We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

Un desafío clave en la neurobiología es entender cómo los circuitos neuronales funcionan para guiar los comportamientos adecuados con animales. Drosophila melanogaster es un excelente sistema modelo para este tipo de investigaciones, debido a sus comportamientos complejos, técnicas genéticas de gran alcance, y el sistema nervioso compacto. Ensayos de comportamiento de laboratorio han sido utilizados con Drosophila para simular propiedades del entorno natural y estudiar los mecanismos neurales que subyacen a los comportamientos correspondientes (por ejemplo fototaxis, quimiotaxis, el aprendizaje y la memoria sensorial) ^1-3. Con la reciente disponibilidad de grandes colecciones de líneas transgénicas de Drosophila que etiquetan subconjuntos neuronales específicas, ensayos de comportamiento han asumido un papel destacado para vincular las neuronas con comportamientos ^4-11. paradigmas versátiles y reproducibles, junto con las rutinas computacionales para el análisis de datos subyacentes, son indispensables para pruebas rápidas de líneas de vuelo con varios candidatos GenotypES. Particularmente útiles son las configuraciones que son flexibles en el número de animales sometidos a ensayo, la duración de los experimentos y la naturaleza de los estímulos presentados. El ensayo de elección también debería generar datos reproducible que es fácil de adquirir y analizar. A continuación, presentamos una descripción detallada de un sistema y el protocolo para ensayar las respuestas de comportamiento de moscas Drosophila en un gran estadio de cuatro campos. La configuración se utiliza aquí para probar las respuestas de las moscas a un único estímulo olfativo; sin embargo, la misma configuración puede modificarse para poner a prueba olfativa múltiple, los estímulos visuales o optogenética, o una combinación de estos. La configuración olfatómetro registra la actividad de las poblaciones de moscas que responden a los olores, y se aplican métodos de análisis computacionales para cuantificar los comportamientos de moscas. Los datos recogidos son analizados para obtener una lectura rápida de una prueba experimental, que es esencial para la recopilación de datos eficiente y la optimización de las condiciones experimentales.

La capacidad de adaptarse y responder al entorno externo es fundamental para la supervivencia de todos los animales. Un animal necesita para evitar peligros, buscar comida y encontrar compañeros, y aprender de las experiencias anteriores. Los sistemas sensoriales funcionan para recibir una variedad de estímulos, tales como visual, químicas y mecanosensorial, y enviar estas señales al sistema nervioso central debe ser interpretado y decodificada. Entonces, el cerebro dirige conductas motoras apropiadas basadas en la percepción del medio ambiente, tales como la búsqueda de alimentos o escapar de un depredador. La comprensión de cómo los sistemas sensoriales detectan el mundo exterior, y cómo el cerebro decodifica y dirige las decisiones, es un reto importante en la neurobiología.

Drosophila melanogaster es un sistema poderoso modelo para la investigación de cómo los comportamientos de los nervios de guía circuitos. Además de ser sencillo y barato de mantener, Drosophila exhiben muchos de los comportamientos estereotipados diversas y complejas, sin embargo, lo hacen con un compacT del sistema nervioso de los cerca de 100.000 neuronas. Existen poderosas técnicas genéticas para manipular el genoma de Drosophila, y miles de líneas transgénicas que se han generado de forma selectiva y reproducible etiquetar los mismos subconjuntos de neuronas ^10-13. Estas líneas transgénicas se pueden utilizar para manipular selectivamente la actividad de las neuronas marcadas (activar o inhibir), y estas manipulaciones se pueden utilizar para investigar cómo neural comportamientos funciones de guía.

Ensayos de comportamiento múltiples se han desarrollado para el estudio de diversos comportamientos de Drosophila. Drosophila, al igual que muchos animales, usan su sentido del olfato para guiar muchas opciones de comportamiento, tales como la búsqueda de alimentos, la búsqueda de compañeros, y evitar peligros. Por lo tanto, el olfato es un buen sistema sensorial para investigar cómo se detectan e interpretados por el sistema nervioso de un animal para guiar las decisiones adecuadas estímulos externos. Como tal, un número de ensayos han sido desarrollados para Investigalarvario Ting y comportamientos olfativas adultos. Tradicionalmente, los comportamientos olfativas en Drosophila se ensayaron mediante un paradigma laberinto en T de dos elección, que se puede utilizar para ensayar innata y los comportamientos aprendidos olfativas ^3. En este ensayo, alrededor de 50 moscas se les da a elegir entre dos tubos: uno de los tubos contiene el olor en cuestión y la otra contiene un odorizante de mando (generalmente el disolvente olor). Las moscas se les da un período determinado de tiempo para tomar una decisión, y después se contó el número de moscas que se encuentran en las diferentes cámaras. Aunque el T-laberinto es un ensayo simple para muchos experimentos, hay varias limitaciones. Por ejemplo, los comportamientos olfativas se miden en un solo punto del tiempo, y diferentes elecciones realizadas antes de este punto de tiempo se descartan. Del mismo modo, los comportamientos individuales de las moscas dentro de la población se descuidan. Además, el laberinto en T requiere conteo manual de las moscas, que puede introducir errores. Finalmente, puesto que sólo hay dos opciones de medición, estereduce la potencia estadística a menudo requerido para detectar sutiles cambios de comportamiento. Una alternativa a una elección de dos T-laberinto es un olfatómetro de cuatro cuadrantes (de cuatro campos) ^14-18. En este ensayo, los animales exploran un escenario en el que cada una de las cuatro esquinas de la arena se llena con una posible fuente de aire olorizado. La arena tiene una forma de estrella fruncido para maximizar la formación de cuatro cuadrantes de olor definidos experimentalmente. Si el olor se suministra en una de las esquinas entonces se incluirá solamente en que un cuadrante. Los comportamientos de los animales pueden ser rastreados a medida que entran y salen del cuadrante olor, y fácilmente en comparación con su comportamiento en los tres cuadrantes de control. Así, el ensayo olfatómetro de cuatro cuadrantes registros de respuesta de comportamiento espacial y temporal de los estímulos de olor más de un gran estadio experimental.

El olfatómetro de cuatro cuadrantes fue desarrollado por primera vez por Pettersson et al. ¹⁵ y Vet et al. ¹⁷ para investigar el ollas respuestas de comportamiento de fábrica de los himenópteros parásitos individual. Faucher et al. ¹⁸ y ¹⁶ Semmelhack y Wang adaptaron la configuración para supervisar las respuestas olfativas de Drosophila individuo. El olfatómetro de cuatro cuadrantes es igualmente sensible a las respuestas de atracción y repulsión, lo que permite una amplia gama de odorantes y condiciones de ensayo. Software de seguimiento de mosca por encargo por escrito, desarrollado por Alex Katsov ¹⁹ y actualmente mantenido por Julian Brown (se detalla en Materiales), presentó ventajas adicionales para las implementaciones más recientes del olfatómetro de cuatro cuadrantes ^14,20-23. Ahora es posible ensayar hasta 100 moscas simultáneamente en alta resolución espacial (27,5 píxeles / cm) y temporales (30 cuadros por segundo) de resolución, que permite extraer varios parámetros, tales como posición, velocidad y aceleración de las moscas en cualquier punto de tiempo. Esto permite que las investigaciones sobre la dinámica de las respuestas de comportamiento de las moscas a los olores ²⁰ . Cabe señalar, sin embargo, que la identidad de moscas individuales dentro de la población durante todo el período de seguimiento no se mantiene. En su lugar, cada pista mosca se registra durante el tiempo de dos pistas de la mosca no se cruzan. Momento en el cual, las nuevas pistas se les asignan después de las moscas divergen. Mediante la incorporación de otro software de captura de vídeo (que se detallan en la Tabla Materiales), la misma configuración permite que los períodos de seguimiento flexible y se podría utilizar para realizar un seguimiento de las moscas para un máximo de 24 h por la toma de imágenes a una velocidad inferior. Esta opción se utiliza para estudiar los comportamientos que ponen huevos de moscas y comparar sus posiciones corporales con las preferencias de oviposición ^14. El olfatómetro de cuatro campos también se puede utilizar para estudiar las respuestas a multimodal (por ejemplo, olfativos y visuales) estímulos, o para combinar optogenético ⁹ o ²¹ thermogenetic estimulación con presentaciones de estímulos sensoriales. Además, la alta resolución temporal permite la extracción de trayectorias for cada una mosca individual en el conjunto de datos de conjunto. Por lo tanto, el método permite la investigación en comportamientos de la población-olfativas guiadas y las interacciones sociales individuales. Los datos generados por este ensayo son robustos y altamente reproducible, lo que permite el uso del olfatómetro de cuatro campos para pantallas de comportamiento.

Se describe aquí el conjunto de configuración para un olfatómetro de cuatro cuadrantes. Además, demuestran su uso en el ensayo de atracción olfativa en respuesta a vinagre de manzana y repulsión en respuesta a propionato de etilo altamente concentrado. Finalmente, describimos y proporcionamos código de ejemplo para el análisis de los datos de seguimiento mosca grabados.

1. Configuración de la Asamblea

1. Fabricación la arena en forma de estrella (19,5 cm por 19,5 cm por 0,7 cm) de politetrafluoroetileno (PTFE) de acuerdo con el dibujo (Materiales suplementarios, SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf), siempre. La arena puede ser fabricado por un una instalación de encargo comercial o.
2. Adquirir dos placas de vidrio (20.25 cm por 20.25 cm con espesor de 2 mm), y perforar un agujero (~ 0,7 cm de diámetro), precisamente en el centro de una de las placas de vidrio utilizando una broca de diamante recubierto.
3. Fabricar una caja hermética a la luz el comportamiento de la arena de comportamiento. También la fabricación de una caja hermética a la luz de la cámara para la cámara de vídeo CCD de infrarrojos de acuerdo con los planos proporcionados (materiales complementarios, SupplementalSketch_LightTightBox.pdf). Las cajas pueden ser fabricados por un encargo una instalación comercial o.
4. Montar la unidad de aire acondicionado en la pared posterior y las matrices de LED en las paredes laterales de la caja comportamiento. Coloque la sonda de temperaturaen el cuadro de la conducta a través de un orificio lateral para la retroalimentación de la temperatura en tiempo real y el ajuste (ver figuras 1 y 2 para más detalles).
5. Coloque el filtro de IR y polarizador circular para la cámara, y montar el conjunto en la caja de la cámara. El cuadro de comportamiento y la caja de la cámara están separadas por una ventana de cristal para un mejor control de la temperatura de la caja de comportamiento (ver las figuras 1 y 2 para más detalles).
6. Conectar la cámara CCD de infrarrojos a un adaptador de cámara. Conecte el adaptador de la cámara a un convertidor de USB. Conectar el convertidor de USB a un puerto USB del ordenador para la adquisición de datos.
7. Instalar el controlador del convertidor de vídeo en el ordenador de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Opcionalmente, instale el software de procesamiento de imágenes proporcionado por el fabricante del convertidor de vídeo USB para acceder a una gama más amplia de opciones de la cámara y los parámetros de adquisición.
8. Conecte la unidad de aire acondicionado (a través de "salida"En la parte posterior del controlador de temperatura) y la sonda de temperatura (a través de" termopar "en la parte posterior del controlador de temperatura) al controlador de temperatura. Coloque la sonda en la caja de comportamiento.
   Nota: El sistema de control de temperatura en nuestro diseño es capaz de mantener la temperatura de la caja entre 18 ° C y 30 ° C. Temperaturas ambiente altas o más bajas podrían ser útiles para thermogenetic (dTRPA1, TRPM8 o shibire ^ts) experimentos para manipular la actividad neuronal o inhibir la transmisión sináptica. Para la mayoría de los experimentos, la temperatura se mantiene a 25 ° C.
9. Montar el sistema de suministro de olor en los siguientes pasos (ver Figura 1B para esquemas detallados y accesorios de conexión):
   1. Utilice el regulador de presión de aire para controlar la entrada de aire del sistema de aire central. Conectar un filtro de aire de carbono (lleno de carbón vegetal) al regulador de presión para purificar el aire de la central de unasistema de IR.
   2. Montar el sistema de control de flujo que consta de múltiples canales regulados por los tubos del medidor de caudal de alta resolución.
   3. Conectar la salida del filtro de aire de carbono a los tubos del medidor de caudal a través de un colector tal como se muestra en la Figura 1B y 2F. Dirigir la salida de los tubos del medidor de caudal a través de válvulas de solenoide de 3 vías con control electrónico para regular si el aire limpio dejando a los medidores de flujo es expulsado a la habitación o entró en cámaras de olor a la medida ^24.
   4. Instalar el controlador de la válvula solenoide de acuerdo con el manual del fabricante.
10. Instalar el medidor de flujo de aire electrónico mediante la conexión a un dispositivo de adquisición de datos (DAQ) y una fuente de alimentación de acuerdo con el manual del fabricante. Instalar el software de interfaz de adquisición de datos para verificar caudales iguales en cada cuadrante de la arena antes de cada experimento.

2. Preparación olfativa Estímulos

1. Preparar 5 olorcámaras de hormigas ²⁴ que constan de un recipiente exterior de plástico, vidrio recipiente interior, una tapa de PTFE de inserción a medida, tapa del recipiente original con parte central retirados, y dos válvulas unidireccionales.
   Nota: Una junta tórica alrededor de la tapa PTFE podría ser utilizado para prevenir la fuga de aire desde la cámara de olor durante la perfusión olor. En la figura 1 esquemática y la Figura 2 para las fotos de las cámaras.
2. Utilice cuatro cámaras de olor para controles de disolvente, y una cámara para un odorante prueba. Llenar los recipientes de vidrio con 1.000 l de dilución de disolvente o odorante (prueba de olores + disolventes apropiados, mezclar bien antes de los experimentos), coloque el recipiente de vidrio dentro de la cámara de plástico correspondiente (no se derrame el líquido en la cámara de plástico) y apretar la tapa . Asegúrese de utilizar siempre una cámara limpia para el odorante de ensayo y controles de disolvente.
   Nota: atracción olfativa puede ser desencadenada por la dilución 1/16 de vinagre de manzana (5% de acidez) en water. Por el contrario, el comportamiento de repulsión olfativo puede estudiarse mediante el uso de una dilución de 10% de propionato de etilo en aceite mineral. estímulos de control en estos casos son cámaras de olor con aceite mineral puro.

3. Preparación de la mosca

1. Posterior vuela en medio de harina de maíz. Coloca 30 masculinos y 30 femeninos en las moscas de los padres de una botella estándar, y dejar que ellos ponen sus huevos durante 5 días a 25 ° C o temperatura ambiente.
2. Para cada experimento, recoja recién eclosed (<1 día de edad) 25 masculinos y 25 moscas hembra bajo breves CO ₂ anestesia.
3. Mantener las moscas en un vial con medio mosca estándar durante 2-4 días.
4. 40-42 h antes del experimento, transferir las moscas sin CO ₂ anestesia   a un vial con ~ gel de agarosa 10 ml 1%. Esto evitará que las moscas humidificados sin alimentos, lo que ayuda a aumentar su actividad locomotora.
   Nota: Más del 90% de las moscas debe sobrevivir a la hambruna. Algunos genotipos son menos curartu y no puede hacerlo a través de un hambre de 40 horas. En esos casos, los períodos más cortos como 24 a 28 hr son aceptables, pero deben mantenerse el mismo para todas las condiciones experimentales y repeticiones.

4. respuestas de comportamiento a atractivos y repelente Odorantes

1. Encienda el controlador de temperatura y ponerlo a 25 ° C.
2. Conectar las cámaras de olor (odorizantes control y de prueba) mediante la inserción del tubo a la salida de la cámara de odorizante y para el push-to-accesorio de conexión en el cuadro de comportamiento.
3. Compruebe la velocidad de flujo en cada cuadrante usando el metro de flujo de aire para asegurarse de que el control y corrientes de aire de olor son igual a 100 ml / min.
4. Limpiar la arena mosca PTFE y las placas de vidrio, con un 70% de etanol 2-3 veces y permitir que se dispone de aire seco (~ 3-4 min).
5. Colocar las placas de vidrio a la arena con pinzas.
6. Transferencia vuela sin anestesia _de CO ₂ a la arena a través del agujero en una de las placas de vidrio. En popaer la transferencia, coloque una malla circular en el agujero para evitar que las moscas escapen.
   Nota: CO ₂ anestesia se ha demostrado que afecta el comportamiento de Drosophila ²⁵ y no debe ser usado dentro de las 24 horas de un experimento conductual.
7. Coloque la arena con las moscas en la cámara hermética a la luz, conectar las cuatro corrientes de aire de control conectando el tubo conectado a la conexión en la caja de la conducta de las esquinas de la arena push-to-connect, cierre la puerta de la cámara y esperar 10- 15 minutos para dejar que las moscas aclimatarse al nuevo ambiente. Si es posible, apagar las luces en la sala donde se realizan los experimentos, para evitar posibles fugas de luz mínima que puede sesgar los resultados experimentales.
8. Ejecutar un experimento de control 5-10 minutos, en los que las moscas están expuestos a corrientes de aire 4 de control.
9. Analizar los datos inmediatamente (ver sección de análisis de datos más adelante) para asegurarse de que las moscas se distribuyen uniformemente en la arena, y la atracción Índice está cercaa 0. Este paso es esencial, ya que verifica que no hay fuentes no controladas de preferencia o evitación dentro de la arena (por ejemplo, la luz se escapa desde el exterior, la distribución desigual de la temperatura, arena desigual, la contaminación de olores, etc.). Si las moscas se distribuyen de manera desigual o de su actividad locomotora es baja, desechar las moscas, limpiar la arena de nuevo (paso 4.4) y utilizar un nuevo lote de moscas para repetir el experimento.
10. Conectar la cámara de odorizante de prueba a la configuración mediante el encendido de las válvulas de 3 vías y de volver a conectar los tubos conectores.
11. Ejecutar experimento de prueba durante 5-10 minutos y analizar los datos como se discutió en la sección 5 (véase también referencia 14 y la Figura 3). Grabaciones de más de 20 minutos puede resultar en archivos de datos que pueden ser difíciles de procesar computacionalmente. Si se desean grabaciones experimentales más tiempo, rápidamente detener y volver a iniciar el programa de seguimiento. Esto resulta en una brecha sec ~ 10 entre grabaciones experimentales.
12. Discarmoscas d.
13. placas de vidrio de la arena y limpias, con un 70% de etanol (paso 4.4), y reemplazan tubos conectores dentro del recinto hermético a la luz. Para acelerar los experimentos, una nueva arena limpia se puede utilizar, y la arena sucia limpiar el desempeño de corridas experimentales.
14. Ejecutar otro experimento con un nuevo lote de moscas, si es necesario. Si varios experimentos se realizan en el mismo día, tener un cuidado extremo para asegurarse de que ningún odorante se deja en el sistema a partir de una prueba de funcionamiento anterior. Esto normalmente no es un problema con bajas concentraciones de sustancias olorosas o con CO _2, pero puede ser necesaria para los estímulos altamente concentrados hasta una brecha de 24 horas entre las corridas experimentales. Además, todos los tubos de flujo después de que los tubos se puede reemplazar si se sospecha de contaminación odorizante durante los experimentos de control. Siempre deje el aire seco entre en los experimentos para limpiar continuamente el sistema de

Análisis 5. Datos

Nota: El softwar adquisición de seguimiento mosca sugeridoe (se detalla en Materiales), pistas de moscas en tiempo real durante la adquisición, y guarda el sello de tiempo y coordenadas de todas las moscas detectadas en formato * .dat. Hemos desarrollado una rutina de Matlab a medida para convertir los datos en un formato de Matlab, y para analizar los datos. Los ejemplos de código se proporcionan en Materiales complementarios, pero los detalles de aplicación dependerán del software utilizado para la adquisición de datos.

1. Cargar los datos en bruto. Crear una máscara espacial que sigue el contorno de la arena y aplicar la máscara a los datos en bruto para eliminar todos los puntos de datos que caen fuera de la arena, ya que representan el ruido (Figura 4A, Código suplementario MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask. metro).
2. Eliminar todos los puntos de datos que se mueven a una velocidad inferior a 0.163 cm / s durante más de 3 segundos, como estos datos es probable que sea el ruido o generada por las moscas sin movimiento (Figura 4B, Código suplementario TemporalFiltering.m).
3. Visualizar los datos restantespuntos trazándolos todos a la vez o como trayectorias individuales (Figura 3, Código suplementario SingleTrajectoryViewer.m).
   Nota: La ubicación de los límites de olor en el campo de cuatro probablemente depende de una serie de factores, como las características de cada odorante y las tasas de flujo de aire que se utiliza. Por ejemplo, los odorantes fácilmente volátiles probablemente llenar el cuadrante olor más plenamente que odorantes menos volátiles. Así, es probable que cada odorante puede exhibir ligeramente diferentes límites de olor. El uso de un detector de fotoionización para medir los límites de olor puede ser problemático, ya que utiliza un vacío para muestra de aire a partir de un punto en particular, y por lo tanto altera la concentración de olor en ese punto. Sin embargo, los límites de olor se pueden estimar rápidamente sobre la base de datos de comportamiento de la mosca. Por ejemplo, un límite de olor basado en pistas de moscas acumulados en respuesta a diferentes olores se puede observar claramente en las figuras 3C y 3D.
4. Californiacular un índice de atracción para determinar si los experimentos de control no generan respuesta preferencia, y también para acceder a la respuesta a un odorante (o optogenético ⁹⁾ estímulo. Para calcular un Índice de atracción (AI), utilice los últimos 5 minutos de un control o grabación de prueba. Para obtener una medida de la atracción que cae entre 1 (atracción absoluta) y -1 (repulsión absoluta), la siguiente fórmula se usa para calcular el AI:
   
   donde _prueba N es el número de puntos de datos en el cuadrante de prueba, _control N es el número promedio de puntos de datos en los tres cuadrantes de control. Esta medida es intuitivo como ninguna preferencia estaría indicada por valores cercanos a cero. Sin embargo, no indica correctamente la proporción del número total de moscas que se encuentran en el cuadrante odorante. Para obtener esta medida, un Índice de Porcentaje (PI) se puede utilizar:
   
   donde _prueba N es el número de puntos de datos en el cuadrante de ensayo, y N _total es el número total de puntos de datos en los cuatro cuadrantes. Esta fórmula proporciona una medida que cae entre 0 y 1, con 0,25 correspondiente a ninguna preferencia de comportamiento (Figura 3E y 4C, Código suplementario AttractionIndex.m).
5. Ejecutar 5-10 repeticiones de cada condición experimental, el uso de un nuevo grupo de moscas para cada repetición. Comparación de los índices de atracción entre las condiciones o en contra de los controles mediante la prueba no paramétrica de Kolmogorov-Smirnov (Figura 3F, la función kstest2 en Matlab).

Los cuatro cuadrantes olfactometer registros de ensayo y análisis de las actividades de senderismo de muchas moscas sobre un espacio de comportamiento grande. Odorantes pueden introducirse en los acondicionadores de corrientes de entrada de uno, dos, tres, o los cuatro cuadrantes. En ausencia de olores, las moscas se mueven libremente entre los cuatro cuadrantes. Este comportamiento es crucial para observar ya que indica que los sesgos no intencionales no se han introducido en el ensayo. Estos sesgos pueden incluir la luz, las fluctuaciones de temperatura, las diferencias en el flujo de aire, o contaminantes de olor. La Figura 3B muestra las respuestas de comportamiento en el olfatómetro de cuatro cuadrantes de 25 masculinos y 25 moscas hembra al aire seco. Una sola mosca de la pista de los datos recogidos también se pone de relieve en la Figura 3B, y demuestra que esta mosca estaba explorando todo el ámbito del comportamiento. El resultado del índice de atracción (AI) para todas las pistas analizadas durante el período de prueba de 5 minutos se encuentra cerca de 0, indicating una falta de atracción hacia el cuadrante olor. Del mismo modo, el índice de porcentaje (PI) del experimento es 0,24, lo que indica que las moscas se distribuyeron bastante uniforme en todos los cuatro cuadrantes durante el período de prueba de 5 min.

La respuesta de comportamiento de cuatro campos de un odorante atractivo se muestra en la Figura 3C. El vinagre de manzana se introduce en la corriente de aire de   parte superior izquierda olor cuadrante corriente de aire mediante la colocación de una dilución 6.25% de vinagre de sidra de manzana en la cámara de olor prueba. Las pistas de moscas recogidas se muestran en gris demuestran que la mayoría de las moscas se acumulan en este cuadrante olor, y ya no explorar los cuatro cuadrantes. Una pista mosca de color único se desprende que una vez que una mosca entra en el vinagre de manzana olor cuadrantes, tiende a permanecer en el cuadrante atractivo olor. La IA de 0,94 para el experimento es cercano a 1 indica una fuerte atracción a este odorizante. El PI de 0,92 indica que 92% de las moscas remained en el cuadrante de olor durante el período de análisis.

La respuesta de comportamiento de cuatro campos a un odorante repelente se muestra en la figura 3D. Una dilución de 10% de la propionato de etilo odorante colocado en una cámara de olor se utilizó como la fuente de olor para la corriente de aire superior izquierda. Las pistas de la mosca se congregaron para el experimento analizado demuestran la evitación del cuadrante olor, el olor sugerente de repulsión guiada. Una pista mosca de color único se desprende que una mosca, cuando entró en el cuadrante olor, rápidamente se dio la vuelta para evitar el cuadrante olor. La IA de -0.68 es menor que 0, lo que indica la repulsión, y está cerca de -1, lo que indica una fuerte respuesta de olor repulsivo. El PI de 0,06 para el experimento sugiere que sólo el 6% (en comparación con ~ 25% en los experimentos de olor neutro) de los puntos de datos de la mosca de orugas se encontraron en el cuadrante de olor durante el transcurso del experimento.

Un índice atracción es la métrica más ampliamente utilizado para el análisis de los datos olfativos, ya que permite puntuaciones superiores a 0 para indicar atracción (positivo) y anota inferior a 0 para indicar la repulsión (negativo). Cuanto más cerca de la puntuación es de +1 o -1, más fuerte será la atracción o repulsión a ese olor, respectivamente. Como se describió anteriormente, esta métrica no puede indicar claramente el porcentaje o proporción de moscas rastreado al cuadrante olor durante el transcurso del experimento. En este caso, un índice de porcentaje puede ser más informativo. Figura 3E diagramas de la relación entre la IA y anota PI, y cómo estos números se refieren a los comportamientos de atracción o repulsión.

El ensayo de cuatro campos se traduce en comportamientos olfativas robustos y reproducibles. Esto permite comparaciones cuantitativas entre el control y las condiciones experimentales como se muestra en la Figura 3F, y también permite la identificación de olfactor sutilY las respuestas que se desvían de la neutralidad.

Además, como se obtienen los datos a alta resolución espacial y temporal, es posible estudiar numerosos factores de respuestas de comportamiento, tales como trayectorias de moscas individuales (como se muestra en la Figura 3), así como caracterizar diferentes dinámicas de actividad de las moscas en un campo de olor (por ejemplo, cambios de dirección y la velocidad ^19,20).

A menudo puede ser difícil colocar la arena de cuatro campos en la misma ubicación exacta para cada experimento, sobre todo porque se requiere una limpieza frecuente de la arena. El análisis proporcionado guiones compensar estas ligeras variaciones ajustando primero los datos como se muestra en la Figura 4A. En este caso, la forma de la arena de cuatro campos se calcula, y los puntos de datos que caen fuera de este espacio se eliminan. Estos objetos rastreados a menudo representan debris o reflexiones que son seguidos por error. Como no se encuentran dentro de la arena y por lo tanto representan el ruido, es importante que estos puntos de datos se eliminan para evitar errónea análisis de datos. Del mismo modo, también es importante eliminar los puntos de datos de orugas que pueden representar el ruido o las moscas que no se mueve dentro de la arena. Para lograr esto, se utiliza una secuencia de comandos de análisis (y proporcionado aquí) que elimina los puntos de datos que, esencialmente, no se mueven (como se muestra en la Figura 4B). Estos puntos de datos son por lo general en la minoría, sin embargo, su retención daría lugar a errores en los análisis.

Índice de atracción para marcar un índice de preferencia se pueden calcular después de un periodo de tiempo determinado (por ejemplo, al final de un experimento de 5 min, como se muestra en la Figura 3). Cabe señalar, sin embargo, que, dado que las moscas se realiza un seguimiento con una alta resolución espacial y temporal, análisis similares se podrían realizar durante todo el experimento. Esto esse muestra en la Figura 4C en la que las puntuaciones del Índice de la atracción y el índice de porcentaje se calculan en contenedores de 10 segundos continuos a lo largo del periodo de tiempo. Este tipo de análisis permite una mejor apreciación de los cambios olfativos que pueden ocurrir durante todo el experimento, como la habituación a un odorante.

Figura 1:. Esquemática del olfatómetro de cuatro cuadrantes (A) La configuración de comportamiento se compone de un sistema de suministro de olor, sistema de control de temperatura (no diagramado), sistema de adquisición de imagen (IR luces y la cámara CCD IR conectados a un ordenador LED), Arena de cuatro cuadrantes y el comportamiento de la arena y cajas estancas a la luz. Los círculos rojos designan los componentes correspondientes que se muestran en la figura 2. (B) El diseño detallado del sistema de suministro de olor. Los caracteres verdes representan los tamaños de conexión / conversión de fittings. Tubos de 1/16 y 1/8 ID OD están marcados en amarillo mientras que las de 1/8 y 1/4 ID OD están marcados en color rosa. Abreviaturas: IR, infrarrojo; CF, Acoplamiento de compresión; BF, púas de montaje, MNPT, Hombre National Pipe Thread. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2:. Fotos de la instalación de ensayo olfativo (A) Vista de campo amplio de la caja de la cámara y la caja de comportamiento. (B) Vista interior de la caja de la conducta. La sonda de temperatura, tubos conectores, y las matrices de LED IR están etiquetados. (C) Arena de cuatro cuadrantes. (D) vista de campo amplio del sistema de suministro de olor conectado a la caja de comportamiento. La caja de la cámara ha sido retirado para revelar la cámara CCD. (E ) de aire central se pasa primero a través de un regulador de presión y luego a través de un filtro de carbón. (F) Ejemplo de los tubos de olor conectados al colector. (G) tubos de flujo de alta resolución a regular el flujo de aire. (H) El tubo de suministro de olor y conectores de aguas abajo de los reguladores del tubo de caudal. (I) Las válvulas de solenoide regulan si el aire limpio se hace pasar a través de una cámara de olor o expulsado a la habitación. Cámaras (J) El olor se conectan a las válvulas de un solo sentido, y contienen un recipiente de vidrio interior para el odorante. (K) La caja contiene accesorios comportamiento fuera de push-to-connect que se conectan al tubo de suministro de olor. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Ejemplo datos generados usando un ensayo olfativo de cuatro campos (A) Esquema de la arena de cuatro campos.. Se observan (B) las respuestas neutrales cuando los cuatro cuadrantes contienen sólo la perfusión aire seco. Respuestas (C) Atracción a una dilución de 6.25% de vinagre de sidra de manzana perfundido desde el cuadrante superior izquierdo. Comportamientos (D) Repulsión desencadenados por 10% propionato de etilo. En la Figura 2B-2D, una única trayectoria de los datos adquiridos se representa. Un gradiente de color se utiliza para significar el curso del tiempo de la grabación, con los colores azul y rojo que es el inicio y el final de las grabaciones, respectivamente. (E) Comparación del Índice de atracción (AI) y el porcentaje de índice (PI). (F) Promedio de AI de 3- 6 experimentos con ningún olor (Control), vinagre de manzana (ACV) y 10% de propionato de etilo (EP). Las barras de error indican SEM. La diferencia estadística se evaluó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov test. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4:. Ejemplo datos generados por el análisis de datos Pasos (A) El filtrado espacial de los datos, realizados por MaskSpatialFiltering.m para eliminar los puntos de datos que caen fuera de la arena. Los círculos rojos muestran las posiciones iniciales de los círculos que se utilizan para definir las fronteras de la arena. Los círculos negros son las posiciones finales, adquiridas mediante el ajuste del círculo contornos de los datos (área gris en el interior del campo de cuatro). Los puntos rojos y puntas de flecha negras indican los puntos de datos que se van a eliminar del conjunto de datos después de esta etapa de filtrado. (B) de filtrado temporal de los datos, realizado por TemporalFiltering.m. Esta etapa de filtración elimina los puntos de datos que se mueven muy sloWLY o nada en absoluto, ya que es probable que se generen por las moscas sin movimiento o por la suciedad / reflexiones de la arena. Un punto rojo rodeado de una caja roja discontinua indica las posiciones de ~ 6.000 puntos de datos con coordenadas idénticas que se eliminarán por esta etapa de filtrado. Índice (C) de atracción (AI) y el Índice de Porcentaje (PI), calculado en contenedores de 10 segundos en los últimos 5 minutos de un experimento realizado por AttractionIndex.m. Perfiles temporales de estos índices contienen información sobre la dinámica de las respuestas de comportamiento y pueden ser utilizados para el análisis detallado de las conductas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El olfatómetro de cuatro campos se describe aquí es un sistema de comportamiento versátil para el estudio de las respuestas olfativas de grandes poblaciones de tipo salvaje y mutante moscas Drosophila. Cada experimento tiene ~ 1 hr (incluida la instalación, corridas experimentales, y limpieza), y 4-6 experimentos se puede realizar de forma rutinaria cada día. Un ensayo típico usando 40-50 moscas durante 5 minutos genera aproximadamente 450.000 puntos de datos rastreados para su análisis. La configuración descrita también puede ser utilizado, con modificaciones menores, para vigilar los movimientos de otros insectos o larvas de insectos en respuesta a olfativo u otros estímulos sensoriales durante un período de tiempo, que van desde min a día. El ensayo de cuatro cuadrantes es sensible a los efectos de ambos estímulos de atracción y repulsión. La mayoría de los odorantes generan índices de atracción (AI) entre -0.9 y +0.9 (Ecuación 1). Una IA en el rango de +0,5 a la +1 significa fuerte comportamiento de atracción de las moscas a los estímulos, mientras que la IA en el rango entre -0,5 y -1 esprovocada por los repelentes fuertes. En general, una respuesta neutral por olores de control (aire seco, aire humidificado, aceite mineral) debe estar entre 0,1 y -0,1. La IA a menudo cambia a lo largo del curso del experimento de prueba, lo que refleja el tiempo moscas requieren para caminar en los penachos de olor, la atracción inicial y aumento de la actividad locomotora hacia un estímulo nuevo, y la eventual desensibilización en respuesta al estímulo. control se ejecuta antes de la prueba son esenciales y deben realizarse con cuidado para asegurar que las moscas se distribuyeron uniformemente en la arena en ausencia del estímulo deseado.

La mayoría de las causas frecuentes de sesgo espacial de las moscas de la arena son: flujos irregulares de aire, posiblemente debido a la tubería desconectada o placas de vidrio inadecuadamente sujetos al suelo de la arena en forma de estrella (en nuestra experiencia, las moscas son capaces de detectar diferencias de flujo de aire de tan sólo 15 ml / min); la distribución desigual de la temperatura a través de la arena, que puede ser mejorado mediante el establecimiento de laaire de la unidad de aire para generar más débil y más difusa flujo de aire y / o el período de pre-adquisición más largo (~ 20 min) para asegurar una temperatura de la arena; las fugas de luz mínima a través de la abertura de la sonda de temperatura, que puede ser reducido por sellar la abertura con cinta negro; olor residual en la arena o en el sistema de suministro de aire, en cuyo caso (arena, tubos de caudal, accesorios del recinto hermético a la luz, etc) necesitan ser limpiados a fondo y se deja secar durante varios días o sustituidos cuando sea posible la instalación.

Mantenimiento del equipo olfativa es importante para obtener resultados fiables y consistentes. Push-to-accesorios de conexión en el cuadro de comportamiento y las entradas de aire y las paredes interiores de la arena se debe limpiar con etanol después de cada experimento, si se utilizan los olores fuertes, y se deja secar completamente. Las placas de vidrio se deben lavar tres veces con un 70% de etanol, que es generalmente suficiente para eliminar el olor residual y la suciedad de las placas, pero es útil hexanoen la eliminación de compuesto orgánico depositado por las moscas (por ejemplo, las feromonas que consiste en cadenas de hidrocarburos largas). En general no se recomienda el jabón, ya que por lo general contiene componentes aromáticos, que afectarían comportamientos olfativas. El cuadro de comportamiento debe permanecer conectado a las entradas de aire seco entre experimentos (por ejemplo, durante la noche) para facilitar la eliminación de los olores residuales del sistema.

Si la actividad locomotora de las moscas es baja, es posible que generan muy pocos puntos de datos, que a menudo resulta en un índice de atracción ruidoso y variable. Más largos tiempos de hambre y grabación pueden ayudar a resolver este problema. Por el contrario, si las moscas están enfermos, 24-28 h de inanición en general, sería suficiente para mejorar la actividad de locomoción, siempre que es constante a través de experimentos. Hay un delicado equilibrio entre el mantenimiento de un estado saludable de las moscas y el aumento de la locomoción. 40 inanición hr se puede utilizar como punto de partida, y más tarde modificado comosea ​​necesario sobre la base de los resultados experimentales. Índices de atracción será un poco afectados por la duración de hambre, por lo que es esencial para matar de hambre a todos los animales de experimentación para el mismo período de tiempo con el fin de evitar efectos de confusión de tiempo de inanición. tiempos más largos de hambre por lo general permiten una reacción de repulsión más débil (más cercano a 0), y las respuestas atractivos más fuertes. corrientes de aire de control de aire seco tienden a desecar las moscas, y no deben ser usados ​​por más de 40 minutos.

El olfatómetro de cuatro cuadrantes se puede utilizar para estudiar las respuestas de solo ^16,18 o múltiples moscas a un único estímulo o para estudiar preferencia elección entre estímulos. Por ejemplo, diferentes olores podrían ser utilizadas en cada uno de los cuatro cuadrantes. Esto también podría ser usado para determinar las respuestas a olor mezclas mediante el examen de los límites de los olores-cuadrantes. Cabe señalar que a pesar de que el sistema de seguimiento permite que las pistas individuales a ser aislados a partir de los datos recogidos, esposible que las moscas individuales pueden comportarse de manera diferente cuando se ensaya como parte de un grupo que cuando se prueban solos. Por ejemplo, grupos de moscas presentan una mayor repulsión olor guiada debido a las interacciones físicas entre las moscas ^26. El sistema de seguimiento y el diseño también se pueden adaptar para uso en ensayos no olfativas. El marco ensayo puede acomodar fácilmente una matriz de LED ⁹ para la estimulación optogenética, o una placa térmica ²⁷ para thermogenetics. El sistema también puede adaptarse para estudiar las opciones de comportamiento de una escala de tiempo de muchas horas, por ejemplo para estudiar el comportamiento de la puesta de huevos ^14. En este caso, la velocidad de fotogramas de adquisición debe ser ajustado para evitar la generación de grandes archivos de datos, y una fuente de humedad y sustrato (1% en gel de agarosa) necesita ser proporcionado como sustrato de puesta de huevos.

Una limitación de esta configuración es que las moscas son rastreados como objetos reflectante de IR en y debajo de la Arena, si cualquier elemento de un optogenético oexperimento thermogenetic refleja IR, tendrá que ser retirado durante el post-procesamiento de los puntos de datos irrelevantes. Actualmente, tampoco es posible filmar moscas con una resolución espacial que permite a los diferentes moscas sean distinguibles de forma continua, pero esto puede ser mejorado en el futuro mediante el uso de cámaras de vídeo más avanzados. Otra de las limitaciones del sistema actual es que el movimiento de las moscas se ve limitada a dos dimensiones para promover comportamientos para caminar, y evitará que las respuestas de vuelo olfativas-inducida.

Cabe señalar que los análisis automatizados adicionales también se han desarrollado para investigar los comportamientos olfativas de solo o grupos de moscas. El diseño más similar al ensayo descrito aquí es un método desarrollado por Beshel y Zhong ^28. En este ensayo, las respuestas de ~ 30 moscas son monitoreados en una pequeña pista circular (aproximadamente un cuarto de la superficie de la arena de cuatro campos) en la que los olores se entregan a partir del 1 de 4 puertos de olor a lo largo del campo de WAll, y se retira a través de un agujero en el centro de la pista circular. Además de un escenario más pequeño, otras diferencias de diseño incluyen comportamientos se realizaron bajo condiciones de luz, y odorantes principalmente concentrarse cerca de los puertos de olor (en lugar de en todo el cuadrante odorante según las indicaciones de las paredes arrugadas de la arena de cuatro campos). Sin embargo, la arena circular es un método adecuado para la detección de respuestas olfativas de las moscas, y podría ser adaptada al diseño del seguimiento de mosca se describe aquí.

Un enfoque alternativo es supervisar simultáneamente la actividad de muchas moscas individuales en respuesta a los olores. En el ensayo de Flywalk, moscas individuales se colocan en tubos pequeños, y sus respuestas seguido cuando odorantes son perfundidos a través del tubo ^29,30. Los cambios en la dirección de avance o de retroceso, o cambios en las velocidades, se pueden utilizar para evaluar si un odorante es generalmente de atracción o repulsión. Este ensayo, al igual que el ensayo de cuatro campos, un seguimiento automático de mosca movements, y por lo tanto se puede utilizar para medir rápidamente las respuestas olfativas a una amplia gama de olores. Sin embargo, a diferencia de los cuatro campos, la dinámica de motores complejos, tales como ángulos de trayectoria girando y posibles interacciones sociales, tal vez se perdió en la grabación de ensayo Flywalk.

El seguimiento automático de las moscas individuales para caminar también se ha adaptado a un ensayo de tipo laberinto en T ^31,32. En este ensayo, las moscas se colocan en pequeñas cámaras en las que los olores son perfundidos desde cualquier extremo de la cámara, y la salida a través de un puerto en el centro de la cámara. Las posiciones de las moscas también se registran automáticamente. Esto imita, en una escala única mosca, un marco T-laberinto. En combinación con la optogenética, este ensayo ha sido particularmente bien adaptado para el ensayo de los circuitos neuronales que median el aprendizaje y la memoria olfativa, y también puede ser utilizado para medir las preferencias olfativas de las moscas individuales. Similar a Flywalk, no puede controlar la dinámica de la actividad del complejo que pudieran ocurrir sobre áreas espaciales mayores, Tales como los que ocurren durante o comportamientos de búsqueda de ¹⁴ alimentos que se producen sólo en las poblaciones de moscas.

The authors declare that they have no competing financial interests.

We thank Terry Shelley for manufacturing the fly arena and the light-tight enclosure, Liz Marr for help with fly stock maintenance, and Xiaojing Gao and Junjie Luo for help with the Matlab code used for data analysis. We thank Johan Lundström at the Monell Chemical Senses Center for demonstrating his odor delivery setup. This work was supported by grants from the Whitehall Foundation (CJP) and NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).