Comportamentos olfativos ensaiadas pelo monitoramento do computador de

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

Um dos principais desafios em neurobiologia é entender como os circuitos neurais funcionam para orientar comportamentos adequados com animais. Drosophila melanogaster é um excelente sistema modelo para tais investigações devido aos seus comportamentos complexos, técnicas genéticas poderosas e sistema nervoso compacto. Ensaios comportamentais laboratoriais têm sido muito utilizados com Drosophila para simular propriedades do ambiente natural e estudar os mecanismos neurais subjacentes aos comportamentos correspondentes (por exemplo fototaxia, quimiotaxia, a aprendizagem sensorial e memória) ^1-3. Com a recente disponibilidade de grandes coleções de linhas de Drosophila transgênicas que rotulam subconjuntos neurais específicos, ensaios comportamentais têm assumido um papel de destaque para conectar neurônios com comportamentos ^4-11. paradigmas versáteis e reprodutíveis, em conjunto com as rotinas computacionais subjacentes para análise de dados, são indispensáveis ​​para testes rápidos de linhas de voar candidatos com vários genotypes. Particularmente úteis são as configurações que são flexíveis no número de animais testados, a duração das experiências e a natureza dos estímulos apresentados. O ensaio de escolha também deve gerar dados reprodutível, que é fácil de obter e analisar. Aqui, apresentamos uma descrição detalhada de um sistema e protocolo para ensaiar respostas comportamentais de Drosophila voa em uma grande arena de quatro campos. A configuração é usado aqui para ensaiar respostas de moscas para um único estímulo olfativo; No entanto, o mesmo arranjo pode ser modificado para testar múltiplos olfactivo, estímulos visuais ou optogenetic, ou uma combinação destes. A configuração olfatômetro registra a atividade de populações de moscas que respondem aos odores e métodos analíticos computacionais são aplicadas para quantificar os comportamentos da mosca. Os dados coletados são analisados ​​para obter uma rápida leitura fora de uma corrida experimental, que é essencial para a coleta de dados eficiente e a otimização das condições experimentais.

A capacidade de adaptação e respondem ao ambiente externo é crítica para a sobrevivência de todos os animais. Um animal precisa para evitar perigos, procurar comida e encontrar companheiros, e aprender com experiências anteriores. sistemas sensoriais funcionar para receber uma variedade de estímulos visuais, tais como, química e mecanosensorial, e envia esses sinais para o sistema nervoso central a ser interpretada e descodificado. O cérebro, em seguida, direciona comportamentos motores apropriadas com base no ambiente percebido, como a busca de alimento ou escapar de um predador. Entender como sistemas sensoriais detectar o mundo externo, e como o cérebro decodifica e dirige decisões, é um grande desafio em neurobiologia.

Drosophila melanogaster é um sistema poderoso modelo para investigar como neural comportamentos circuitos de guia. Além de ser simples e barata de manter, Drosophila apresentam muitos comportamentos diversos e complexos estereotipada, mas fazê-lo com uma compact sistema nervoso de cerca de 100.000 neurônios. Existem técnicas genéticas poderosas para manipular o genoma de Drosophila, e milhares de linhas transgénicas foram geradas que seletivamente e reprodutível rotular os mesmos subconjuntos de neurônios ^10-13. Estas linhas transgénicas podem ser usadas para manipular selectivamente a actividade dos neurónios marcados (activar ou inibir), e estas manipulações podem ser utilizados para investigar como neural comportamentos funções de guia.

Vários ensaios comportamentais têm sido desenvolvidos para estudar vários comportamentos de Drosophila. Drosophila, como muitos animais, use seu sentido de cheiro para guiar muitas escolhas comportamentais, tais como encontrar comida, encontrar companheiros e evitar perigos. Olfato é, portanto, um bom sistema sensorial para investigar como os estímulos externos são detectados e interpretados pelo sistema nervoso de um animal para orientar as escolhas apropriadas. Como tal, uma série de ensaios foram desenvolvidos para Investigating larval e comportamentos olfativos adultos. Tradicionalmente, os comportamentos olfactivos em Drosophila foram ensaiadas por um paradigma de labirinto em T de dois escolha, que pode ser utilizado para ensaiar inata e comportamentos aprendidos olfactivos ^3. Neste ensaio, cerca de 50 moscas são dado uma escolha entre dois tubos: um tubo contém o odor em questão e o outro contém um odorante de controlo (normalmente o solvente odor). As moscas são dadas um determinado período de tempo para fazer uma escolha, e, em seguida, o número de moscas que estão nas diferentes câmaras são contados. Embora o labirinto em T é um ensaio simples para muitas experiências, há várias limitações. Por exemplo, comportamentos olfativos são medidos em apenas um ponto no tempo, e diferentes escolhas feitas antes deste ponto de tempo são descartados. Da mesma forma, os comportamentos individuais das moscas dentro da população são negligenciadas. Além disso, o labirinto em T requer a contagem manual das moscas, que pode introduzir erros. Finalmente, uma vez que existem apenas duas opções de medição, estereduz o poder estatístico muitas vezes necessária para detectar mudanças comportamentais sutis. Uma alternativa para um dois-escolha T-maze é um de quatro quadrantes (quatro campos) olfatômetro ^14-18. Neste ensaio, os animais explorar uma arena em que cada um dos quatro cantos da arena é preenchido com uma fonte potencial de ar odorizado. A arena tem uma forma de estrela enrugada para maximizar a formação de quatro quadrantes de odor experimentalmente definidos. Se o odor é fornecido em um dos cantos em seguida, é contida apenas em que um quadrante. Os comportamentos dos animais pode ser rastreado como eles entram e saem do quadrante odor, e facilmente em comparação com o seu comportamento nos três quadrantes de controle. Assim, o ensaio olfatômetro de quatro quadrantes registros de resposta comportamental espacial e temporal aos estímulos odor mais de uma grande arena experimental.

O olfatômetro de quatro quadrantes foi desenvolvido pela primeira vez por Pettersson et al. ¹⁵ e Vet et al. ¹⁷ para investigar o olrespostas comportamentais fábrica de Hymenoptera parasítica indivíduo. Faucher et al. ¹⁸ e Semmelhack e Wang ¹⁶ adaptada a configuração para monitorar as respostas olfativas de Drosophila individual. O olfactómetro de quatro quadrantes é igualmente sensível às respostas atractivas e repulsivas, permitindo uma vasta gama de condições de ensaio e odorantes. Software de rastreamento fly escrita por encomenda, desenvolvido por Alex Katsov ¹⁹ e atualmente mantido por Julian Brown (detalhado em Materiais), apresentou vantagens adicionais para implementações mais recentes do olfatômetro de quatro quadrantes ^14,20-23. É agora possível testar até 100 moscas simultaneamente em alta resolução espacial (27,5 pixels / cm) e temporais (30 quadros por segundo) de resolução, que permite extrair vários parâmetros, tais como posição, velocidade e aceleração de moscas em qualquer ponto do tempo. Isso permite que as investigações sobre a dinâmica das respostas comportamentais das moscas aos odores ²⁰ . Deve notar-se, no entanto, que a identidade de moscas individuais dentro da população durante todo o período de seguimento não é mantido. Em vez disso, cada faixa mosca é registrado por até duas faixas mosca não se cruzam. Em que ponto, novas faixas são atribuídos após as moscas divergem. Ao incorporar outro software de captura de vídeo (detalhado na Tabela de Materiais), a mesma configuração permite períodos de monitoramento flexível e pode ser usado para controlar moscas por até 24 horas, tomando imagens a uma taxa de quadros mais baixa. Esta opção foi utilizada para estudar os comportamentos que põem ovos de moscas e comparar suas posições corporais com as preferências oviposição ^14. O olfactómetro de quatro campos podem também ser utilizados para estudar as respostas para multimodal (por exemplo, olfativas e visuais) estímulos, ou para combinar optogenetic ⁹ ou ²¹ termogênico estimulação com apresentações de estímulos sensoriais. Além disso, a resolução temporal alta permite que a extracção de trajectórias for cada mosca individual no conjunto de dados ensemble. Portanto, o método permite investigação sobre comportamentos da população olfativos-guiada e também interações sociais individuais. Os dados gerados por este ensaio são robustos e altamente reprodutível, que permite a utilização do olfactómetro de quatro campos para telas comportamentais.

Descrevemos aqui o conjunto de instalação para um olfatômetro de quatro quadrantes. Demonstramos ainda mais a sua utilização no ensaio de atração olfativa em resposta ao vinagre de maçã e repulsão em resposta ao propionato de etilo altamente concentrado. Finalmente, descreve-se e proporcionar o Exemplo de código para a análise dos dados de controlo de mosca gravados.

1. Setup Assembléia

1. Fabricação na arena em forma de estrela (19,5 cm por 19,5 cm por 0,7 cm) de politetrafluoretileno (PTFE), de acordo com o desenho (Materiais Suplementares, SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf) fornecidos. A arena podem ser fabricados por uma instalação de um costume ou comercial.
2. Adquirir duas placas de vidro (20,25 cm por 20,25 cm de altura com a espessura de 2 mm), e um furo (~ 0,7 cm de diâmetro) precisamente no centro de uma das placas de vidro, utilizando uma broca diamantada.
3. Fabricar uma caixa de comportamento à prova de luz para a arena comportamental. fabricar também uma caixa de câmera à prova de luz para a câmera de vídeo CCD infra-vermelho de acordo com os desenhos fornecidos (Materiais Suplementares, SupplementalSketch_LightTightBox.pdf). As caixas podem ser fabricados por um uma instalação personalizada comercial ou.
4. Montar o aparelho de ar condicionado na parede posterior e as matrizes de LED nas paredes laterais da caixa de comportamento. Coloque a sonda de temperaturana caixa de comportamento através de um orifício lateral para feedback de temperatura em tempo real e ajuste (ver Figuras 1 e 2 para detalhes).
5. Anexar o filtro IR e polarizador circular para a câmera, e montar o conjunto na caixa de câmera. A caixa de comportamento e caixa de câmera são separados por uma janela de vidro para melhor controle de temperatura da caixa de comportamento (ver Figuras 1 e 2 para detalhes).
6. Ligue a câmera CCD infravermelho a um adaptador de câmera. Ligue o adaptador de câmera para um conversor USB. Ligue o conversor USB a uma porta USB do computador para aquisição de dados.
7. Instalar o driver para o conversor de vídeo no computador de acordo com as instruções do fabricante. Opcionalmente, instale o software de processamento de imagem fornecida pelo fabricante do conversor de vídeo USB para acessar uma ampla gama de configurações de câmera e parâmetros de aquisição.
8. Ligue o aparelho de ar condicionado (por meio de "output"Na parte de trás do controlador de temperatura) e a sonda de temperatura (por meio de" termopar "na parte de trás do controlador de temperatura) para o controlador de temperatura. Colocar o sensor dentro da caixa de comportamento.
   Nota: O sistema de controle da temperatura no nosso esquema é capaz de manter a temperatura da caixa de entre 18 ° C e 30 ° C. Temperaturas ambientes mais elevadas ou mais baixas podem ser úteis para termogênico ^(ts dTrpA1, TRPM8 ou shibire) experimentos para manipular a actividade neuronal ou inibir a transmissão sináptica. Para a maioria das experiências, a temperatura é mantida a 25 ° C.
9. Monte o sistema de entrega de odor nas etapas seguintes (ver Figura 1B para esquemas detalhados e acessórios de conexão):
   1. Usar o regulador de pressão de ar para controlar a entrada de ar do sistema de ar condicionado central. Conectar um filtro de ar de carbono (cheio com carvão vegetal) para o regulador de pressão para purificar o ar a partir do centro de umsistema de IV.
   2. Monte o sistema de controle de fluxo que consiste em múltiplos canais regulados por tubos do medidor de vazão de alta resolução.
   3. Ligue a saída do filtro de ar de carbono para os tubos do caudalímetro através de um colector tal como mostrado na Figura 1B e 2F. Direcionar a saída dos tubos do medidor de vazão por meio de válvulas solenóide de 3 vias controlados eletronicamente para regular se o ar limpo deixando os medidores de vazão é expelido para a sala ou entrou em câmaras de odor feitas sob medida ^24.
   4. Instalar o controlador da válvula de solenóide de acordo com o manual do fabricante.
10. Instalar o medidor de fluxo de ar electrónico, ligando-o a um dispositivo de aquisição de dados (DAQ) e uma fonte de alimentação de acordo com o manual do fabricante. Instalar o software de interface DAQ para verificar débitos iguais em cada quadrante da arena antes de cada experimento.

2. Olfativo Estímulos Preparação

1. Prepare 5 odorcâmaras de formigas ²⁴ que consistem em um recipiente de plástico exterior, vidro de embalagem interior, uma PTFE inserção tampa feito por encomenda, tampa do recipiente original com parte central removida e duas válvulas unidirecionais.
   Nota: Um anel em torno da tampa de PTFE pode ser usado para evitar fuga de ar da câmara de odores durante a perfusão de odor. Veja a Figura 1 para esquemática e a Figura 2 para fotos das câmaras.
2. Use quatro câmaras olfativos para controlos do solvente, e uma câmara para um odorante teste. Encher os recipientes de vidro com 1000 uL de diluição solvente ou odorante (odorantes de teste + solventes apropriados, misturar bem antes de experiências), colocar o recipiente de vidro no interior da câmara de plástico correspondente (não derramar o líquido para dentro da câmara de plástico) e aperte a tampa . Certifique-se de usar sempre uma câmara limpa para o odorante de teste e controlos do solvente.
   Nota: atração olfativo pode ser desencadeada por 1/16 de diluição de vinagre de maçã (5% de acidez) em water. Em contraste, o comportamento de repulsão olfactiva pode ser estudada utilizando uma diluição de 10% de propionato de etilo em óleo mineral. estímulos de controle nestes casos são câmaras de odor com óleo mineral puro.

3. Preparação Fly

1. Traseira voa em meio fubá padrão. Coloque 30 do sexo masculino e 30 moscas parentais feminina em uma garrafa padrão, e deixá-los põem ovos durante 5 dias a 25 ° C ou à temperatura ambiente.
2. Para cada experiência, recolher recém eclosed (<1 dia de idade) 25 do sexo masculino e 25 do sexo feminino voa sob breves CO ₂ anestesia.
3. Manter moscas num frasco com meio de mosca padrão durante 2-4 dias.
4. 40-42 h antes da experiência, transferir as moscas sem CO ₂ anestesia   para um frasco com ~ 10 ml de gel de agarose 1%. Isto irá manter as moscas umidificadas sem alimentos, o que ajuda a aumentar a sua actividade locomotora.
   Nota: Mais de 90% das moscas deve sobreviver à inanição. Alguns genótipos são menos curartua e não pode fazê-lo através de uma fome de 40 horas. Nesses casos, períodos mais curtos, tais como 24-28 horas são aceitáveis, mas deve ser mantido o mesmo para todas as condições experimentais e repete.

4. Respostas comportamentais aos atrativos e repelente de Fragrâncias

1. Ligue o controlador de temperatura e configurá-lo para 25 ° C.
2. Ligar as câmaras olfactivos (Fragrância de controlo e de teste) por inserção do tubo para a saída da câmara de odorante e ao premir-para-ligar montagem na caixa do comportamento.
3. Verifique a taxa de fluxo em cada quadrante usando o medidor de fluxo de ar para se certificar de que a corrente de ar e controle de odores é igual a 100 ml / min.
4. Limpar a arena PTFE mosca e as placas de vidro com etanol 70% 2-3 vezes e permitir-lhes totalmente ar seco (~ 3-4 min).
5. Cole as placas de vidro para com grampos na arena.
6. Transferência voa sem CO ₂ em anestesia através do orifício de uma das placas de vidro na arena. à réer a transferência, colocar uma malha circular no furo para impedir que as moscas de escapar.
   Nota: CO ₂ anestesia foi mostrada para afectar o comportamento de Drosophila ²⁵ e não deve ser usada dentro de 24 horas de uma experiência de comportamento.
7. Coloque com moscas dentro da câmara à prova de luz da arena, conecte as correntes de ar quatro de controle, ligando o tubo ligado ao push-to acessório de conexão na caixa de comportamento para os cantos de arena, feche a porta da câmara e espere 10- 15 min para permitir que as moscas se aclimatar ao novo ambiente. Se possível, desligue as luzes na sala onde os experimentos são realizados, para evitar possível vazamento mínima luz que pode influenciar o resultado experimental.
8. Executar um experimento de controle 5-10 min, em que as moscas são expostos a correntes de ar 4 controle.
9. Analisar os dados imediatamente (ver secção A análise dos dados abaixo) para se certificar de que as moscas são distribuídos uniformemente na arena, e Índice da atração está pertoa 0. Este passo é essencial, uma vez que verifica se não existem fontes não controladas de preferências e aversões dentro da arena (por exemplo, luz vazamento do exterior, distribuição de temperatura desigual, arena irregular, contaminação odor, etc.). Se as moscas são distribuídos de forma desigual ou a sua actividade locomotora é baixo, descartar as moscas, limpar a arena de novo (passo 4.4) e utilizar um novo lote de moscas para repetir a experiência.
10. Ligue a câmara de teste odorante à configuração ligando as 3-way válvulas ou re-conectar os tubos conectores.
11. Execute experimento de teste para 5-10 min e analisar os dados como discutido na seção 5 abaixo (veja também a referência 14 e Figura 3). Gravações mais longos do que 20 minutos pode resultar em arquivos de dados que podem ser difíceis de processo computacionalmente. Se gravações mais experimentais são desejados, parar rapidamente e re-iniciar o programa de rastreamento. Isso resulta em um ~ 10 seg lacuna entre as gravações experimentais.
12. discarmoscas d.
13. Limpos arena e vidro placas com 70% de etanol (passo 4.4), e substituir os tubos conectores dentro do compartimento à prova de luz. Para agilizar experimentos, uma nova arena limpo pode ser usado, ea arena sujo limpo durante a realização de ensaios experimentais.
14. Executar outra experiência com um novo lote de moscas, se necessário. Se vários experimentos são executados no mesmo dia, tomar extremo cuidado para garantir que nenhum odorante é deixado no sistema a partir de um teste anterior. Isto não é normalmente um problema com baixas concentrações de odorantes ou com CO _2, mas pode ser necessário para estímulos altamente concentradas até um intervalo de 24 horas entre as execuções experimentais. Além disso, todos os tubos depois de os tubos de escoamento pode ser substituído se a contaminação odorante é suspeito durante as experiências de controlo. Sempre deixar o ar seco em entre as experiências para lavar continuamente o sistema

Análise 5. Os dados

Nota: A mosca sugeriu softwar aquisição de rastreamentoe (detalhado em Materiais), as faixas moscas em tempo real durante a aquisição, e salva o carimbo de tempo e coordenadas de todas as moscas detectados em formato * .dat. Nós desenvolvemos uma Matlab rotina feitos por medida para converter os dados para um formato Matlab, e para analisar os dados. exemplos de código são fornecidos em Materiais suplementares, mas os detalhes da implementação dependerá do software utilizado para a aquisição de dados.

1. Carregar os dados brutos. Criar uma máscara espacial que segue os contornos da arena e aplicar a máscara para os dados em bruto para remover todos os pontos de dados que caem fora da arena uma vez que representam ruído (Figura 4A, Recurso Código MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask. m).
2. Remove todos os pontos de dados que se movem a uma velocidade inferior a 0,163 cm / s durante mais de 3s, como estes dados é provável que seja o ruído gerado por moscas ou não em movimento (Figura 4B, Recurso Código TemporalFiltering.m).
3. Visualize dados restantespontos de plotagem-los todos de uma vez ou como trajetórias individuais (Figura 3, Código Complementar SingleTrajectoryViewer.m).
   Nota: A localização das fronteiras odor nos quatro campos provavelmente depende de um número de fatores, como as características de cada odorante e as taxas de fluxo de ar que está sendo usado. Por exemplo, odorants altamente voláteis provavelmente vai encher o quadrante odor mais completa do que odorants menos voláteis. Assim, é provável que cada odorante podem apresentar ligeiramente diferentes limites de odor. A utilização de um detector de fotoionização para medir limites de odores pode ser problemático, uma vez que utiliza uma amostra de ar de vácuo a partir de um determinado ponto, e assim interrompe a concentração odorante naquele ponto. No entanto, os limites de odores pode ser rapidamente calculada com base em dados do comportamento da mosca. Por exemplo, um limite de odor à base de pistas mosca acumulados em resposta a diferentes odores pode ser claramente observado nas Figuras 3C e 3D.
4. Calcular um índice atracção para determinar se experiências de controlo gerar nenhuma resposta preferência, e também para aceder a resposta a um odorante (ou optogenetic ⁹⁾ estímulo. Para calcular uma atração Index (AI), use o último 5 min de um controle ou gravação de teste. Para se obter uma medida de atracção que se situa entre 1 (atracção absoluta) e -1 (repulsão absoluta), a seguinte fórmula é utilizada para calcular o AI:
   
   onde _{o teste} N é o número de pontos de dados no quadrante de teste, _controlo N é o número médio de pontos de dados nas três quadrantes de controlo. Esta medida é intuitivo como nenhuma preferência seria indicado por valores próximos de zero. No entanto, ele não indica correctamente a proporção do número total de moscas que se encontram no quadrante odorante. Para obter esta medida, um Índice Percentagem (IP) podem ser utilizados:
   
   onde _{o teste} N é o número de pontos de dados no quadrante de teste, e N _total é o número total de pontos de dados em todos os quatro quadrantes. Esta fórmula prevê uma medida que cai entre 0 e 1, com 0,25 correspondente a nenhuma preferência comportamental (Figura 3E e 4C, Recurso Código AttractionIndex.m).
5. Executar 5-10 repetições de cada condição experimental, usando um novo grupo de moscas para cada repetição. Comparar os índices de atração entre as condições ou contra controlos utilizando o teste de Kolmogorov-Smirnov não paramétrico (Figura 3F, função kstest2 em Matlab).

Os olfatômetro registros e ensaio quatro quadrantes analisa as atividades de passeio de muitas moscas sobre um grande espaço comportamental. Odorantes pode ser introduzido nas correntes de ar que entra com uma, duas, três, ou todos os quatro quadrantes. Na ausência de odores, as moscas irá mover-se livremente entre todos os quatro quadrantes. Este comportamento é crucial para observar uma vez que indica que polarizações un-intencional não têm sido introduzidos no ensaio. Estes desvios podem incluir luz, flutuações de temperatura, diferenças no fluxo de ar, ou contaminantes do odor. A Figura 3B mostra as respostas comportamentais no olfactómetro de quatro quadrantes de 25 homens e 25 mulheres voa secar ao ar. Uma mosca single-track a partir dos dados coletados também é destacada na Figura 3B, e demonstra que esta mosca estava explorando a arena inteira comportamental. A pontuação do índice atração (AI) para todas as faixas analisadas durante o período de teste de 5 min está próximo de 0, indicating falta de atracção para o quadrante odor. De modo semelhante, o índice percentual de (PI) da experiência é 0,24, indicando que as moscas foram distribuídas bastante uniforme em todos os quatro quadrantes, durante o período de teste de 5 min.

A resposta comportamental de quatro campos de um odorante atraente é mostrado na Figura 3C. O vinagre de maçã é introduzido na corrente de ar de   odor quadrante corrente de ar superior esquerda, colocando uma diluição de 6,25% de vinagre de maçã para a câmara de teste de odor. As faixas de ar retida mostrados a cinzento demonstram que a maioria das moscas recolher neste quadrante odor, e já não explorar todos os quatro quadrantes. Uma única pista mosca colorido mostra que uma vez que uma mosca entra no vinagre de maçã odor quadrantes, ele tende a permanecer no quadrante odor atraente. A AI de 0,94 para o experimento está perto de 1 indicando uma forte atração a este odorante. O PI de 0,92 indica que 92% das moscas de remained no quadrante odor durante o período analisado.

A resposta comportamental de quatro campos a um odorante repelente é mostrado na Figura 3D. Uma diluição a 10% do propionato de acetato de odorante e colocada numa câmara de odor foi usado como a fonte de odor para o fluxo de ar superior esquerdo. As faixas mosca reunidos para o experimento analisados ​​demonstram a evasão do quadrante odor, sugestiva de repulsão guiada por odor. A única faixa mosca colorida mostra que uma mosca, quando entrou no quadrante odor, rapidamente virou-se para evitar o quadrante odor. A AI de -0.68 é menor que 0, o que indica repulsa, e está perto de -1, indicativo de uma resposta odorante repulsiva forte. O PI de 0,06 para a experiência sugere que apenas 6% (em comparação com ~ 25% nas experiências de odor neutro), com os pontos de dados da mosca rastreadas foram encontrados no quadrante de odor ao longo do curso do experimento.

Um índice de atracção é a métrica mais amplamente utilizado para a análise de dados olfactivos, uma vez que permite pontuações maiores do que 0, para indicar atração (positivo) e pontuação inferior a 0, para indicar repulsão (negativo). Quanto mais próximo o resultado é para +1 ou -1, mais forte a atração ou repulsão ao odor, respectivamente. Como descrito acima, esta métrica não pode indicar claramente a percentagem ou fracção de moscas rastreados para o quadrante de odor ao longo do curso do experimento. Nesse caso, um índice percentual pode ser mais informativo. Figura 3E diagramas a relação entre AI e dezenas PI, e como esses números referem-se a comportamentos atraem ou repelem.

O ensaio de quatro campos resulta em comportamentos olfativos robustas e reproduzíveis. Isto permite comparações quantitativas entre o controlo e as condições experimentais tal como mostrado na Figura 3F, e também permite a identificação de olfactor subtilrespostas y que se desviam da neutralidade.

Além disso, como os dados são obtidos em elevada resolução espacial e temporal, é possível estudar grande número de elementos de respostas comportamentais, tais como trajectórias de moscas individuais (como mostrado na Figura 3), bem como caracterizar diferentes dinâmica das moscas de actividade em um campo de odor (por exemplo, mudanças de direcção e velocidade ^19,20).

Muitas vezes pode ser difícil posicionar a arena de quatro campos na mesma localização exacta para cada experiência, especialmente uma vez que é necessária a limpeza frequente da arena. A análise forneceu os scripts compensar estas pequenas variações pela primeira ajustando os dados como se mostra na Figura 4A. Neste caso, a forma da arena de quatro campos é calculado, e os pontos de dados que se encontram no exterior desse espaço são removidos. Estes objetos rastreados muitas vezes representam debris ou reflexões que são erroneamente controladas. Como não se encontram dentro da arena e, assim, representam ruído, é importante que estes pontos de dados são removidos para evitar que analisa os dados errónea. Da mesma forma, é também importante remover pontos dados controlados que possam representar ruído ou moscas não se desloca no interior da arena. Para realizar isto, um roteiro de análise é utilizado (e fornecida aqui) que remove os pontos de dados que, essencialmente, não se movem (como mostrado na Figura 4B). Estes pontos de dados são geralmente em minoria, ainda a sua retenção iria conduzir a erros na análise.

Índice de atração e pontuações preferência de índice pode ser calculada depois de um determinado período de tempo (por exemplo, no final de 5 minutos de experiência como demonstrado na Figura 3). Deve notar-se, no entanto, que uma vez que as moscas são rastreados com uma elevada resolução espacial e temporal, as análises semelhantes pode ser realizada ao longo da experiência. Isto émostrado na Figura 4C, em que pontuações do Índice da atração e índice percentual estão calculadas em contínuas caixas de 10 seg durante o período de tempo. Essa análise permite uma melhor apreciação das alterações olfativos que podem ocorrer durante todo o experimento, como a habituação a um odorante.

Figura 1:. Esquemática do olfactómetro de quatro quadrantes (A) A configuração de comportamento é composto de um sistema de entrega de odor, o sistema de controlo da temperatura (não diagramado), sistema de aquisição de imagem (IR luzes e câmara CCD IR ligados a um computador LED), Arena de quatro quadrantes e de comportamento e de arena caixas à prova de luz. Os círculos vermelhos designar os componentes correspondentes mostrados na Figura 2. (B) pormenorizada da construção do sistema de libertação de odores. Os personagens verdes representam os tamanhos ligação / conversão de fittings. Os tubos de 1/16 ID e 1/8 OD são rotulados em amarelo enquanto os de 1/8 e 1/4 ID OD são rotulados na cor rosa. Abreviaturas: IR, infravermelhos; CF, Encaixe de Compressão; BF, Arame Fitting, MNPT, Homem National Pipe Thread. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2:. Fotos do Setup Olfativo Assay (A) vista do Largo-campo da caixa de câmera e caixa de comportamento. (B) Vista dentro da caixa de comportamento. A sonda de temperatura, os tubos conectores, e matrizes de LED IR são rotulados. (C) Arena de quatro quadrantes. (D) vista do Largo-campo do sistema de entrega odor ligado à caixa de comportamento. A caixa de câmara foi removido para revelar a câmara CCD. (E ) Central de ar é passado primeiramente através de um regulador de pressão e em seguida através de um filtro de carbono. (M) Exemplo de os tubos de odor ligado ao colector. (G) tubos de fluxo de alta resolução regular o fluxo de ar. (H) A tubagem de odor e conectores jusante dos reguladores do tubo de caudal. (I) a válvulas solenóides regular se o ar limpo é passado através de uma câmara de odor ou expulsos para o quarto. Câmaras (J) o odor são conectados a válvulas de sentido único, e conter um recipiente de vidro interior para o odorante. (K) A caixa de comportamento contém acessórios de push-to-connect fora que se conectam ao tubo de entrega odor. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Exemplo de dados gerados utilizando um Ensaio Olfactory quatro campos (A) Representação esquemática da arena de quatro campos.. (B) respostas neutras são observados quando todos os quatro quadrantes perfusão conter apenas ar seco. Respostas (C) atração para uma diluição de 6,25% de vinagre de maçã perfusão do quadrante superior esquerdo. Comportamentos (D) repulsão desencadeada por propionato de etilo 10%. Na Figura 2B-2D, uma única trajectória a partir dos dados adquiridos é traçada. Um gradiente de cor é usada para significar o curso de tempo de gravação, com as cores azul e vermelho sendo o início eo fim das gravações, respectivamente. (E) Comparação do Índice de atração (AI) e do Índice Percentual (PI). (F) Média AI de 3- 6 experimentos com nenhum odor (controle), vinagre de maçã (ACV) e 10% de propionato de etilo (EP). As barras de erro indicam SEM. diferença estatística foi avaliada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov test. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4:. Exemplo dados gerados pelos dados de análise de Passos (A) filtragem espacial dos dados, realizados por MaskSpatialFiltering.m para remover pontos de dados que estão fora da arena. círculos vermelhos mostram posições iniciais dos círculos que são usados ​​para definir as fronteiras da arena. círculos pretos são as posições finais, adquiridas pela montagem do círculo descreve os dados (cinza área sombreada dentro do quatro-campo). Pontos vermelhos e setas pretas indicam pontos de dados que vão ser removidos do conjunto de dados depois deste passo de filtração. (B) a filtragem temporal dos dados, realizada por TemporalFiltering.m. Esta etapa de filtragem remove pontos de dados que se movem muito slowly ou não em todos, como eles são susceptíveis de ser gerados por moscas não se mover ou pela sujeira / reflexões a partir da arena. Um ponto vermelho rodeado por uma caixa vermelha tracejada indica posições de ~ 6.000 pontos de dados com coordenadas idênticas que serão removidos por esta etapa de filtragem. Index (C) Atração (AI) e Índice Percentual (PI), calculado em caixas de 10 seg durante a última 5 min de um experimento por AttractionIndex.m. Perfis temporais destes índices contêm informações sobre a dinâmica das respostas comportamentais e podem ser usadas para uma análise detalhada de comportamentos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O olfactómetro de quatro campos descrito aqui é um sistema comportamental versátil para estudar as respostas olfativas de populações grandes de tipo selvagem e mutante de Drosophila moscas. Cada experiência leva ~ 1 hr (incluindo instalação, ensaios experimentais, e limpeza) e 4-6 experimentos podem ser realizados rotineiramente a cada dia. Um ensaio típico usando 40-50 moscas durante 5 minutos gera aproximadamente 450.000 rastreados pontos de dados para análise. A configuração descrita, também podem ser utilizados, com pequenas modificações, para controlar os movimentos de outros insectos e larvas de insectos, em resposta a olfativa ou outros estímulos sensoriais ao longo de um período de tempo, variando de minutos a dias. O ensaio de quatro quadrantes é sensível aos efeitos de ambos os estímulos atractivas e repulsivas. A maioria dos odores gerar índices Atração (AI) entre -0,9 e +0,9 (Equação 1). Um AI na gama de 0,5-1 significa comportamento forte atração das moscas aos estímulos, enquanto que AI na gama de -0,5 a -1 édesencadeada por repelentes fortes. De um modo geral, uma resposta neutra por controlar odores (ar seco, ar humidif içado, óleo mineral) deve situar-se entre 0,1 e -0,1. A AI muitas vezes muda durante todo o curso do experimento de teste, refletindo o tempo voa precisa para caminhar para as plumas olfativos, atração inicial e aumento da atividade locomotora em direção a um novo estímulo, ea eventual dessensibilização em resposta ao estímulo. controle pré-teste é executado são essenciais, e deve ser realizada com cuidado para garantir que as moscas foram distribuídos uniformemente na arena na ausência do estímulo desejado.

As causas mais comuns de polarização espacial de moscas na arena são: fluxos irregulares de ar, possivelmente devido a tubulação desconectada ou placas de vidro inadequadamente apertados da arena em forma de estrela (em nossa experiência, as moscas são capazes de detectar diferenças de fluxo de ar de tão pouco quanto 15 ml / min); distribuição de temperatura desigual no interior da arena, que pode ser melhorada ajustando aar condicionado unidade para gerar fluxo de ar mais fraco e mais difusa e / ou longo período de pré-aquisição (~ 20 min) para garantir até mesmo a temperatura da arena; a fuga de luz mínima através da abertura sonda de temperatura, que pode ser reduzido por meio de selagem da abertura com uma fita preta; odor residual na arena ou no sistema de fornecimento de ar, caso em que a configuração (Arena, tubos de caudal, acessórios do invólucro à prova de luz, etc.) devem ser cuidadosamente limpas e deixou-se secar durante vários dias ou substituído sempre que possível.

Manutenção do equipamento olfativo é importante para resultados confiáveis ​​e consistentes. Push-to-conectar acessórios na caixa do comportamento e as entradas de ar e as paredes interiores da arena deve ser limpo com etanol depois de cada experiência, se forem utilizadas odores fortes, e deixou-se secar completamente. As placas de vidro devem ser lavados três vezes com etanol a 70%, o que é geralmente suficiente para remover o odor residual e sujidade das placas, mas hexano é útilna remoção de composto orgânico depositado por moscas (por exemplo, feromonas que consiste em hidrocarbonetos de cadeia longa). Soap geralmente não é recomendado porque geralmente contém componentes aromáticos, o que poderia afetar comportamentos olfativos. A caixa de comportamento deve permanecer ligada às entradas de ar seco entre experiências (por exemplo durante a noite) para facilitar a remoção dos odores residuais do sistema.

Se a atividade locomotora das moscas é baixa, eles podem gerar muito poucos pontos de dados, que muitas vezes resulta em um barulhento e variável Índice de atração. Mais longos tempos de fome e de gravação pode ajudar a resolver este problema. Em contraste, se as moscas estão doentes, 24-28 horas de jejum, em geral, ser suficiente para aumentar a actividade de locomoção como desde que seja consistente em todo experimentos. Há um bom equilíbrio entre a manutenção de um estado saudável das moscas e aumentando a locomoção. 40 h inanição pode ser utilizado como um ponto de partida, e depois modificado comonecessário com base nos resultados experimentais. Índices atração será um pouco afetada pela duração da fome, portanto, é essencial para morrer de fome todos os animais experimentais para o mesmo período de tempo, a fim de evitar os efeitos de confusão de tempo de inanição. tempos de fome mais longos fazem geralmente respostas repulsivas mais fraca (mais próximo a 0), e as respostas atraentes mais forte. as correntes de ar de controlo de ar seco tendem a desidratar as moscas, e não deve ser utilizada por mais de 40 min.

O olfactómetro de quatro quadrantes pode ser usado para estudar as respostas de moscas individuais ^16,18 ou múltiplas a um único estímulo ou para estudar preferência escolha entre estímulos. Por exemplo, odores diferentes poderia ser utilizado em cada um dos quatro quadrantes-. Isto também pode ser utilizado para determinar as respostas aos odor misturas examinando os limites do odor-quadrantes. Deve notar-se que, embora o sistema de rastreio permite faixas individuais para ser isolado a partir dos dados recolhidos, que épossível que as moscas individuais podem ter um comportamento diferente quando ensaiado como parte de um grupo que quando são testados isoladamente. Por exemplo, grupos de moscas apresentam maior repulsa guiada por odor devido às interações físicas entre moscas ^26. O sistema de seguimento e a disposição também pode ser adaptado para utilização em ensaios não-olfactivos. O quadro ensaio pode facilmente acomodar uma matriz de LEDs ⁹ para a estimulação optogenética, ou uma placa térmica ²⁷ para thermogenetics. O sistema também pode ser adaptado para estudar escolhas comportamentais de uma escala de tempo de muitas horas, por exemplo, para estudar o comportamento de postura ^14. Neste caso, a taxa de quadros aquisição precisa de ser ajustada para evitar a produção de grandes quantidades de dados, e uma fonte de humidade e o substrato (gel de agarose a 1%) a necessidade de ser fornecido como substrato de postura de ovos.

Uma limitação desta configuração é que as moscas são rastreadas como IR-refletindo objetos dentro e abaixo do Arena-se qualquer elemento de uma optogenetic ouexperimento termogênico reflecte IR, os pontos de dados irrelevantes terá de ser removido durante o pós-processamento. Actualmente, também não é possível filmar moscas com uma resolução espacial que permite que diferentes moscas para ser continuamente distinguíveis, mas isso pode ser melhorado no futuro, usando câmeras de vídeo mais avançados. Outra limitação do sistema atual é que o movimento de moscas é limitado a duas dimensões para promover comportamentos de passeio, e impedirá respostas aéreas induzida olfativos-.

Deve notar-se que os ensaios automatizados adicionais também foram desenvolvidos para investigar os comportamentos de olfactivos individuais ou grupos de moscas. O design mais parecido com o ensaio aqui descrito é um método desenvolvido por Beshel e Zhong ^28. Neste ensaio, as respostas de ~ 30 moscas são monitorizados em uma pequena área circular (cerca de um quarto da área da arena de quatro campos) em que odores são entregues a partir de um de quatro portas de odor ao longo da wa ArenaLL, e removido através de um buraco no centro da área circular. Além de uma arena menor, outras diferenças de design incluem comportamentos sendo realizados sob condições de luz e odores principalmente concentrando-se perto das portas de odor (em vez de todo o quadrante odorante, conforme indicado pelas paredes enrugadas da arena de quatro campos). No entanto, a área circular é um método adequado para o rastreio de respostas olfactivos de moscas, e pode ser adaptado para o desenho de acompanhamento mosca descrito aqui.

Uma abordagem alternativa é a de controlar, simultaneamente, a actividade de muitas moscas individuais em resposta aos odores. No ensaio Flywalk, moscas individuais são colocados em pequenos tubos, e as suas respostas rastreados quando odorantes são perfundidos através do tubo ^29,30. Mudanças na frente ou para trás, ou mudanças nas velocidades, pode ser utilizado para avaliar se um odorante é geralmente atraente ou repulsivo. Este ensaio, como o ensaio de quatro campos, rastreia automaticamente mosca movements, e assim pode ser usado para medir rapidamente respostas olfativas para uma grande variedade de odores. No entanto, ao contrário do four-campo, dinâmica motoras complexas, como a trajetória voltando ângulos e interações sociais potenciais, talvez perdeu na gravação ensaio Flywalk.

Rastreamento automático de moscas andando individuais também foi adaptado para um tipo de teste T-maze ^31,32. Neste ensaio, as moscas são colocadas em pequenas câmaras nas quais os odores são perfundidos a partir de cada extremidade da câmara, e sair através de uma porta no meio da câmara. As posições das moscas também são monitorados automaticamente. Isso imita, em uma escala única mosca, um quadro T-labirinto. Em combinação com Optogenetics, este ensaio tem sido particularmente bem adequada para o ensaio de circuitos neuronais medeiam aprendizagem olfactiva e de memória, e também pode ser usado para medir as preferências olfactivos de moscas individuais. Semelhante a Flywalk, ele não pode controlar a dinâmica da atividade complexa que podem ocorrer em áreas espaciais maiores, Tais como os que ocorrem durante a ¹⁴ de procura de alimentos, ou comportamentos que ocorrem somente em populações de moscas.

The authors declare that they have no competing financial interests.

We thank Terry Shelley for manufacturing the fly arena and the light-tight enclosure, Liz Marr for help with fly stock maintenance, and Xiaojing Gao and Junjie Luo for help with the Matlab code used for data analysis. We thank Johan Lundström at the Monell Chemical Senses Center for demonstrating his odor delivery setup. This work was supported by grants from the Whitehall Foundation (CJP) and NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).