di ottenere tale embrione è uno in otto, come previsto da mendeliana. Pertanto, è necessario un protocollo efficiente isolamento Mesc. Utilizzando protocolli pluripotin-based o 2i-based, siamo in grado di isolare mESCs linee, inclusi p120ctn RMCE compatibile KO mESCs, con un'efficienza di circa 94% (n = 114 blastocisti) e 64% (n = 22 blastocisti), rispettivamente ^{12, 19.} Tipicamente, blastocisti tratteggio dopo tra 3 e 6 giorni in in vitro (DIV) cultura; Questo è seguito dal collegamento di escrescenze ICM di MEF o ai piatti rivestiti di gelatina. Il giorno 12, grandi escrescenze ICM sono formate che fedelmente danno origine a linee Mesc (Figura 2). A causa di questa procedura di isolamento Mesc altamente efficiente, è possibile ottenere RMCE-compatibile mESCs KO da uno o due femmine collegati.

Figura 2. Isolamento di mESCs KO RMCE-compatibili. (A) Strategia di allevamento per ottenere omozigoti, RMCE compatibile mESCs KO. (B) Schema di procedura di isolamento Mesc pluripotin- o 2i-based. barra della scala Bianco: 25 micron. barre di scala nero: 100 micron. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Per mappare i domini o amino acidi all'interno di una proteina che sono importanti per le funzioni cellulari specifici, si può ora reintrodurre, tramite RMCE, integrale o costrutti mutanti in mESCs KO e testare la loro capacità di ripristinare il fenotipo KO. Vettori di targeting per molti diversi mutanti di dominio e mutanti puntiformi possono essere efficacemente generati da clonazione ricombinazione (Figura 3A). clonazione ricombinazione si basa sul riconoscimento di specifiche sequenze di DNA di attacco (ATT) dalla miscela ricombinasi, che media uno scambio di frammenti di DNA ATT-affiancate tra differenti plasmidi. Il sistema di clonazione ricombinazione seleziona vettori correttamente solo ricombinato passando tra i vettori che contengono diversi geni di resistenza agli antibiotici e inserendo un marcatore contro-selezionabile, il "controllo della morte cellulare B" (CCDB) gene, nel vettore di destinazione (Figura 3A) . Abbiamo generato oltre il 25 Cre-asportato pRMCE-DV1 mira vettori con un quasi 100% di efficienza (alcuni esempi ari mostrato in Tabella 2).

Tabella 2. Panoramica del targeting vettore Montaggio e RMCE mediata Mesc targeting.

Diversi costrutti di salvataggio incorporato in un pRMCE-DV1 cre-escisse mira vettore può essere facilmente mirati a mESCs KO utilizzando RMCE (Figura 3B). Abbiamo precedentemente riportato sulla generazione di 133 cloni Mesc mirati per 19 diversi costrutti di soccorso che sono state introdotte nel locus R26 di p120ctn KO mESCs via RMCE con un rendimento medio del 93% ^12. Qui, riportiamo la destinazione dei costrutti aggiuntivi con efficienze elevate simili, tra cui un p120ctn 1A CAAX-tag, epiteliali-to-mesenchimale transizione (EMT) induttori della famiglia SNAI e ZEB, e N-caderina, in p120ctn KO mESCs ( Tavolo 2).

Figura 3. RMCE targeting basato in mESCs KO. (A) assieme ricombinasi-mediata di vettori di targeting RMCE-compatibile. (B) Targeting di costrutti di soccorso putativi al locus R26 di omozigoti mESCs KO via RMCE. Validazione (C) PCR-based di cloni Mesc RMCE mirati. DNA è stato estratto da cloni Mesc RMCE mirati ed è stato amplificato mediante PCR usando un primer in avanti che è incorporato nella endogena locus R26 e un primer inverso che si trova nel costrutto pRMCE-DV1 in entrata. Una banda di 560 bp si osserva per i cloni correttamente mirati. cloni non confermati vengono visualizzati in rosso. M1: 1 kb DNA ladder. M2: 1 kb scala più DNA. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Una volta che un gruppo di mESCs soccorso si ottiene, deve essere sottoposti a screening per la sua capacità di invertire il fenotipo KO-indotta. E 'stato recentemente dimostrato che p120ctn mESCs KO non riescono a differenziarsi in EB cistica come conseguenza di difettosa endoderma polarizzazione ^12. Cistica EB morfologia può essere usato come una lettura fenotipica di screening differenti costrutti di soccorso (Figura 4A). Come prova del concetto, abbiamo dimostrato che R26-driven p120ctn isoforma 1A (R_p120_1A) potrebbe salvare la p120ctn KO fenotipo (Figura 4B, 4C) ^12. Inoltre, la E-caderina schermo identificata, ma non RhoA, è un partner cruciale p120ctn durante specificazione endoderma (Figura 4B e C) ^12. La facilità di introdurre salvataggio costruisce a p120ctn KO mESCs ci ha permesso di testare ipotesi aggiuntive. In primo luogo, sarebbe E-caderina-indipendente ancoraggio di membrana p120ctn abilitare formazione cistica EB? Testarequesto, abbiamo fuso il motivo della membrana-targeting K-Ras (CAAX) fino al capolinea di carbossi p120ctn, introdotto tramite RMCE a p120ctn mESCs KO, e fece EBs da loro. Tuttavia, questo costrutto serve dominante negativo che non consente di legame e la stabilizzazione di E-caderina (Figura 4D) e, di conseguenza, non salvare il p120ctn KO fenotipo (Figura 4C). In secondo luogo, sono induttori di EMT coinvolti? EMT è un processo evolutivo essenziale che si verifica anche durante il differenziamento Mesc ed è orchestrato dalla famiglia SNAI e ZEB di fattori di trascrizione, che reprimono direttamente vari geni marcatori epiteliali come E-caderina ^{26, 27.} In linea con questi risultati, l'espressione di EMT induttore ZEB2 è stato trovato in EBs controllo, ma non in EBs p120ctn nullo (Figura 4E). Ciò nonostante, mESCs p120ctn KO con l'espressione ROSA26 a base di EMT induttori ZEB1, ZEB2, o lumaca non è riuscito a ripristinare la cistiformazione ic EB (Figura 4C). In terzo luogo, se altre cadherins classici, come N-caderina, funzionalmente sostituire E-caderina durante specifiche endoderma? Per far fronte a questo, le linee di soccorso N-caderina sono stati generati. In precedenza, è stato dimostrato che l'espressione ectopica di E-caderina in p120ctn KO EBs parzialmente salvato la formazione di EBs cistica ^12. È interessante notare che, in una configurazione simile, costretto espressione N-caderina riuscito a salvare (Figura 4C e F), indicando che E-caderina è il principale sottotipo caderina richiesto per EB adesione e non può essere sostituito da N-caderina. Questi esempi di cui sopra mettono in evidenza la facilità con cui questioni biologiche possono essere affrontate dal sistema.

Figura 4. fenotipica Proiezione mESCs salvataggio RMCE targeting. (A) La formazione di EB cistica (catturate al microscopio ottico; pannello superiorels) e la corretta polarizzazione endoderma a EBs (catturato da microscopia elettronica a trasmissione; pannelli inferiori) sono stati utilizzati come la lettura fenotipica per testare la capacità di mESCs mirati a salvare la p120ctn KO fenotipo. barra della scala Bianco: 25 micron. barra della scala Nero: 200 micron. (B) Panoramica dei costrutti di soccorso p120ctn. p120ctn contiene un dominio armadillo centrale, formato da nove ripetizioni armadillo (scatole blu), che è affiancato da un dominio N-terminale (NTD) e il dominio C-terminale (CTD). isoforme p120ctn contengono uno su quattro codoni di inizio alternativi (frecce), eventualmente dotate sequenze codificate da esoni alternativamente utilizzati A e C (scatole nere), e includere o escludere due domini di legame Rho GTPasi (RBDS). p120ctn isoforme 1A e 4A usa il primo e il quarto sito di inizio traduzione, rispettivamente. La posizione di mutazioni di importanti AA e l'aggiunta artificiale di una membrana-targeting motivi (CAAX) sono mostrate. EBD: E-caderina dominio di legame. (C) Graficoraffigurante la percentuale della morfologia di base o cistica EB nelle cellule KO p120ctn che esprimono diversi costrutti di soccorso R26-driven. (D) colorazione immunofluorescenza per p120ctn (topo monoclonale anti-p120ctn) e E-caderina (topo monoclonale anti-E-caderina) sul controllo mESCs G4 o p120ctn KO mESCs con l'espressione R26-driven CAAX-tag p120ctn isoforma 1A. I riquadri mostrano l'intera colonia Mesc. barra della scala: 10 micron. (E) L'immunoistochimica per ZEB2 (topo monoclonale anti-ZEB2; 7F7, realizzato in-house) su floxed (controllo) e p120ctn KO EBS. Un ingrandimento di 3,5 volte è mostrato nei pannelli inferiori. barra della scala: 200 um (in alto), 100 um (in basso). (F) la microscopia elettronica a trasmissione di DIV12 EBs dalle cellule KO p120ctn esprimono E o N-caderina dal promotore R26. barra della scala: 10 micron. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di This figura.

Per concludere, riportiamo su una pipeline di tecnologie robuste che combina un rendimento vicino al 100% in isolamento Mesc con mira assemblaggio vettoriale e Mesc targeting. Questo gasdotto ci permette di svelare la versatilità delle proteine ​​mediante studi struttura-funzione in mESCs.

Il nostro metodo di isolamento Mesc è user-friendly e non richiede competenze o attrezzature avanzate, come la microchirurgia della blastocisti. Così, questa tecnologia è accessibile a una larga parte della comunità scientifica. Chiunque abbia esperienza di base coltura cellulare può propagare escrescenze ICM e stabilire linee mESCs. Tuttavia, il lavaggio e la manipolazione di blastocisti richiede una certa pratica. Una pipetta bocca è usato per trasferire blastocisti e consiste di una micropipetta, un supporto micropipetta, tubo e di un boccaglio aspiratore ^28. Micropipette possono essere su ordine riscaldando la parte più fine di una pipetta Pasteur per pochi secondi, togliere la pipetta dalla fiamma, e tirando le due estremità. Selezionare i aghi con un diametro leggermente più grande di un blastocisti (100 - 200 micron). Aghi possono essere riutilizzati dopo essere stati lavati con acqua distillata (3x) e EtOH (3x). Nella nostra esperienza, l'efficienza dell'isolamento Mesc pluripotin-based è più alto rispetto a 2protocolli ¹² i-based. Tuttavia, l'uso di pluripotin ad alte concentrazioni ha mostrato di indurre instabilità genomica ^19.

RMCE a base di R26-targeting in mESCs tipicamente produce 20 - 40 colonie dopo selezione G418. Se si osservano più colonie, questo implica che la concentrazione G418 non è ottimale e consente mESCs non mirati per sopravvivere, che colpisce l'efficienza complessiva di targeting. Pertanto, si raccomanda che, per ogni linea Mesc e per ogni nuovo lotto G418, una curva di uccidere è fatto per identificare la concentrazione G418 più basso che uccide tutti mESCs non mirati. Se non si osservano colonie, ciò è indicativo di una trasfezione inefficiente. In tal caso, vale la pena di ottimizzare la procedura di trasfezione usando plasmidi reporter che consentono l'espressione di EGFP o LacZ. Se ancora si osservano le opere di protocollo di trasfezione ma senza colonie, controllare la RMCE-compatibile e cre-escissa vettore pRMCE-DV1 e la FLPE eplasmide xpression con RE digest e sequenziamento. Si consiglia di fare una grande partita di mESCs genitori e FLPE vettoriale e di congelare diverse aliquote di loro di ridurre le variazioni tra esperimenti.

Uno svantaggio di questa strategia struttura-funzione è che i costrutti di soccorso non sono espressi dal locus endogeno, ma dall'interno del locus ROSA26, con un onnipresente, promoter moderatamente attiva. Rispetto ad altre tecnologie, dove i livelli di iperespressione sovrafisiologici sono spesso visti, questo sistema consente l'espressione del transgene fisiologica, che è stabile durante gli esperimenti di differenziazione in vitro e in vari linee cellulari. È stato osservato che eterozigote, ROSA26-mediate risultati di espressione del transgene in un'espressione di proteine p120ctn che era circa metà dei livelli endogeni di p120ctn mESCs di controllo di tipo selvatico ma che era sufficiente per salvare la p120ctn osservato KO fenotipi ^12. Allo stesso modo, è stato Demonstrated in precedenza che un eterozigote, ROSA26 mediata livello di espressione del transgene Zeb2 è sufficiente per salvare i fenotipi knockout Zeb2 osservate in vitro e in vivo in varie linee cellulari ^29. Un altro potenziale problema è il fatto che i geni che sono indispensabili per Mesc automantenimento non sono suscettibili di tali studi struttura-funzione. Per escludere questo, si consiglia di caratterizzare mESCs nuova costituzione KO per i seguenti criteri: la proliferazione, morfologia delle colonie, e l'espressione di geni di staminalità. Si consiglia inoltre di controllare l'espressione del gene di interesse, sia in mESCs e in cellule della linea-commesso.

Oltre a svolgere studi struttura-funzione in costitutivi mESCs KO, si potrebbe anche adottare un approccio condizionale utilizzando il sistema Cre / loxP. Quest'ultimo approccio permette un KO specifico lineage senza influenzare le cellule circostanti e di supporto. Inoltre, condizionali mESCs KO ALLOw per la realizzazione di studi struttura-funzione se c'è un fenotipo nei mESCs KO costitutivi. Per generare compatibile RMCE-, condizionali-KO mESCs, topi floxed omozigoti con un driver Cre-specifica delle cellule-tipo sono allevati con i topi RMCE-compatibili; Mesc sono isolati dalla loro progenie. Il vantaggio di questo sistema è che la ricombinasi Cre non è espresso in mESCs e diventa attivo solo quando le mESCs si differenziano nella rispettiva linea cellulare. In, condizionato KO mESCs RMCE-compatibile, Cre ricombinazione indurrà l'inattivazione simultanea del gene endogeno e l'espressione R26-driven del costrutto salvataggio utilizzando un vettore condizionale pRMCE-DV1 targeting (LMBP 08870) ^11.

Inoltre, il sistema struttura-funzione permette lo studio delle mutazioni che si trovano in malattie umane e ci permette di testare l'impatto di queste mutazioni sulle funzioni della proteina. A titolo di esempio, abbiamo identificato ZEB2 mutationi in pazienti con neoplasia mieloproliferativa, rese vettori di targeting contenenti tali ZEB2 mutanti, li spola alla R26-locus di mESCs Zeb2 KO via RMCE, ed esaminato l'effetto delle mutazioni sulla stabilità della proteina stessa ^30. Questa tecnologia fornisce una maggiore comprensione della biochimica di questi mutanti in mESCs, come pure in ogni lignaggio, poiché mESCs sono pluripotenti.

In conclusione, questo approccio struttura-funzione Mesc presuppone il efficiente isolamento Mesc e tecnologia di targeting e consente l'identificazione di importanti domini e funzioni di una data proteina in un contesto biologico definito. Condividendo i topi (sperma congelato è disponibile su richiesta) e plasmidi (distribuito da BCCM / LMBP e Addgene), vogliamo aprire questa tecnologia per l'intera comunità scientifica.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamo Jinke D'Hont, Frederique Van Rockeghem, Natalie Farla, Kelly Lemeire, e Riet De Rycke per il loro eccellente supporto tecnico. Ringraziamo anche Eef Parthoens, Evelien Van Hamme e Amanda Goncalves dal Bioimmagini Nucleo strumento della infiammazione Centro di ricerca per la loro assistenza di esperti. Riconosciamo i membri del nostro gruppo di ricerca per le discussioni di valore. Questo lavoro è stato sostenuto dalla politica belga Science (Belspo Interuniversitario di attrazione Poli - Premio IAP VII-07 DevRepair; https://devrepair.be), dalla Fondazione Regina Elisabetta Medical, Belgio (GSKE 2008-2010; http: // www .fmre-gske.be), e dalle azioni concertate di ricerca (GOA) 01G01908 di Università di Gand, Belgio (http://www.ugent.be/en/ghentuniv). SG è un borsista postdottorato della Ricerca Fondi Fiandre (FWO-V).