We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

Una sfida chiave in neurobiologia è capire come i circuiti neurali funzionano per guidare i comportamenti appropriati su animali. Drosophila melanogaster è un sistema eccellente modello per tali indagini a causa dei suoi comportamenti complessi, potenti tecniche genetiche, e del sistema nervoso compatto. Laboratorio analisi comportamentale sono da tempo utilizzati con Drosophila per simulare le proprietà dell'ambiente naturale e studiare i meccanismi neurali alla base dei comportamenti corrispondenti (ad es fototassi, chemiotassi, l'apprendimento sensoriale e memoria) ^1-3. Con la recente disponibilità di grandi collezioni di linee di Drosophila transgeniche che un'etichetta specifica sottoinsiemi neurali, test comportamentali hanno assunto un ruolo di primo piano per collegare i neuroni con i comportamenti ^4-11. paradigmi versatili e riproducibili, insieme con le routine di calcolo alla base per l'analisi dei dati, sono indispensabili per test rapidi di linee di volo candidati con varie Genotypes. Particolarmente utili sono configurazioni che sono flessibili in numero di animali esaminati, la durata degli esperimenti e la natura degli stimoli presentati. Il dosaggio di scelta dovrebbe generare dati riproducibile che è facile da acquisire ed analizzare. Qui, presentiamo una descrizione dettagliata di un sistema e protocollo per saggiare risposte comportamentali di Drosophila vola in una grande arena quattro campi. La messa a punto è qui utilizzato per saggiare le risposte di mosche a un singolo stimolo olfattivo; Tuttavia, la stessa impostazione può essere modificata per testare olfattiva multipla, stimoli visivi o optogenetic, o una combinazione di questi. La configurazione olfattometro registra l'attività delle popolazioni di mosca che rispondono agli odori, e metodi di analisi computazionali vengono applicate per quantificare i comportamenti mosca. I dati raccolti vengono analizzati per ottenere una rapida lettura su una corsa sperimentale, che è essenziale per la raccolta di dati efficiente e l'ottimizzazione delle condizioni sperimentali.

La capacità di adattarsi e rispondere all'ambiente esterno è critico per la sopravvivenza di tutti gli animali. Un animale ha bisogno di evitare i pericoli, cercare cibo e trovare i compagni, e imparare dalle esperienze precedenti. sistemi sensoriali funzione di ricevere una varietà di stimoli, come visiva, chimiche e meccanosensoriali, e inviare questi segnali al sistema nervoso centrale per interpretare e decodificato. Il cervello dirige quindi comportamenti motori appropriati in base all'ambiente percepito, come la ricerca di cibo o di fuga da un predatore. Capire come sistemi sensoriali rilevano il mondo esterno, e come il cervello decodifica e dirige le decisioni, è una sfida importante in neurobiologia.

Drosophila melanogaster è un sistema potente modello per indagare come neurale comportamenti circuiti di guida. Oltre ad essere semplice e poco costoso da mantenere, Drosophila presentano molti comportamenti diversi e complessi stereotipati, ma farlo con un compact sistema nervoso di circa 100.000 neuroni. Esistono tecniche genetiche potente per manipolare il genoma di Drosophila, e migliaia di linee transgeniche sono stati generati che selettivamente e riproducibile etichettare gli stessi sottoinsiemi di neuroni ^10-13. Queste linee transgeniche possono essere utilizzati per manipolare selettivamente l'attività dei neuroni marcati (attivare o inibire), e queste manipolazioni possono essere utilizzati per studiare come neurale comportamenti funzioni di guida.

Molteplici test comportamentali sono stati sviluppati per lo studio dei vari comportamenti di Drosophila. Drosophila, come molti animali, usano il loro senso dell'olfatto per guidare molte scelte comportamentali, come trovare cibo, trovare compagni, ed evitando i pericoli. L'olfatto è quindi un buon sistema sensoriale per indagare come gli stimoli esterni vengono rilevati e interpretati dal sistema nervoso di un animale per guidare scelte appropriate. Come tale, un certo numero di saggi sono stati sviluppati per investigating larvale e comportamenti olfattive adulti. Tradizionalmente, i comportamenti olfattive in Drosophila sono stati analizzati da una a due scelta paradigma T-labirinto, che può essere utilizzato per saggiare innata e comportamenti appresi olfattive ^3. In questo saggio, a circa 50 mosche sono date una scelta tra due tubi: un tubo contiene l'odore in questione e l'altro contiene un odorizzante di controllo (di solito il solvente odore). Le mosche sono dati un determinato periodo di tempo per fare una scelta, e quindi il numero di mosche che si trovano nelle varie camere sono contati. Sebbene il T-labirinto è un semplice saggio per molti esperimenti, ci sono diverse limitazioni. Ad esempio, i comportamenti olfattivi sono misurati in un solo punto di tempo e differenti scelte effettuate prima di questo punto di tempo vengono scartati. Allo stesso modo, i singoli comportamenti delle mosche all'interno della popolazione sono trascurate. Inoltre, il T-maze richiede conteggio manuale di mosche, che potrebbe introdurre errori. Infine, poiché ci sono solo due scelte misurati, questoriduce la potenza statistica spesso richiesto per rilevare cambiamenti comportamentali sottili. Un'alternativa a due scelta T-labirinto è un quattro quadranti (quattro campi) olfattometro ^14-18. In questo test, gli animali esplorano un'arena in cui ciascuno dei quattro angoli del campo è riempito con una potenziale sorgente di aria odorizzata. Lo stadio ha una forma increspata stella per ottimizzare la formazione di quattro quadranti odore sperimentalmente definiti. Se l'odore è fornito in uno degli angoli, allora è contenuto solo in quella quadrante. I comportamenti degli animali possono essere monitorati in quanto entrano ed escono dal quadrante odore e facilmente rispetto al loro comportamento nei tre quadranti di controllo. Il saggio olfattometro a quattro quadranti, quindi, record risposta comportamentale spaziale e temporale agli stimoli odore oltre una grande arena sperimentale.

Il olfattometro a quattro quadranti è stato sviluppato da Pettersson et al. ¹⁵ e Vet et al. ¹⁷ per indagare sulla OLfabbrica risposte comportamentali dei singoli Imenotteri parassiti. Faucher et al. ¹⁸ e Semmelhack e Wang ¹⁶ adattato il setup per monitorare le risposte olfattive dei singoli Drosophila. Il olfattometro a quattro quadranti è altrettanto sensibile alle risposte attrazione e di repulsione, consentendo una vasta gamma di odoranti e condizioni di prova. Custom-scritto software di monitoraggio fly, sviluppato da Alex Katsov ¹⁹ e attualmente mantenuto da Julian Brown (descritto nei materiali), ha introdotto ulteriori vantaggi per le implementazioni più recenti dei quattro quadranti olfattometro ^14,20-23. È ora possibile saggiare fino a 100 mosche contemporaneamente ad alta spaziale (27,5 pixel / cm) e temporale (30 fotogrammi al secondo) risoluzione, che consente l'estrazione di vari parametri, quali la posizione, velocità e accelerazione di mosche in qualsiasi punto nel tempo. Ciò consente indagini sulle dinamiche di risposte comportamentali delle mosche 'agli odori ²⁰ . Va notato, tuttavia, che l'identità di mosche individuali all'interno della popolazione durante l'intero periodo di monitoraggio non viene mantenuta. Invece, ogni traccia volo viene registrata per la durata di due tracce mosca non si intersecano. A quel punto, le nuove tracce vengono assegnate dopo le mosche divergono. Incorporando altri software di video-cattura (dettagliato nella tabella Materials), la stessa configurazione consente periodi di monitoraggio flessibile e può essere utilizzato per monitorare le mosche per un massimo di 24 ore, prendendo le immagini ad un frame rate inferiore. Questa opzione è stata utilizzata per studiare i comportamenti di deposizione delle uova di mosche e confrontare le loro posizioni del corpo con le preferenze ovipositional ^14. Il olfattometro a quattro campo può essere usato anche per studiare le risposte a multimodali (ad esempio, olfattivi e visivi) stimoli, o combinare optogenetic ⁹ o ²¹ thermogenetic stimolazione con presentazioni di stimoli sensoriali. Inoltre, l'alta risoluzione temporale permette l'estrazione di traiettorie for ogni singolo volo nel set di dati insieme. Pertanto, il metodo permette di indagine in comportamenti di popolazione olfattive-guidato e anche singoli interazioni sociali. I dati generati da questo test sono robusti e altamente riproducibili, consentendo l'uso del olfattometro quattro campi per schermi comportamentali.

Descriviamo qui il gruppo di installazione per un olfattometro a quattro quadranti. Dimostriamo ulteriormente il suo uso in saggiare attrazione olfattiva in risposta ad aceto di mele e repulsione in risposta a propionato di etile altamente concentrata. Infine, descriviamo e fornire codice di esempio per l'analisi dei dati di rilevamento fly registrati.

1. Setup Assembly

1. Fabbricazione l'arena a forma di stella (19,5 cm x 19,5 cm x 0,7 cm) di politetrafluoroetilene (PTFE), secondo le previste disegno (materiali supplementari, SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf). L'arena può essere prodotto da una pubblicità o di un impianto personalizzato.
2. Acquisire due lastre di vetro (20,25 cm x 20,25 cm con spessore di 2 mm), ed un foro (~ 0,7 cm di diametro) esattamente al centro di una delle lastre di vetro con una punta diamantata.
3. Fabbricazione di una scatola di comportamento a tenuta di luce per l'arena comportamentale. Produciamo anche una scatola di macchina fotografica a tenuta di luce per la videocamera CCD a raggi infrarossi in base ai disegni forniti (materiali supplementari, SupplementalSketch_LightTightBox.pdf). Le scatole possono essere fabbricati da un commerciale o di un impianto personalizzato.
4. Montare il condizionatore sulla parete posteriore e le matrici LED sulle pareti laterali della scatola comportamento. Posizionare la sonda di temperaturanella casella comportamento attraverso un foro laterale per risposte tempo reale della temperatura e regolazione (vedi figure 1 e 2 per i dettagli).
5. Attaccare il filtro IR e polarizzatore circolare per la fotocamera e montare il gruppo nella casella di fotocamera. La casella di comportamento e la scatola della fotocamera sono separati da una finestra di vetro per un migliore controllo della temperatura della scatola comportamento (vedi figure 1 e 2 per i dettagli).
6. Collegare la fotocamera CCD ad infrarossi ad un adattatore fotocamera. Collegare l'adattatore fotocamera a un convertitore USB. Collegare il convertitore USB ad una porta USB del computer per l'acquisizione dei dati.
7. Installare il driver per il convertitore video sul computer in base alle istruzioni del produttore. Facoltativamente, installare il software di elaborazione delle immagini fornite dal produttore del convertitore video USB per accedere a una gamma più ampia di impostazioni della fotocamera e parametri di acquisizione.
8. Collegare il condizionatore (attraverso "l'uscita"Sul retro del regolatore di temperatura) e la sonda di temperatura (tramite" termocoppia "sul retro del regolatore di temperatura) al controllore di temperatura. Posizionare la sonda nella casella comportamento.
   Nota: Il sistema di controllo della temperatura nel nostro layout è in grado di mantenere la temperatura di dialogo fra 18 ° C e 30 ° C. Temperature ambiente superiori o inferiori potrebbero essere utili per thermogenetic (dTrpA1, TRPM8 o shibire ^ts) esperimenti per manipolare l'attività neuronale o inibire la trasmissione sinaptica. Per la maggior parte degli esperimenti, la temperatura viene mantenuta a 25 ° C.
9. Assemblare il sistema di erogazione degli odori nei passaggi successivi (si veda la Figura 1B per gli schemi dettagliati e raccordi di collegamento):
   1. Utilizzare il regolatore di pressione dell'aria per controllare l'ingresso aria dal sistema d'aria centrale. Collegare un filtro dell'aria in carbonio (riempito con carbone) al regolatore di pressione per purificare l'aria dalla zona centralesistema di ir.
   2. Assemblare il sistema di controllo di flusso costituito da più canali regolati da tubi flussimetro ad alta risoluzione.
   3. Collegare l'uscita dal filtro dell'aria carbonio ai tubi flussometro tramite un collettore come mostrato in figura 1B e 2F. Dirigere l'uscita dei tubi di misuratori di portata attraverso elettrovalvole a 3 vie a comando elettronico per regolare se l'aria pulita lasciando i misuratori di portata viene espulsa nella stanza o è entrato in camere odore misura ^24.
   4. Installare il controller elettrovalvola secondo il manuale del costruttore.
10. Installare il misuratore di flusso d'aria elettronica collegandolo ad un dispositivo di acquisizione dati (DAQ) e un alimentatore secondo il manuale del costruttore. Installare il software di interfaccia DAQ per verificare portate uguali in ogni quadrante della scena prima di ogni esperimento.

2. olfattiva stimoli Preparazione

1. Preparare 5 odoricamere formica ²⁴ che consistono in un contenitore esterno di plastica, vetro contenitore interno, un PTFE coperchio inserto misura, coperchio del contenitore originale con parte centrale rimossi, e due valvole unidirezionali.
   Nota: Un O-ring intorno al coperchio PTFE potrebbe essere utilizzata per impedire la perdita di aria dalla camera dell'odore durante odore perfusione. Vedere la Figura 1 per schematica e la Figura 2 per le foto delle camere.
2. Utilizzare quattro camere odoranti per controlli con solvente, e una camera per un odorizzante test. Riempire i contenitori di vetro con 1.000 ml di diluizione solvente o odorizzante (test odoranti + opportuni solventi, mescolare accuratamente prima di esperimenti), posizionare il contenitore di vetro all'interno della camera di plastica corrispondente (non fuoriuscire il liquido nella camera di plastica) e serrare il coperchio . Assicurarsi di utilizzare sempre una camera pulita per l'odorizzante di test e controlli con solvente.
   Nota: attrazione olfattivo può essere innescato da 1/16 di diluizione di aceto di mele (5% acidità) in wAter. Al contrario, il comportamento repulsione olfattivo può essere studiata utilizzando una diluizione 10% di etil propionato in olio minerale. stimoli di controllo in questi casi sono camere odore di olio minerale puro.

3. Preparazione Fly

1. Posteriore vola su medie farina di mais standard. Mettere 30 maschi e 30 femmine mosche genitori in una bottiglia standard, e far loro deporre le uova per 5 giorni a 25 ° C oa temperatura ambiente.
2. Per ogni esperimento, raccogliere nuova eclosed (<1 giorno di età) 25 maschi e 25 donne vola sotto brevi _di CO ₂ l'anestesia.
3. Tenere mosche in un flaconcino con il mezzo mosca standard per 2-4 giorni.
4. 40-42 ore prima dell'esperimento, trasferire le mosche senza CO ₂ anestesia   in una fiala con ~ gel 10 ml 1%. Ciò manterrà le mosche umidificate senza cibo, che contribuisce ad aumentare la loro attività locomotoria.
   Nota: Più del 90% delle mosche deve sopravvivere alla fame. Alcuni genotipi sono meno guarireil tuo e non può farlo attraverso una fame di 40 ore. In tali casi, periodi più brevi come 24-28 hr sono accettabili, ma dovrebbero essere mantenuti gli stessi per tutte le condizioni sperimentali e ripete.

4. risposte comportamentali alla attraenti e repellenti Sostanza odorante

1. Accendere il regolatore di temperatura e impostarlo a 25 ° C.
2. Collegare camere di odorizzante (controllo e test odoranti) inserendo il tubo all'uscita della camera di odorizzante e al push-to-connect montaggio sulla scatola comportamento.
3. Controllare la portata in ogni quadrante utilizzando il debimetro per assicurarsi che il controllo e correnti d'aria olfattivi sono pari a 100 ml / min.
4. Pulire l'arena PTFE volo e le lastre di vetro con il 70% di etanolo 2-3 volte e lasciare asciugare completamente all'aria (~ 3-4 minuti).
5. Fissare le lastre di vetro per l'arena con fascette.
6. Trasferimento vola senza CO ₂ anestesia nell'arena attraverso il foro in una delle lastre di vetro. A poppaer il trasferimento, posizionare una maglia circolare sul foro per evitare la fuoriuscita mosche.
   Nota: CO ₂ anestesia ha mostrato di influenzare il comportamento Drosophila ²⁵ e non deve essere utilizzato entro 24 ore di un esperimento comportamentale.
7. Posizionare l'arena con le mosche nella camera a tenuta di luce, collegare i flussi d'aria quattro controllo collegando il tubo collegato al raccordo sulla scatola comportamento verso gli angoli dello stadio push-to-connect, chiudere la porta della camera e attendere 10- 15 minuti per consentire le mosche acclimatarsi al nuovo ambiente. Se possibile, attivare le luci nella stanza in cui vengono eseguiti gli esperimenti, per evitare possibili perdite di luce minima che può pregiudizio il risultato sperimentale.
8. Eseguire un esperimento di controllo 5-10 minuti, in cui le mosche sono esposti a correnti d'aria 4 di controllo.
9. Analizzare i dati immediatamente (vedere la sezione di analisi dei dati di seguito) per fare in modo che le mosche sono distribuite in modo uniforme in campo, e l'attrazione indice è vicino0. Questo passaggio è essenziale, poiché verifica che non vi siano fonti incontrollate di preferenza o evasione all'interno dell'arena (ad esempio la luce che fuoriesce dall'esterno, distribuzione di temperatura uniforme, un'arena irregolare, contaminazione odori, etc.). Se le mosche sono distribuite inegualmente o la loro attività locomotoria è bassa, scartare le mosche, pulire nuovamente l'arena (Passo 4.4) e utilizzare un nuovo lotto di mosche di ripetere l'esperimento.
10. Collegare la camera di prova odorizzante per la messa a punto inserendosi valvole a 3 vie o ri-collegare i tubi di collegamento.
11. Eseguire esperimento di prova per 5-10 minuti e analizzare i dati come discusso nella sezione 5 di seguito (vedi anche Riferimento 14 e Figura 3). Le registrazioni più lunghe di 20 minuti può risultare in file di dati che possono essere difficili da trattare computazionalmente. Se le registrazioni più sperimentali sono desiderati, rapidamente fermare e riavviare il programma di monitoraggio. Ciò si traduce in un vuoto ~ 10 sec tra le registrazioni sperimentali.
12. Discard mosche.
13. Piastre pulite arena e vetro con il 70% di etanolo (passo 4.4) e sostituire i tubi di collegamento all'interno del contenitore a tenuta di luce. Per accelerare esperimenti, una nuova arena pulito può essere utilizzato, e l'arena sporca pulita durante l'esecuzione di prove sperimentali.
14. Eseguire un altro esperimento con un nuovo lotto di mosche, se necessario. Se diversi esperimenti vengono eseguiti nello stesso giorno, prestare la massima attenzione per garantire che nessun odorizzante viene lasciato nel sistema da una precedente prova. Questo non è normalmente un problema con basse concentrazioni di odoranti o con CO _2, ma può essere necessaria per stimoli altamente concentrate fino ad un gap 24 ore tra prove sperimentali. Inoltre, tutti i tubi dopo le portate tubi può essere sostituito se la contaminazione odorizzante è sospettata durante esperimenti di controllo. lasciare sempre l'aria secca su tra gli esperimenti per irrigare continuamente il sistema

Analisi 5. I dati

Nota: La mosca suggerito acquisizione di monitoraggio software (descritto nei materiali), tiene traccia mosche in tempo reale durante l'acquisizione, e consente di risparmiare il timestamp e le coordinate di tutte le mosche rilevati in formato * .dat. Abbiamo sviluppato una routine misura Matlab per convertire i dati in un formato Matlab, e analizzare i dati. Esempi di codice sono forniti in materiali supplementari, ma i dettagli di implementazione dipenderanno dal software utilizzato per l'acquisizione dei dati.

1. Caricare i dati grezzi. Creare una maschera spaziale che segue i contorni del campo e applicare la maschera per i dati grezzi per rimuovere tutti i punti di dati che non rientrano dell'arena in quanto rappresentano il rumore (Figura 4A, supplementare Codice MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask. m).
2. Rimuovere tutti i punti di dati che si muovono ad una velocità inferiore 0.163 cm / s per più di 3s, come questi dati è probabile che sia rumore o generato da mosche non-movimento (Figura 4B, complementare Codice TemporalFiltering.m).
3. Visualizzare i dati rimanentipunti da loro tracciando fuori tutto in una volta o come singole traiettorie (Figura 3, Codice supplementare SingleTrajectoryViewer.m).
   Nota: La posizione dei confini odore in quattro campi probabilmente dipende da una serie di fattori, quali le caratteristiche di ogni odorizzante e le portate in uso. Ad esempio, odoranti altamente volatili probabilmente riempire il quadrante odore più completo rispetto odoranti meno volatili. Quindi è probabile che ogni odorizzante può mostrare leggermente diversi confini odore. L'uso di un rivelatore fotoionizzazione per misurare confini odore può essere problematico in quanto utilizza un vuoto per campionare l'aria da un determinato luogo, e quindi interrompe la concentrazione di odorizzante in quel punto. Tuttavia, i confini odore può essere rapidamente stimati sulla base di dati comportamentali mosca. Ad esempio, un confine odore base di tracce fly cumulate in risposta a diversi odori può osservare chiaramente nelle figure 3C e 3D.
4. Calcolare un indice attrazione per determinare se esperimenti di controllo generano alcuna risposta preferenza, e anche per accedere alla risposta ad un odorizzante (o optogenetic ⁹⁾ stimolo. Per calcolare un indice di attrazione (AI), utilizzare gli ultimi 5 minuti di un controllo o di registrazione di prova. Per ottenere una misura di attrazione che cade tra +1 (attrazione assoluta) e -1 (repulsione assoluta), la seguente formula per calcolare la AI:
   
   dove _prova N è il numero di punti di dati nel quadrante di prova, _{il controllo} N è il numero medio di punti dati tre quadranti di controllo. Questa misura è intuitivo come nessuna preferenza sarebbe indicato da valori prossimi allo zero. Tuttavia, non indica correttamente la proporzione del numero totale di linea che si trovano nel quadrante odorizzante. Per ottenere questa misura, un indice percentuale (PI) può essere utilizzato:
   
   dove _prova N è il numero di punti di dati nel quadrante test e N _totale è il numero totale di punti di dati in quattro quadranti. Questa formula fornisce una misura che rientra tra 0 e 1, con 0,25 corrispondenti a nessuna preferenza comportamentale (Figura 3E e 4C, complementare Codice AttractionIndex.m).
5. Eseguire 5-10 ripetizioni di ogni condizione sperimentale, utilizzando un nuovo gruppo di mosche per ogni ripetizione. Confrontare gli indici di attrazione tra le condizioni o contro i controlli utilizzando il test di Kolmogorov-Smirnov non parametrico (Figura 3F, la funzione kstest2 in Matlab).

I record del test olfattometro a quattro quadranti e analizza le attività ambulanti di molti vola sopra un grande spazio comportamentale. Odoranti possono essere introdotti nelle aeree correnti che entrano uno, due, tre, o tutti i quattro quadranti. In assenza di odori, le mosche muoversi liberamente tra tutti i quattro quadranti. Questo comportamento è fondamentale per osservare in quanto indica che i pregiudizi non intenzionali, non sono state introdotte nel test. Questi pregiudizi possono includere luce, variazioni di temperatura, le differenze di flusso d'aria, o contaminanti odore. La figura 3B mostra le risposte comportamentali in olfattometro a quattro quadranti di 25 maschi e 25 donne vola ad asciugare all'aria. Una singola fly-track a partire dai dati raccolti è evidenziata anche nella figura 3B, e dimostra che questa mosca stava esplorando l'intera arena comportamentale. Il punteggio dell'indice di attrazione (AI) per tutte le tracce analizzate durante il periodo di prova di 5-min è vicino a 0, Indicating una mancanza di attrazione per quadrante odore. Analogamente, l'indice percentuale (PI) dell'esperimento è 0,24, che indica che le mosche sono stati distribuiti abbastanza omogenea nei quattro quadranti durante il periodo di prova di 5-min.

La risposta comportamentale quattro campi a un odorizzante attraente è mostrato in Figura 3C. Aceto di mele è introdotto nella corrente d'aria di   in alto a sinistra odore quadrante flusso d'aria mettendo una diluizione 6,25% di aceto di mele nella camera odore di prova. Le tracce mosca raccolti in grigio dimostrano che la maggior parte delle mosche raccolgono in questo odore quadranti, ed esplorare non più tutti i quattro quadranti. Una singola traccia mosca colorata mostra che una volta una mosca entra nel aceto di mele odore quadranti, tende a rimanere nella attraente quadrante odore. L'intelligenza artificiale di 0,94 per l'esperimento è vicino a 1 indicando una forte attrazione per questo odorizzante. Il PI di 0,92 indica che il 92% delle mosche remained nel quadrante odori durante il periodo di analisi.

La risposta comportamentale quattro campo per un odorizzante repellente è mostrato in Figura 3D. Una diluizione a 10% del propionato di etile odorizzante posto in una camera di odore è stato usato come sorgente di odore per il flusso d'aria in alto a sinistra. Le tracce mosca ammassati per l'esperimento analizzato dimostrano evitamento del quadrante odore, suggestiva di repulsione odori-guidata. Una singola traccia mosca colorata mostra che una mosca, quando entrò il quadrante odore, si trasforma ben presto via per evitare il quadrante odore. L'intelligenza artificiale del -0.68 è minore di 0, che indica la repulsione, ed è vicino a -1, indicativo di una forte risposta odorizzante ripugnante. Il PI di 0,06 per l'esperimento suggerisce che solo il 6% (rispetto al ~ 25% negli esperimenti odore neutri) dei punti dati fly monitorati sono stati trovati nel quadrante odore nel corso dell'esperimento.

Un indice attrazione è la metrica più ampiamente usato per analizzare i dati olfattivi quanto permette punteggi superiori 0 per indicare attrazione (positivo) e colonne inferiori a 0 per indicare repulsione (negativo). Più il punteggio è di rispettivamente +1 o -1, più forte è l'attrazione o repulsione per quell'odore,. Come descritto sopra, questo parametro non può indicare chiaramente la percentuale o la percentuale di mosche monitorati al quadrante odore nel corso dell'esperimento. In questo caso, un indice percentuale può essere più informativo. Figura 3E diagrammi il rapporto tra intelligenza artificiale e punteggi PI, e di come questi numeri si riferiscono a comportamenti di attrazione o repulsione.

Il dosaggio quattro campi traduce in comportamenti olfattivi robusti e riproducibili. Questo permette di confronto quantitativo tra controllo e alle condizioni sperimentali, come mostrato in figura 3F, e consente inoltre l'identificazione di sottili olfactory risposte che si discostano dalla neutralità.

Inoltre, poiché i dati sono ottenuti ad alta risoluzione spaziale e temporale, è possibile studiare numerosi fattori di risposte comportamentali, come traiettorie dei singoli mosche (come mostrato in figura 3), oltre a caratterizzare dinamiche diverse attività delle mosche un campo odori (ad esempio, cambiamenti di direzione e velocità ^19,20).

Può essere spesso difficile posizionare l'arena quattro campo nella stessa identica posizione per ogni esperimento, soprattutto perché è necessaria una pulizia frequente dell'arena. L'analisi fornito script compensare queste leggere variazioni dapprima montare i dati come mostrato nella Figura 4A. In questo caso, la forma dell'arena quattro campo viene calcolato, e punti di dati che esulano questo spazio vengono rimossi. Questi oggetti tracciati rappresentano spesso debRIS o riflessioni che vengono erroneamente monitorati. Poiché non si trovano all'interno dell'arena e rappresentano quindi il rumore, è importante che questi punti di dati vengono rimossi per evitare erronee analizza i dati. Allo stesso modo, è importante anche per rimuovere i punti dati registrati che potrebbero rappresentare rumore o mosche non si spostano all'interno della scena. A tale scopo, uno script analisi viene utilizzato (e qui fornita) che rimuove punti di dati che essenzialmente non si muovono (come mostrato nella Figura 4B). Questi punti di dati sono di solito in minoranza, ma la loro conservazione porterebbe ad errori nelle analisi.

Indice di attrazione e colonne di indice preferenza possono essere calcolati dopo un periodo di tempo impostato (ad esempio al termine di un 5 min esperimento come mostrato in figura 3). Va notato, tuttavia, che le mosche sono tracciati con elevata risoluzione spaziale e temporale, analisi simili possono essere eseguite durante l'esperimento. Questo èmostrato in figura 4C in cui indice della attrazione e indice Percentuale punteggi sono calcolati in continuo bidoni di 10 secondi nel periodo di tempo. Tale analisi permette di apprezzare meglio i cambiamenti olfattivi che potrebbero verificarsi durante l'esperimento, come assuefazione ad un odorizzante.

Figura 1:. Schema del Olfattometro quattro quadranti (A) Il setup comportamento è composta da un sistema di erogazione odore, sistema di controllo della temperatura (non schematizzato), sistema di acquisizione immagini (IR luci e fotocamera CCD IR collegato a un computer LED), quattro quadranti arena e scatole di comportamento e arena a tenuta di luce. I cerchi rossi indicano i corrispondenti componenti mostrati nella Figura 2. (B) progettazione dettagliata del sistema di erogazione odore. I caratteri verdi rappresentano le dimensioni di connessione / conversione di fittings. Tubi di 1/16 ID e 1/8 OD sono etichettati in giallo, mentre quelli di 1/8 e 1/4 ID OD sono etichettati in rosa. Abbreviazioni: IR, infrarossi; CF, Raccordo di compressione; BF, Filo montaggio, MNPT, maschio Nazionale Filetto di tubo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2:. Fotografie di Setup olfattiva Assay (A) Wide-view campo della scatola macchina fotografica e scatola di comportamento. (B) Vista all'interno della scatola comportamento. La sonda di temperatura, tubi di collegamento e array di LED IR sono etichettati. (C) a quattro quadranti Arena. (D) Wide-field del sistema di erogazione odori collegato alla scatola comportamento. La scatola della fotocamera è stata rimossa per rivelare la camera CCD. (E ) Centrale aria viene fatta passare prima attraverso un regolatore di pressione e poi attraverso un filtro a carbone. (F) Esempio dei tubi odore collegati al collettore. (G) tubi di flusso ad alta risoluzione a regolare il flusso d'aria. (H) Il tubo di erogazione odore e connettori a valle dei regolatori del tubo di misura. (I) Le elettrovalvole regolano se l'aria pulita viene fatta passare attraverso una camera di odore o espulso per la stanza. Camere (J) L'odore sono collegati alle valvole unidirezionali, e contengono un contenitore di vetro interno per l'odorizzante. (K) La scatola contiene comportamento raccordi esterni push-to-connect che si connettono al tubo di erogazione odore. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Esempio di dati generata utilizzando un quattro campo Assay olfattiva (A) Schema dell'arena quattro campi.. (B) le risposte neutrali sono stati osservati quando tutti e quattro i quadranti contengono solo perfusione aria secca. Risposte (C) attrazione per una diluizione 6,25% di aceto di mele perfuso dal quadrante in alto a sinistra. Comportamenti (D) repulsione innescati da 10% propionato di etile. In Figura 2B-2D, un unico percorso dai dati acquisiti vengono tracciati. Una sfumatura di colore è usato per indicare l'andamento nel tempo della registrazione, con i colori blu e rosso è l'inizio e la fine delle registrazioni, rispettivamente. (E) Il confronto dell'Indice di attrazione (AI) e la percentuale Index (PI). (F) media AI dispone di 3- 6 esperimenti con nessun odore (Control), aceto di mele (ACV) e il 10% di etile propionato (EP). Le barre di errore indicano SEM. differenza statistica è stata valutata dal Kolmogorov-Smirnov TEst. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4:. Esempio dati generati dai dati di analisi Steps (A) filtraggio spaziale dei dati, eseguiti da MaskSpatialFiltering.m per rimuovere i punti di dati che non rientrano dell'arena. cerchi rossi mostrano le posizioni iniziali dei cerchi che vengono utilizzati per definire i confini del campo. cerchi neri sono le posizioni finali, acquisite dal montaggio del cerchio delinea i dati (grigio zona ombreggiata all'interno del quattro-campo). I puntini rossi e frecce nere indicano i punti di dati che verranno rimossi dal set di dati dopo questo passaggio filtrante. (B) il filtraggio temporale dei dati, eseguita da TemporalFiltering.m. Questo passaggio filtrante rimuove i punti di dati che si muovono molto sloWLY o non del tutto, in quanto sono suscettibili di essere generata dalle mosche non-movimento o da sporcizia / riflessioni dall'Arena. Un punto rosso, circondato da una scatola rossa tratteggiata indica le posizioni di ~ 6.000 punti di dati con coordinate identiche che verranno rimossi da questo passaggio filtrante. Index (C) di attrazione (AI) e percentuale dell'indice (PI), calcolato in bidoni di 10 secondi nel corso degli ultimi 5 min di un esperimento per AttractionIndex.m. Profili temporali di questi indici contengono informazioni sulle dinamiche di risposte comportamentali e possono essere utilizzati per l'analisi dettagliata dei comportamenti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Il olfattometro a quattro campi qui descritto è un sistema comportamentale versatile per studiare le risposte olfattive di grandi popolazioni di wild-type e mutante Drosophila mosche. Ogni esperimento prende ~ 1 ora (tra cui l'installazione, prove sperimentali, e pulizia), e 4-6 esperimenti può essere eseguita di routine di ogni giorno. Un tipico saggio usando 40-50 mosche per 5 minuti produce circa 450.000 monitorati punti dati per l'analisi. La configurazione descritta può anche essere utilizzato, con piccole modifiche, per monitorare i movimenti di altri insetti o larve di insetti in risposta ad olfattiva o altri stimoli sensoriali in un periodo di tempo, che varia da un minimo di giorni. Il dosaggio quattro quadranti è sensibile agli effetti dei due stimoli attrazione e di repulsione. La maggior parte degli odoranti generano attrazione indici (AI) tra -0.9 e +0,9 (Equazione 1). Un AI nel range di 0,5-1 significa forte attrazione comportamento delle mosche agli stimoli, mentre AI nel range -0,5 a -1 èinnescato da forti repellenti. In generale, una risposta neutrale per gli odori di controllo (aria secca, aria umidificata, olio minerale) dovrebbe essere compreso tra 0,1 e -0.1. L'intelligenza artificiale cambia spesso durante il corso dell'esperimento di prova, che riflette il tempo vola richiedono di camminare nei pennacchi odorizzante, attrazione iniziale e aumento dell'attività locomotoria verso un romanzo di stimolo, e l'eventuale desensibilizzazione in risposta allo stimolo. piste di controllo pre-test sono essenziali, e possono essere eseguite con attenzione per garantire che le mosche sono stati distribuiti uniformemente in campo in assenza dello stimolo desiderato.

La maggior parte delle cause frequenti di pregiudizi spaziale di mosche in campo sono: i flussi irregolari aria, forse a causa di tubi scollegati o lastre di vetro serrati adeguatamente dell'arena a forma di stella (nella nostra esperienza, le mosche sono in grado di rilevare le differenze di flusso d'aria di appena 15 ml / min); distribuzione di temperatura uniforme in tutta l'arena, che può essere migliorata impostando lacondizionatore per generare il flusso d'aria più deboli e più diffuso e / o più a lungo periodo di pre-acquisizione (~ 20 min) per garantire anche la temperatura dell'arena; perdita di luce minima attraverso l'apertura sonda di temperatura, che può essere ridotta sigillando l'apertura con nastro adesivo nero; odore residuo in campo o nel sistema di erogazione dell'aria, nel qual caso la configurazione (scena, i tubi di misura, raccordi dell'involucro a tenuta di luce, ecc) devono essere puliti a fondo e lasciati asciugare per diversi giorni o sostituito, ove possibile.

Manutenzione dell'apparecchiatura olfattivo è importante per ottenere risultati affidabili e coerenti. Push-to-connect raccordi sulla scatola comportamento e prese d'aria e le pareti interne del campo devono essere pulite con etanolo dopo ogni esperimento se vengono utilizzati gli odori forti, e lasciate asciugare completamente. Le lastre di vetro devono essere lavati tre volte con una etanolo al 70%, che è di solito sufficiente rimuovere odore residuo e la sporcizia dalle piastre, ma esano è utilenella rimozione composto organico depositato da linea (ad esempio, feromoni costituito da idrocarburi a catena lunga). Sapone non è generalmente raccomandato perché di solito contiene componenti aromatiche, che possa modificare i comportamenti olfattive. La casella di comportamento dovrebbe rimanere collegato alle prese d'aria secca tra esperimenti (ad esempio durante la notte) per facilitare la rimozione degli odori residui dal sistema.

Se l'attività locomotoria delle mosche è basso, possono generare troppo pochi punti di dati, che spesso si traduce in un rumoroso e variabile indice di attrazione. La fame e la registrazione tempi più lunghi possono aiutare a risolvere questo problema. Al contrario, se le mosche sono malati, 24-28 ore di fame sarebbe generalmente sufficiente per migliorare l'attività locomozione, purché sia ​​coerente in tutto esperimenti. Vi è un sottile equilibrio tra il mantenimento di un buono stato di salute delle mosche e aumentando la locomozione. 40 hr inedia può essere usato come punto di partenza, e modificata comenecessario sulla base dei risultati sperimentali. Gli indici attrazione sarà in qualche modo influenzati dalla durata di fame, quindi è essenziale per morire di fame tutti gli animali sperimentali per lo stesso periodo di tempo al fine di evitare effetti confondenti di tempo di fame. tempi più lunghi fame di solito fanno le risposte repulsive più debole (più vicino a 0), e le risposte interessanti forte. flussi d'aria di controllo aria secca tendono ad essiccare le mosche, e non devono essere utilizzati per più di 40 min.

Il olfattometro quattro quadranti può essere usato per studiare le risposte di singoli o multipli ^16,18 mosche a un singolo stimolo o studiare preferenza scelta tra stimoli. Ad esempio, odori diversi potrebbero essere utilizzati in ciascuno dei quattro quadranti. Questo potrebbe anche essere utilizzato per determinare le risposte odori miscele esaminando i confini delle odore-quadranti. Va notato che, anche se il sistema di monitoraggio permette singole tracce di isolare dai dati raccolti, èpossibile che i singoli mosche possono comportarsi in modo diverso quando dosati come parte di un gruppo rispetto a quando sono testati da soli. Ad esempio, i gruppi di mosche presentare un aumento delle repulsione odore-guidata a causa di interazioni fisiche tra le mosche ^26. Il sistema e il layout di monitoraggio possono anche essere adattati per essere utilizzati in saggi non olfattive. Il quadro test può comodamente ospitare una serie di LED ⁹ per la stimolazione optogenetic, o una piastra termica ²⁷ per thermogenetics. Il sistema può anche essere adattato per studiare scelte comportamentali di una scala temporale di molti hr, ad esempio per studiare il comportamento delle uova ^14. In questo caso, il frame rate di acquisizione deve essere regolata per evitare la generazione di grandi quantità di dati, e una fonte di umidità e substrato (gel di agarosio 1%) devono essere forniti come substrato deposizione delle uova.

Una limitazione di questa configurazione è che le mosche sono tracciati come IR-riflettenti e sotto l'Arena-se qualsiasi elemento di un optogenetic oesperimento thermogenetic riflette IR, i punti dati irrilevanti dovrà essere rimossa durante la post-elaborazione. Attualmente non è neppure possibile filmare le mosche con una risoluzione spaziale che permette ai diversi mosche di essere continuamente distinguibili, ma questo può essere migliorato in futuro utilizzando le videocamere più avanzate. Un'altra limitazione del sistema attuale è che il movimento di mosche è vincolato a due dimensioni per promuovere comportamenti piedi, e impedirà risposte ponti olfattivi-indotta.

Va notato che ulteriori test automatizzati sono stati sviluppati per studiare i comportamenti olfattive di singolo o gruppi di mosche. Il design più simile al test qui descritto è un metodo sviluppato da Beshel e Zhong ^28. In questo test, le risposte di ~ 30 mosche sono monitorati in un piccolo un'arena circolare (circa un quarto della superficie dell'arena quattro campi) in cui gli odori sono consegnati dal 1 su 4 porte odore lungo il wa dell'arenall, e rimosso attraverso un foro al centro dell'arena circolare. Oltre un'arena più piccola, altre differenze di design comprendono comportamenti di essere eseguite in condizioni di luce, e odoranti concentrandosi soprattutto vicino alle porte di odore (invece di tutto il quadrante di odorizzante come indicato dalle pareti increspate dell'arena quattro-campo). Tuttavia, l'ambito circolare è un metodo adatto per lo screening risposte olfattive di mosche, e potrebbe essere adattata alla struttura inseguimento mosca descritto qui.

Un approccio alternativo è quello di monitorare contemporaneamente l'attività di molte singole mosche in risposta agli odori. Nel saggio Flywalk, singoli mosche sono collocati in piccoli tubi, e le loro risposte monitorati quando odoranti sono perfusi attraverso il tubo ^29,30. Cambiamenti in avanti o indietro, o cambiamenti di velocità, possono essere utilizzati per valutare se un odorizzante è generalmente attrattiva o repulsiva. Questo test, come il saggio a quattro campi, segue automaticamente fly movements, e quindi può essere utilizzato per misurare rapidamente le risposte olfattive a una vasta gamma di odori. Tuttavia, a differenza del quattro campi, dinamiche motorie complesse, quali angoli di traiettoria tornitura e potenziali interazioni sociali, forse perso nella registrazione dosaggio Flywalk.

Il monitoraggio automatico di mosche singoli ambulanti è stato adattato ad un tipo di saggio T-labirinto ^31,32. In questo saggio, mosche sono collocati in piccole camere in cui gli odori sono perfusi da entrambe le estremità della camera e l'uscita attraverso una porta al centro della camera. Le posizioni delle mosche sono anche monitorati automaticamente. Questo imita, su un'unica scala mosca, un quadro T-labirinto. In combinazione con optogenetics, questo test è stato particolarmente adatto per saggiare i circuiti neurali che mediano l'apprendimento olfattivo e la memoria, e può anche essere utilizzato per valutare le preferenze olfattive dei singoli mosche. Simile a Flywalk, non può controllare la dinamica attività complesse che possono verificarsi su aree spaziali più grandi, Come quelle che si verificano durante o comportamenti alimentari in cerca ¹⁴ che si verificano solo in popolazioni mosca.

The authors declare that they have no competing financial interests.

We thank Terry Shelley for manufacturing the fly arena and the light-tight enclosure, Liz Marr for help with fly stock maintenance, and Xiaojing Gao and Junjie Luo for help with the Matlab code used for data analysis. We thank Johan Lundström at the Monell Chemical Senses Center for demonstrating his odor delivery setup. This work was supported by grants from the Whitehall Foundation (CJP) and NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).