Propriedades eletroativo Polymer Nanopartículas Exhibiting fototérmicos

A protocol is presented for the synthesis and preparation of nanoparticles consisting of electroactive polymers.

A method for the synthesis of electroactive polymers is demonstrated, starting with the synthesis of extended conjugation monomers using a three-step process that finishes with Negishi coupling. Negishi coupling is a cross-coupling process in which a chemical precursor is first lithiated, followed by transmetallation with ZnCl₂. The resultant organozinc compound can be coupled to a dibrominated aromatic precursor to give the conjugated monomer. Polymer films can be prepared via electropolymerization of the monomer and characterized using cyclic voltammetry and ultraviolet-visible-near infrared (UV-Vis-NIR) spectroscopy. Nanoparticles (NPs) are prepared via emulsion polymerization of the monomer using a two-surfactant system to yield an aqueous dispersion of the polymer NPs. The NPs are characterized using dynamic light scattering, electron microscopy, and UV-Vis-NIR-spectroscopy. Cytocompatibility of NPs is investigated using the cell viability assay. Finally, the NP suspensions are irradiated with a NIR laser to determine their effectiveness as potential materials for photothermal therapy (PTT).

Polímeros electroactivos alterar as suas propriedades (cor, condutividade, reactividade, de volume, etc.) na presença de um campo eléctrico. Os tempos de comutação rápidos, tunability, durabilidade e características de polímeros eletroativos leves têm levado a muitas aplicações propostas, incluindo energia alternativa, sensores, eletrocrômicos e dispositivos biomédicos. Polímeros eletroativos são potencialmente úteis como, de peso leve e bateria de condensadores eletrodos flexíveis. ^{1º Os pedidos} de polímeros eletroativos em dispositivos electrocrómicos incluem sistemas de redução de brilho-de edifícios e automóveis, óculos de sol, óculos de proteção, dispositivos de armazenamento ópticos, e têxteis inteligentes. ^2-5 janelas inteligentes podem reduzir as necessidades energéticas através do bloqueio de comprimentos de onda específicos de luz on-demand e proteger interiores de casas e automóveis. Têxteis inteligentes pode ser usado em roupas para ajudar a proteger contra a radiação UV. ⁶ polímeros eletroativos ter alsO começaram a ser utilizados em dispositivos médicos. Entre os polímeros electroactivos utilizados em dispositivos biomédicos, polipirrol (PPy), polianilina (PANI), e poli (3,4-etilenodioxitiofeno) (PEDOT) estão entre os mais comuns. Por exemplo, esses tipos de polímeros são normalmente utilizados como transdutores em dispositivos biossensores ⁷ Aplicações em administração terapêutica também mostraram-se promissoras.; Estudos demonstraram a libertação de fármacos e proteínas terapêuticas a partir de dispositivos preparados a partir de polímeros electroactivos ^8-12. Mais recentemente, polímeros electroactivos têm sido utilizados como agentes terapêuticos em terapia fototérmico. ^13-15 Em terapia fototérmico, agentes fototérmicas deve absorver a luz no próximo -infrared (NIR) região (~ 700-900 nm), também conhecida como a janela terapêutica, em que a luz tem a profundidade máxima de penetração no tecido, tipicamente até 1 cm. ^16,17 Neste intervalo, cromóforos biológicos, tais como a hemoglobina , oxigenado hemoglobina, lípidos e água têm pouco ou nenhumabsorção, o que permite que a luz penetre facilmente. Quando os agentes fototérmicas absorvem a luz nesta janela terapêutica, o fotoenergia é convertida em energia fototérmico.

Irvin e colaboradores tenham relatado anteriormente bis-eDOT monómeros de benzeno que foram sintetizados utilizando o acoplamento de Negishi alcoxi-substituído. ¹⁸ acoplamento de Negishi é um método preferido para a formação da ligação carbono-carbono. Este processo tem muitas vantagens, incluindo o uso de intermediários de organozinco, que são menos tóxicos e tendem a ter uma maior reactividade do que outros compostos organometálicos utilizados. ^19,20 compostos de organozinco também são compatíveis com uma vasta gama de grupos funcionais sobre os organohalides. ²⁰ No reacção de acoplamento de Negishi, um organohalide organometálico e estão acoplados através da utilização de um catalisador de paládio (0) como catalisador. ²⁰ No trabalho aqui apresentado, este método de acoplamento cruzado é utilizado na síntese de 1,4-dialcoxi-2,5-bis ( 3,4-ethylenedioxythienyl) Benzemonômeros ne ₍₂ Bedot-B (OR)). Estes monómeros podem então ser facilmente polimerizado electroquimicamente ou quimicamente para produzir polímeros que são candidatos promissores para utilização em aplicações biomédicas.

Os métodos convencionais para a preparação de suspensões poliméricas coloidais em soluções aquosas para aplicações biomédicas envolvem tipicamente a dissolução de polímeros granel seguido por técnicas de evaporação de emulsão ou nanoprecipitação-solvente ^21,22. De modo a produzir nanopartículas de poli (Bedot-B (OU) ₂₎ , uma abordagem bottom-up é demonstrado aqui, onde os PN são sintetizados através de polimerização em emulsão situ. Polimerização em emulsão é um processo que é facilmente escaláveis ​​e é um método relativamente rápido para a preparação NP. ²² Estudos utilizando polimerização em emulsão para produzir NPs de outros polímeros electroactivos têm sido relatados para PPy e PEDOT. ^15,23,24 PEDOT NPs, por exemplo, foram preparadas usando emulsão de pulverização polymerization. ²⁴ Este método é difícil de reproduzir, e, normalmente, produz partículas micronizadas maiores. O protocolo descrito neste artigo explora a utilização de um método de drop-sonicação para preparar reprodutivelmente NPs de polímero de 100 nm.

Neste protocolo, polímeros eletroativos adaptado para absorver a luz na região do NIR semelhante ao poli relatado anteriormente (Bedot-B (OR) ₂₎ são sintetizados e caracterizados para demonstrar o seu potencial em dispositivos electrocrómicos e como agentes de PPF. Em primeiro lugar, o protocolo para a síntese dos monómeros de acoplamento de Negishi via é descrita. Os monómeros são caracterizados por RMN e espectroscopia de UV-Vis-NIR. A preparação de suspensões coloidais NP através de polimerização em emulsão em meios aquosos oxidativo também é descrito. O procedimento baseia-se num processo de polimerização por emulsão em dois passos anteriormente descrito por Han et al., Que é aplicado aos diferentes monómeros. Um sistema de dois surfactante éutilizado para controlar a monodispersity NP. Um ensaio de viabilidade celular é utilizada para avaliar citocompatibilidade das NPs. Por último, o potencial destes NPS para actuar como transdutores de PTT é demonstrada por irradiação com um laser NIR.

Atenção: Por favor, consulte todas as fichas de segurança pertinentes (SDS) antes do uso. Vários dos reagentes utilizados nestas sínteses são potencialmente perigosa. Utilize todas as práticas de segurança adequadas, incluindo equipamento de protecção pessoal (óculos de segurança, luvas, jaleco, calças compridas e sapatos fechados) e realizar sínteses em exaustores. Litiação é particularmente perigoso e só deve ser realizado por pessoas devidamente treinadas com supervisão.

1. Síntese Monomer

Nota: A Figura 1 mostra a via química para a preparação de precursores e de monómeros cuja síntese está descrita nas secções 1.2 - 1.5.

1. Materiais
   1. Purificar eDOT como descrito anteriormente. ²⁵
   2. Recristalizar tetrabutil perclorato de amónio (TBAP) a partir de acetato de etilo e seco sob vácuo durante 24 horas. Titula-se n-butil lítio (n-BuLi, 2,5 M em hexanos) como descrito por Hoye et ai. ^{26 dentro de 48 horas antes de serem utilizados para determinar a concentração real.}
   3. Sulfato de magnésio seco e carbonato de potássio a 100 ° C durante 24 h antes da utilização. Use todos os outros produtos químicos utilizados neste protocolo de recebimento.
2. Síntese de 1,4-Dialkoxybenzenes
   Nota: A Figura 1A mostra a preparação de 1,4-dihexyloxybenzene utilizando 1-bromo-hexano.
   1. Equipar um de três gargalo do balão de fundo redondo, seco no forno com um septo, um adaptador para entrada de árgon, e um condensador equipado com um adaptador de saída de gás ligado a um borbulhador. Adicionar uma barra de agitação ao frasco antes da selagem.
   2. Ligue o adaptador de entrada de uma linha de Schlenk utilizando poli (cloreto de vinilo) (PVC) e tubagem de purgar o balão de fundo redondo com árgon.
   3. Adicionar 12,5 g (113,5 mmol) de hidroquinona para o balão de fundo redondo e dissolvê-lo em 20 ml de tetra-hidrofurano anidro (THF) com agitação.
   4. Separadamente, dissolvem-se 14 g (250 mmol) de KOH em 30 ml de etanol em um único gargalobalão de fundo redondo e mexa até dissolver.
   5. Uma vez dissolvido, adicionar lentamente a solução de KOH a três tubuladuras balão de fundo redondo, utilizando uma seringa. Deixar a mistura a agitar durante 1 h.
   6. Após 1 hora, adicionar 250 mmol de 1-bromo-alcano-se à mistura de reacção.
   7. Aquece-se a mistura de reacção ao refluxo durante 24 horas com agitação sob atmosfera de árgon.
   8. Depois de 24 h, deixar a mistura reaccional arrefecer até à temperatura ambiente e adicionar 15 ml de água Dl e 10 ml de diclorometano.
   9. Transferir a mistura para um funil de separação. Isolar a fase orgânica e lava-se três vezes com 10 ml de água Dl.
   10. Seca-se a camada orgânica sobre 15 g de _MgSO4 durante 15 minutos.
   11. _Remove-se o MgSO4 por meio de filtração sob vácuo através de papel de filtro.
   12. Remover o solvente a partir da solução filtrada utilizando um evaporador rotativo a 50 ° C e 21 kPa, para se obter 1,4-dialkoxybenzene como um sólido branco em bruto.
   13. Recristaliza-se o produto bruto adicionando apenas o suficiente de etanol quentedissolver o produto. Uma vez dissolvido, colocar num banho de gelo para induzir a cristalização.
   14. Recolher os cristais por filtração sob vácuo através de papel de filtro e lava-se com etanol frio.
   15. Secam-se os cristais sob vácuo durante 24 horas à TA e armazená-los, sob árgon, até à sua utilização. Este procedimento produz 1,4-dihexyloxybenzene.
   16. Caracterizar o produto usando ponto de fusão e ^{de 1 H e 13} C espectroscopia de RMN. ²⁷
3. Síntese de 1,4-Dialkoxybenzenes contendo grupos éster
   Nota: A Figura 1B mostra o percurso químico para a preparação de um 1,4-dialkoxybenzene utilizando etil-4-bromobutanoato.
   1. Equipar um de três gargalo do balão de fundo redondo, seco no forno com um septo, um adaptador para entrada de árgon, e um condensador equipado com um adaptador de saída de vidro, ligado a um borbulhador. Adicionar uma barra de agitação ao frasco antes da selagem.
   2. Conecte o adaptador de entrada para a linha de Schlenk utilizando tubos de PVC e purga com árgon.
   3. Pesar 1,88 g (93,5 mmol) de Kl e 15,69 g (93,3 mmol) _de K 2 CO ₃ e adicionar ao frasco de fundo redondo.
   4. Adicionar 25 ml de N, N-dimetilformamida (DMF) e agitar até dissolver os sais.
   5. Uma vez dissolvido, adicionar 2,5 g (18,7 mmol) de hidroquinona à mistura da reacção e permitir que a reacção em agitação até se dissolver.
   6. Quando todos os sólidos estarem dissolvidos, adicionar 46,8 mmol de bromoalcanoato de alquilo; aquecer a mistura de reacção ao refluxo durante 24 h sob atmosfera de árgon, com agitação contínua.
   7. Remover a mistura da reacção do calor e deixe arrefecer até à TA.
   8. Transferir a mistura reaccional para um funil de separação e adicionar água (20 ml) e acetato de etilo (20 ml) para extrair a fase orgânica. Isolar a fase orgânica e lava-se três vezes com água (porções de 20 ml).
   9. Seca-se a camada orgânica sobre 15 g de _MgSO4 durante 15 minutos. Uma vez seco, remover _MgSO4 a partir da mistura através de filtração sob vácuo através de filpapel ter.
   10. Remover o solvente utilizando um evaporador rotativo a 100 ° C e 21 kPa. Seca-se o produto em bruto sob vácuo à TA S / N.
   11. Recristaliza-se o produto adicionando apenas o suficiente de etanol quente para dissolver todo o sólido. Uma vez dissolvido, arrefecer o balão em gelo e permitir a formação de cristais. Recolhe-se o produto através de filtração sob vácuo e lava-se com etanol frio.
   12. Secam-se os cristais sob vácuo à temperatura ambiente durante 24 h sob atmosfera de árgon e armazenar até à sua utilização. Este procedimento produz 1,4-bis (butanoiloxi etil) benzeno.
   13. ²⁸ caracterizam o produto usando ponto de fusão e ^{de 1 H e 13} C espectroscopia de RMN.
4. Síntese de 1,4-dialcoxi-2,5-dibromobenzenos
   Nota: A via química para a preparação de 1,4-dialcoxi-2,5-dibromobenzenos é mostrado na Figura 1A e 1B.
   1. Montar um balão de fundo redondo seco, de três tubuladuras com uma entrada de árgon, um funil de adição a pressão constante com uma tampadorolha de vidro ou de septo, e uma saída ligada a uma tubagem de plástico equipada com um funil de vidro invertida suspensa sobre uma solução 1 M de NaOH.
   2. Neste balão de fundo redondo, dissolvem 218 mmol de 1,4-dialkoxybenzene em diclorometano (15 mL).
   3. Separadamente, adicionar 12 ml (598 mmol) de _Br2 a um frasco de 250 ml e dilui-se com diclorometano (12 ml).
   4. Transferir a solução ₂ / diclorometano Br para o funil de adição de pressão constante. Adicionar a solução de _Br2, gota a gota para o balão de fundo redondo de três tubuladuras com agitação sob árgon durante um período de 2 h.
   5. Após a adição estar completa, deixar a reacção a agitar S / N sob fluxo de árgon contínua.
   6. Extingue-se a reacção por adição de água Dl (20 ml), e verter a mistura numa ampola de decantação.
   7. Isolar a fase orgânica e lava-se três vezes com água Dl (20 ml,). Seca-se a camada orgânica sobre 15 g de _MgSO4 durante 15 minutos.
   8. _Remove-se o MgSO4 porfiltração sob vácuo através de papel de filtro, e remover o solvente usando um evaporador rotativo a 75 ° C e 21 kPa.
   9. Purifica-se em bruto 1,4-dialcoxi-2,5-dibromobenzeno, adicionando apenas o suficiente de etanol quente para dissolver todo o sólido. Uma vez dissolvido, arrefecer o balão em gelo e permitir a formação de cristais. Recolhe-se o produto através de filtração sob vácuo e lava-se com etanol frio.
   10. Seca-se o produto purificado sob vácuo à TA S / N; armazenar sob árgon.
   11. Caracterizar o produto usando ponto de fusão e ^{de 1 H e 13} C RMN espectroscopia ^27,28.
5. Acoplamento de Negishi com 3,4-etilenodioxitiofeno 2,5-dibromobenzenos 1,4-dialcoxi-(eDOT)
   Nota: A Figura 1C mostra o acoplamento de Negishi de 1,4-dialcoxi-2,5-dibromobenzenos com eDOT para formar monómeros de M1 e M2.
   1. Montar um balão de fundo redondo de três tubuladuras limpo com um septo, um condensador equipado com um adaptador de fluxo de entrada de controlo ligada à atmosfera de árgon, e um fluxo de saída de gás controlo adaptador ligado a um borbulhador.
   2. Conecte o adaptador de entrada para a linha de Schlenk utilizando tubos de PVC de paredes espessas. Começar a fluir árgon no balão de reacção durante vários minutos.
   3. Utilizando um bico de Bunsen, chama-secar o aparelho sob vácuo e purga com árgon três vezes, a fim de assegurar um ambiente sem ar.
   4. Pesar 1,07 g (10 mmol) de eDOT purificada e adiciona-se ao balão de reacção através de uma seringa inserida através do septo. Dilui-se a eDOT com THF anidro (20 ml) e agita-se sob atmosfera de árgon.
   5. Relaxar o balão contendo a solução eDOT utilizando um banho de gelo seco / acetona durante 15 min a -78 ° C.
   6. Após 15 min, adiciona-se lentamente 11 mmol de nBuLi em hexanos, gota a gota, mantendo a temperatura a -78 ° C. Agita-se a reacção a -78 ° C durante 1 h.
      Nota: A concentração exacta da nBuLi deve ser determinado por titulação antes da utilização de acordo com o ponto 1.1.
   7. Após 1 hora de agitação, remover o gelo / BA acetona secaº.
   8. Imediatamente após a remoção do banho, adicionar 14,13 ml de 1,0 M _de ZnCl2 solução gota a gota. Permitir que a reacção prossiga durante 1 hora enquanto se agitava à TA.
   9. Após 1 h de agitação, adicionar 4 mmol de 1,4-dialcoxi-2,5-dibromobenzeno e 0,08 mmol de tetraquis (trifenilfosfina) paládio (0) à mistura de reacção.
   10. Aquece-se a mistura de reacção ao refluxo (70 ° C) num banho de óleo.
   11. Acompanhar o progresso da reacção utilizando cromatograf ia em camada fina (TLC): Tome pequenas (0,2 ml) de aliquotas da mistura reaccional por dia, utilizando uma seringa e precipitar em 2 ml de 1 M de HCl. Extrai-se com 2 ml de _CHCl3 e detectar o extracto sobre uma placa de TLC de sílica ao lado de manchas de soluções de eDOT e o appropriate1,4-dialcoxi-2,5-dibromobenzeno. Eluir com acetato de etilo 60:40: hexano.
   12. Quando a reacção está completa, deixar a mistura reaccional arrefecer até à TA. Extingue-se a reacção por adição de 10 ml de HCl 1 M, seguido pela adição de diclorometano (20 mL).
   13. Transfer para uma ampola de decantação e isolar a camada orgânica.
   14. Lava-se a camada orgânica com água desionizada até a água de lavagem não é ácida. Teste a acidez da água de lavagem com papel de pH.
   15. Seca-se a camada orgânica sobre 15 g de _MgSO 4, filtrar, e remover o solvente usando um evaporador rotativo a 50 ° C e 21 kPa, para se obter o produto em bruto monómero conjugação estendida (M1 ou M2) como um sólido amarelo-laranja.
   16. Recristaliza-se o produto bruto utilizando uma solução quente de 3: 1 de etanol: solução de benzeno para M1 ou 7: 2 hexano: benzeno para M2. Adicionar apenas o suficiente mistura solvente quente para dissolver o sólido. Uma vez dissolvido, arrefecer o balão em gelo e permitir a formação de cristais. Recolhe-se o produto através de filtração sob vácuo e lava-se com etanol frio.
   17. Seca-se o produto sob vácuo durante 24 horas à TA. Armazenar no escuro sob árgon.
   18. Caracterizar o produto usando ponto de fusão e ^{de 1 H e 13} C espectroscopia de RMN. ¹⁸

2. Eletroquímica

1. Eletropolimerização
   1. Em um balão volumétrico de 50 ml de uma solução de electrólito preparar (TBAP) 100 mM de perclorato de tetrabutilamónio em acetonitrilo anidro _(CH3CN).
   2. Em um balão volumétrico de 10 ml preparar um monómero de 10 mM de solução (M1 ou M2) usando a solução TBAP 100 mM / _CH3CN como diluente.
   3. Adicionar um fio de prata (eléctrodo de pseudo-referência), e uma bandeira de platina (contra-eléctrodo) para uma célula electroquímica, seco no forno.
   4. Inserir um botão de platina polida recentemente (2 mm de diâmetro ²⁾ para ser utilizado como o eléctrodo de trabalho. Assegure-se que a parte inferior do eléctrodo de platina botão não estiver em contacto com o fundo da célula electroquímica.
   5. Encher a célula electroquímica com uma solução de monómero de electrólito suficiente para assegurar que as pontas de todas as três eléctrodos são imersos na solução.
   6. Desarejar a solução durante 5 minutos, fazendo borbulhar árgon suavemente através de uma agulha imersa no the solução.
   7. Levantar a agulha 2 mm acima da solução e continuar o fluxo de árgon durante todo o experimento para manter uma manta de árgon através da solução.
   8. Ligar os eléctrodos ao potenciostato e iniciar a polimerização pelo ciclismo aplicados os potenciais cinco vezes a uma velocidade de varredura de 100 mV / seg e uma gama de potencial entre -1,5 V e +1,0 V.
   9. Grave a saída de corrente durante este processo para gerar voltamogramas cíclicos.
2. Polymer Eletroquímica
   1. Depois de o filme de polímero é depositada sobre o eléctrodo de trabalho de platina botão, remover todos os eléctrodos a partir da solução de monómero de electrólito e lavar cuidadosamente com uma solução de electrólito livre de monómero (3 mL).
   2. Adicionar os eléctrodos de uma célula electroquímica limpa e adicionar solução suficiente de electrólito livre de monómero para assegurar que as pontas de todas as três eléctrodos são imersos na solução.
   3. Ligar os eléctrodos ao potenciostato. Ciclo do tw potencial aplicadoO vezes a uma velocidade de varredura de 50 mV / seg e uma gama de potencial entre -1,5 V e +1,0 V.
   4. Repita a experiência a 100, 200, 300, e 400 mV / s. Grave a saída de corrente durante cada experimento para gerar voltamogramas cíclicos.
3. Preparação de eletropolimerizado Films para UV-Vis-NIR Espectroscopia e Estudos fototérmicos
   1. Prepare filmes de polímeros como descrito na seção 2.1 acima, desta vez usando um óxido de índio-estanho (ITO) lâmina de vidro -Revestido como eletrodo de trabalho. Crescer as películas de polímero mais de 5 ciclos a uma velocidade de varrimento de 100 mV / s.
   2. Após a deposição do polímero, remover os eléctrodos a partir da solução de monómero e enxaguar com acetonitrilo (5 mL).
   3. Guarde o filme de polímero em acetonitrilo antes da espectroscópicas estudos.

3. Preparação NP

A Figura 2 mostra um diagrama esquemático do processo utilizado para a preparação NP através de polimerização em emulsão.

1. Prepare uma solução de 1 ml de 2% (w / v) de poli (ácido 4-estireno-co-ácido maleico) (PSS-co-MA) em água num frasco de vidro. Adicione uma pequena barra magnética para o frasco. Esta é a fase aquosa.
2. Prepare a 100 ul de solução de monómero de 16 mg / ml em clorofórmio num tubo de microcentrífuga.
3. Preparar a solução orgânica por dissolução de 0,03 g de ácido dodecilbenzeno sulfónico (DBSA) na solução de monómero de 100 ul. Misture a solução orgânica utilizando um misturador de vórtice automática durante 30-60 minutos de modo a assegurar a homogeneidade da solução.
4. Adicionar à fase orgânica para a fase aquosa, gota a gota em 10 ul porções enquanto se agitava com uma barra de agitação magnética até o volume total da solução orgânica é usado. Permitir agitação durante 60 segundos entre as adições em.
5. Adicionar 2 ml de água para diluir a mistura. Remova a barra de agitação do frasco para injectáveis.
6. Sonicar a emulsão usando um sonicador de sonda para um total de 20 seg, em intervalos de 10 seg a uma amplitude de 30% enquanto se imerge oo frasco num banho de gelo.
7. Retirar o frasco de amostra do banho de gelo, substituir a barra de agitação, e continuar a agitar a emulsão.
8. Adicionar 3,8 ml de solução de 100 mg / ml de _FeCl3 em água à emulsão de monómero. Permitir que a polimerização ocorra durante 1 hora, agitando continuamente. Isso produz protocolo NPs de polímero estabilizado com PSS-co-MA.
9. Retirar a suspensão NP da placa de agitação e transferir para 7 ml tubos de centrífuga. Centrifugar a suspensão a 75.600 xg durante 3 min; recuperar o sobrenadante e descarte de sedimento.
10. Dialisar o sobrenadante durante 24 horas utilizando 100 kDa de peso molecular de corte (MWCO) tubagem de diálise.

4. Polymer Films e NP Caracterização

Nota: Caracterizar os filmes de polímeros e nanopartículas via-Vis-NIR UV espectroscopia, e os PN usando espalhamento dinâmico de luz, análise de potencial zeta, e microscopia eletrônica.

1. Determinação da Absorção de polímero na região do UV-Vis-NEspectro IV ²⁹
   1. Suspensões NP: Transferir a suspensão para uma cuvete de quartzo e adquirir um espectro de 300 - 1000 nm com um intervalo de varrimento de 5 nm.
   2. Películas de polímero oxidadas: Transferir o vidro ITO lâmina revestida de polímero para uma cuvete de quartzo e encher a tina com acetonitrilo anidro. Adicionar 2 gotas de uma solução / ml 100 mg de _FeCl3 em CHCl ₃ para o acetonitrilo e misturar para garantir o filme de polímero é totalmente oxidado. Adquirir um espectro de 300 - 1000 nm com um intervalo de verificação de 5 nm.
   3. Películas de polímero redu: Transferir o vidro ITO lâmina revestida de polímero para uma cuvete e encher a tina com acetonitrilo anidro. Adicionar uma gota de hidrazina para se misturar o líquido e para assegurar o filme de polímero é completamente reduzido. Adquirir um espectro de 300 - 1000 nm com um intervalo de verificação de 5 nm.
2. Determinação da NP tamanho usando espalhamento dinâmico de luz (DLS) ³⁰
   1. Ligue o instrumento e permitir DLS-o aquecer durante 15 minutos.
   2. Dilui-se a suspensão NP em água a uma concentração de 0,01 mg / ml e em lugar de uma cuvete descartável de poliestireno.
   3. Coloque tina em leitor e começar a medição.
3. Determinação do Potencial Zeta NP ³¹
   1. Ligue o instrumento potencial zeta e deixe-o aquecer-se durante 30 min.
   2. Preparar a amostra por diluição de 200 ul de NP suspensão em 800 ul de solução 10 mM de KCl.
   3. Encha uma cuvete descartável de poliestireno com 700 ul de amostra.
   4. Insira a célula eletrodo potencial zeta na amostra garantindo que não haja bolhas entre os eletrodos ou no caminho da luz laser.
   5. Coloque a célula no instrumento e siga as instruções do software para executar a medição.
4. Determinação da NP Tamanho Usando Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ³²
   1. Drop-cast 10 ul das suspensões NP sobre lâminas de Si edeixar secar.
   2. Por pulverização catódica, revestimento os PN secas com 2 nm de irídio.
   3. Imagem das amostras a uma distância de trabalho de 5 mm e a 5 kV.

5. Investigar a citocompatibilidade do NPs

Nota: Todas as manipulações de células deve ser levada a cabo numa cabine de segurança biológica (fluxo laminar capa) para impedir a contaminação das células com bactérias, leveduras ou fungos a partir do meio ambiente, e para proteger o utilizador de doenças potencialmente infecciosas. Todas as soluções e acessórios utilizados com as células devem ser estéreis. Use técnicas adequadas de cultura de células assépticas.

1. Cultura das células SKOV-3 de cancro do ovário em frascos T75 a 37 ° C em uma _incubadora de CO 2 (5% de CO ₂₎ usando Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino como o meio de crescimento.
2. Semear as células a uma densidade celular de 5000 células / cavidade em uma placa de 96 poços e incuba-se durante 24 horas a 37 ° C num CO ₂ incubadora.
3. Imediatamente antes do uso, dilui-se NP suspensão em meio de crescimento completo a uma concentração de 1 mg / ml.
4. Filtrar as suspensões NP por passagem através de um filtro de 0,2 mícrons estéril e diluído para as concentrações desejadas de exposição (2-500 ug / ml) com meio de crescimento completo suplementado com 1% de penicilina / estreptomicina.
5. Remover os meios de comunicação a partir de cada um dos poços da placa de 96 cavidades por pipetagem suave e substituir com 100 ul de suspensões NP nas várias concentrações de exposição, ou com 100 uL de meios NP-livre para ambos os controlos positivos e negativos citocompatibilidade. Utilize 6 poços replicados por condição.
6. Imediatamente antes do passo seguinte, preparar uma solução de 0,5 mg / ml de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) em fenol-vermelho livre de DMEM. A filtração estéril da solução de MTT através de um filtro de 0,2 mícrons estéril.
7. Depois de permitir que os PN-se a incubar com as células durante o período de tempo desejado (Typically 24 ou 48 horas), remova suspensões NP com cuidado pipetando para fora.
8. Substituir imediatamente os meios de comunicação com o seguinte, dependendo da condição:
   1. Para o controle citocompatibilidade negativo, adicione 100 mL de metanol a cada um dos 6 poços e deixar descansar por pelo menos 5 min. Após o tratamento de metanol, o metanol substituir com 100 ul de / ml de solução esterilizada por filtração de 0,5 mg de MTT em fenol-vermelho livre de DMEM.
   2. Para o controlo positivo e amostras tratadas com NP, substituir o meio com 100 ul de / ml de solução esterilizada por filtração de 0,5 mg de MTT em fenol-vermelho livre de DMEM.
9. Incubam-se as células durante 2 a 4 horas na incubadora. Após a incubação, examinar as células ao microscópio para verificar se a formação de cristais de formazano.
10. Cuidadosamente remover a solução de MTT por pipetagem e substituí-la com 100 ul de dimetilsulfóxido (DMSO).
11. Colocar a placa de 96 poços num agitador e mistura-se durante vários minutos, para estimular a dissolução do paracristais Mazan.
12. Medir a absorvância de cada poço a 590 nm (pico de absorvância do produto de formazano) e 700 nm (linha de base).
13. Subtrair a absorvância da amostra a 700 nm (linha de base) do que a 590 nm para cada poço.
14. Normalizar a absorvência corrigida, dividindo-o pela média do controlo positivo e converter a uma percentagem multiplicando por 100.
15. Determinar a percentagem média de viabilidade e desvio-padrão para cada condição.

6. Estudos Transduction fototérmicos

Nota:. Neste trabalho, um sistema de laser previamente descrito por Pattani e Tunell é utilizado ³³

1. Photothermal Transdução de NP Suspensões
   1. Diluir NPs em água Dl para a concentração de interesse.
   2. Adicionar 100 ul de NP suspensão para um poço de uma placa de 96 poços. Colocar a placa bem numa placa quente mantida a 25 ° C.
   3. Ligue o fornecimento de energia para o laser e permitir que ele to aquecer durante alguns minutos. Neste estudo, a 808 nm diodo laser fibra-acoplado avaliado até 1 W de potência é usado.
   4. Passe o feixe de laser para a fase de amostra através de uma fibra óptica. Utilize uma lente convexa para divergir o feixe de laser para o ponto desejado de tamanho.
   5. Medir a potência usando um medidor de energia padrão e ajustar a uma potência de 1 W / cm ^2.
   6. Ligue a câmera IR (InSb câmera infravermelha (FLIR Systems SC4000)) e definir a região de interesse (ROI) local para ler a temperatura do ponto 6 milímetros onde o laser está focado.
   7. Coloque o bem de interesse no ponto focal do feixe de laser. Registar a temperatura da linha de base da amostra. Ligue o laser e irradiar o bem continuamente durante 5 min, enquanto o registo da temperatura.
   8. Depois de 5 minutos, desligar a laser e continuar a registar a temperatura do poço até que arrefeça de volta para a temperatura de linha de base inicial.
      Nota: aquecer e resfriar cada suspensão de três vezes e calcular amudança da temperatura média ao longo do tempo. Utilizar água Dl a 25 ° C em vez de uma suspensão NP como um controlo negativo para a conversão fototérmico.
2. Fototérmica Transdução de Polymer Films
   1. Transferir o vidro ITO lâmina revestida de polímero sobre uma placa quente mantida a 25 ° C.
   2. Ligue o fornecimento de energia para o laser e deixe-o aquecer durante alguns minutos. Neste estudo, a 808 nm diodo laser fibra-acoplado avaliado até 1 W de potência é usado.
   3. Passe o feixe de laser para a fase de amostra através de uma fibra óptica. Utilize uma lente convexa para divergir o feixe de laser para o ponto desejado de tamanho.
   4. Medir a potência usando um medidor de energia padrão e ajustar a uma potência de 1 W / cm ^2.
   5. Ligue a câmera IR (InSb câmera infravermelha (FLIR Systems SC4000)) e definir a região de interesse (ROI) local para ler a temperatura do ponto 6 milímetros onde o laser está focado.
   6. Coloque a película no ponto focal do feixe de laser. Grave a baseline temperatura da amostra. Ligue o laser e irradiar a amostra continuamente durante 5 min, enquanto o registo da temperatura.
   7. Depois de 5 minutos, desligar a laser e continuar a registar a temperatura da amostra até que arrefeça de volta para a temperatura de linha de base inicial.
      Nota: aquecer e resfriar cada filme três vezes e calcular a variação média da temperatura ao longo do tempo. Utilize uma corrediça ITO nua a 25 ° C como um controlo negativo para a conversão fototérmico.

O protocolo de reacção obtendo-se M1 e M2 é mostrado na Figura 1. Os monómeros podem ser caracterizados por ¹ H e ¹³ C RMN espectroscopia, ponto de fusão e análise elementar. O espectro de RMN ¹ H fornece informações sobre a conectividade de átomos e seus ambientes eletrônicos; Assim, é rotineiramente utilizada para verificar que as reacções tenham sido concluída com êxito. Reacções de acoplamento de Negishi envolvem o acoplamento do anel de fenilo ao eDOT, fazendo com que o pico de protões fenilo ao passar de 7,1 ppm para 7,8 ppm. O protão tienilo também se deslocará upfield a 6,5 ​​ppm. Os quatro protões nos carbonos ponte etilenodioxi será dividida em dois conjuntos de multiplets em 4,3 ppm. Prótons nos átomos de carbono alifáticos não vai mudar significativamente. O espectro de RMN ^{de 13 C} irá apresentar picos a 170, 145, 140, e 113 para os carbonos tienilo, e 150, 120, e 112 para os carbonos fenileno. Posições de alicarbonos fáticos não vai mudar significativamente. A estrutura química, ¹ H NMR, ¹³ C NMR e de M2 são mostrados na Figura 3.

Electropolymerizations de M2 rendendo polímero (P2) e a voltametria cíclica de P2 são mostrados na Figura 4 Na Figura 4A, inicialmente, não existe resposta da corrente.; como potenciais aumenta, o início da oxidação do monómero M1 (E _{em, m)} pode ser visto em + 0,25 V, com a oxidação de pico do monómero (E _{P, M)} a + 0,61 V. Durante o primeiro exame, a pico inicial observada é indicativa da oxidação irreversível de monómero, resultando na formação P2 sobre a superfície do eléctrodo de trabalho. Durante a segunda verificação dois processos de oxidação são observados: oxidação monómero ainda é visto em 0,25 V, e a oxidação do polímero é visto a 0 V. voltametria cíclica de P2 (Figura 4B) foi conduzida a velocidades de varrimento compreendidas entre 50 e 400 mV / seg. A película de polímero é azul escuro no estado oxidado e vermelho no estado neutro. Ciclagem do polímero a uma variedade de taxas de varrimento revela uma relação linear entre a velocidade de varrimento e a corrente de pico, o que indica que o polímero é electroactivo e aderiu ao eléctrodo. ¹⁸ Polímero de oxidação _{(E a, P)} é observada a -0,02 V durante P2, e redução do polímero (E _{c, p)} é observada em -0.3 V, quando um ciclo a 100 mV / s.

As NPs foram sintetizados como mostrado na Figura 2 e caracterizado usando espectroscopia UV-Vis-NIR, a microscopia electrónica, e DLS. A UV-Vis-NIR espectros de filmes P2 oxidada e reduzida, e de oxidado P2 PN, são mostrados na Figura 5. As películas de polímero oxidadas e NPs exibem um pico de absorvância λ _{max a} 1,56 eV (795 nm). Quando reduzido em hidrazina, o pico filme absorção desloca-se para _um máximo de 2,3 eV λ (540 nm). A banda polímero gAP _(E G) é determinada a partir do início da transição π- π * no polímero neutro, tal como indicado pela seta preta na Figura 5.

A imagem SEM de NPs P2 na Figura 6A mostra que as NPs são esféricas e sub-100 nm de diâmetro. Dados de DLS na Figura 6B mostra uma média-Z das suspensões para ser 104 nm de diâmetro, com um índice de polidispersidade (PDI) de 0,13, indicando que a amostra é moderadamente monodispersas. O potencial zeta do NPs P2 foi encontrado para ser -30,5 mV. As alterações da temperatura quando NPs são expostos à radiação NIR demonstra conversão fototérmico. Em comparação com os controlos de água, que se submetem a menos do que um aumento de 1 ° C na temperatura, suspensões NP em água são capazes de converter a energia do laser absorvida em calor, como demonstrado pelo aumento de 30 ° C de temperatura das suspensões NP (Figura6C). Um aumento de temperatura semelhante (28 ° C) é observado quando as películas de polímero sobre vidro ITO são irradiados a 808 nm (Figura 6C).

O citocompatibilidade de NPs de polímero é determinada utilizando ensaios de viabilidade celular MTT. Os resultados de estudos citocompatibilidade para PEDOT:. PSS-co-MA NPs são mostrados na Figura 7 como mostrado, dentro da gama de concentração de NP de 0,23 a 56 ug / ml, os PN não diminuem a viabilidade das células para menos de 90% do controlo. Tipicamente, uma redução da viabilidade celular inferior a 20% (isto é, até 80% de viabilidade) é considerado aceitável para a determinação da NP citocompatibilidade.

Figura 1. Síntese Geral de monómero de partida com a síntese de precursor. (A) Síntese de 1,4-dialcoxi-2,5-dibromobenzeno. (B) Síntese de 1,4-dialcoxi-2,5-dibromobenzeno contendo porção éster. (C) reacção de acoplamento cruzado de 1,4-dialcoxi-2,5-dibromobenzeno com eDOT, produzindo monómeros M1 e M2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Processo de polimerização em que a solução orgânica é adicionada gota a gota a uma solução aquosa a criação de uma emulsão. O monómero e o solvente orgânico pode variar. Polimerização oxidativo ocorre quando _FeCl3 é adicionada à emulsão. Após a purificação da suspensão coloidal, as NPs são suspensas no meio aquoso. Por favor clique aqui para ver uma versão maior destafigura.

Figura 3. Os espectros de RMN de monómero M2. (A) ^1H RMN espectroscopia de M2 em que a separação dos protões a 4,32 ppm etilenodioxi, a mudança de campo acima dos protões tienilo, e o deslocamento bem distante dos protões fenilo são indicativos de acoplamento bem sucedido . (B) ¹³ C espectroscopia de RMN de M2 mostrando os tienilo e fenil carbono picos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. (A) polimerização eletroquímica de M2 a P2; cinco ciclos a 100 mV / seg de 0,01 M a 0,1 M em M2 TBAP / _CH3CN. (B) Voltametria cíclica da película de polímero em 0,1 M TBAP / CH _{3 CN} ciclada a 50, 100, 200, 300 e 400 mV / s. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. UV-Vis-NIR espectros de P2 tanto como uma película e como uma suspensão de nanopartículas. O espectro de película oxidada é mostrado em azul, o espectro da película reduzida é mostrado em vermelho, e o espectro do oxidada NP suspensão é mostrado em verde. A seta preta corresponde a uma linha tangente utilizado para a determinação da banda proibida do polímero. Comprimentos de onda de absorção de pico para os polímeros são fornecidos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior destafigura.

Figura imagem 6. (A) SEM mostrando a morfologia eo tamanho de P2 PN. (B) a distribuição de tamanho de P2: PSS-co-MA NP suspensão onde o valor Z-média é de 104 nm e o PDI é de 0,13. (C) a mudança de temperatura de um P2:. PSS-co-MA NP suspensão a 1 mg / ml (azul) e filme (verde) quando irradiado com NIR luz para 300 segundos, seguido de arrefecimento passivo após a conclusão da irradiação do laser Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7. citocompatibilidade de PEDOT: suspensões PSS-co-MA NP, conforme determinado pelo ensaio MTT Viabilidade é.mostrado para células expostas a diferentes concentrações de NPs como a percentagem média em relação ao das células incubadas com meio de NP-livre (controlo positivo). O controlo negativo consiste de células mortas por exposição ao metanol antes para o ensaio de MTT. As barras de erro representam o desvio padrão entre repetições (n = 6). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Neste trabalho, o NPS polímeros electroactivos foram sintetizados como agentes potenciais PTT para o tratamento do cancro. A preparação das nanopartículas está descrito, começando com a síntese dos monómeros seguida por polimerização em emulsão. Embora a preparação de PN utilizando polímeros electroactivos tais como pirrole e eDOT foi descrito antes, este documento descreve a preparação de nanopartículas poliméricas começando com monómeros de conjugação prolongados exclusivos, demonstrando que este processo pode ser estendido para monómeros maiores e mais complexos.

Duas vias diferentes são necessários para sintetizar os monómeros dialkoxybenzene. Enquanto o 1,4-dihexyloxybenzene pode ser sintetizado usando KOH / EtOH, que é vencida abordagem na síntese de 1,4-bis (butanoiloxi etil) benzeno, muito provavelmente devido à hidrólise do éster promovida por base. Quando um KI / K ₂ CO ₃ mistura é usada, a hidrólise é evitada, e o produto é obtido com êxito. Bromação de both dialkoxybenzenes é conseguida utilizando Br _2. É necessário realizar esta experiência, sob uma corrente de árgon para deslocar HBr formado durante a reacção. A saída de gás deve exalar sobre uma solução NaOH neutralizante para prevenir HBr da corrosão luminárias capô; note que HBr pode causar tubos de plástico para endurecer ao longo do tempo.

Bedot-B (OU) ₂ monómeros M1 e M2 foram sintetizados utilizando o acoplamento de Negishi. Este é um método eficaz para o acoplamento carbono-carbono de eDOT com 1,4-dialcoxi-2,5-dibromobenzenos para produzir Bedot-B (OU) ₂ monómeros. É crucial para relaxar o eDOT a -78 ° C antes da adição de n-BuLi, a fim de minimizar reacções secundárias indesejáveis. Quando todo o 1,4-dialcoxi-2,5-dibromobenzeno está esgotado a partir da mistura de reacção (determinada utilizando TLC, o que tipicamente leva 3-5 dias), a reacção está completa. A reacção é extremamente sensível ao ar, e qualquer exposição ao ar vai afectar o rendimento da reacção. Assim, quando introducing compostos sólidos (tal como o catalisador) ao recipiente selado, a exposição ao ar deve ser minimizada, aumentando o fluxo de árgon.

Monómeros electroactivos e polímeros são rotineiramente caracterizados utilizando voltametria cíclica para determinar monoméricas e oxidação do polímero potencial e o potencial de redução do polímero, e filmes preparados através de polimerização electroquímico são utilizados para determinar a absorção de polímero no espectro de UV-Vis-NIR em ambos os estados oxidados e reduzidos. Neste trabalho, películas de polímero foram depositados sobre ambos um botão de platina e de vidro ITO revestido por electropolimerização. Algumas das vantagens de electropolimerização são reprodutibilidade e a capacidade de controlar a espessura da película através da monitorização da corrente de a película polimerizada e parar a electropolimerização quando uma resposta específica é conseguida ³⁴ experiências electroquímicas deve ser conduzida sob uma atmosfera inerte tal como árgon.; o fluxo de árgon deve ser tão lenta que não perturbar a superfície da solução para garantir um processo de difusão controlada. Alternativamente, as experiências electroquímicas podem ser realizados numa caixa seca atmosfera inerte equipado com orifícios de passagem dos electroquímicos. É importante que nenhum dos três eletrodos estão tocando um ao outro durante a eletropolimerização. Antes de polímero estudos de voltametria cíclica, as películas de polímeros depositados deve ser lavada com uma solução de electrólito livre de monómero para remover qualquer monómero que não reagiu a partir dos filmes. Para todos os estudos electroquímicos a gama potencial necessárias irá depender da estrutura do monómero / polímero; de modo que este intervalo pode variar de acordo com os monómeros e polímeros alternativos. Dependendo da estrutura dos substituintes alcoxi, o solvente utilizado para preparar as soluções de monómero de electrólito pode também dissolver o polímero. Nesse caso, a deposição do polímero sobre o eléctrodo durante electropolimerização será lenta ou inexistente, e o solvente utilizado para a polimerização tem de ser alterada.

Análise potencial Zeta é normalmente realizada para avaliar a estabilidade de suspensões de NP. Potencial Zeta é o potencial no limite entre a camada de Stern onde os íons são fortemente associados com a superfície do NP, ea camada difusa onde os íons não interagem com a superfície do NP. ³¹ Zeta medidas possíveis contam com o movimento dos PN cobradas quando um elétrico campo é aplicada à suspensão. Especificamente, o NPS negativamente carregadas são atraídas para o eléctrodo positivo, e vice-versa. Suspensões coloidais podem ser estabilizadas através de repulsões electrostáticas. Especificamente, as suspensões são consideradas estáveis ​​quando o seu potencial zeta é maior do que +/- 30 mV. Nas nossas formulações NP, a presença de grupos sulfonato e carboxilato de DBSA e PSS-co-MA produz uma carga de superfície negativa sobre os PN.

A purificação do the PN é um passo crucial, a fim de remover qualquer excesso de surfactante e qualquer material de partida não reagido antes de estudos in vitro de células. Remoção do surfactante ineficaz pode levar a morte celular significativa. Como para qualquer outro no ensaio de células in vitro, é vital para trabalhar em uma câmara de fluxo laminar e de trabalhar sob condições estéreis. NPs também devem ser esterilizados antes de serem utilizados fazendo passar a suspensão através de um filtro de 0,2 mícrons estéril. Também é importante para verificar a concentração de suspensões NP após a filtração estéril. Para este fim, uma fracção da suspensão NP volume conhecido de filtrado pode ser seco por congelação para se obter a massa seca. O ensaio de viabilidade celular MTT é tipicamente utilizado para estudar o efeito de biomateriais, incluindo NPS em células cultivadas. Este ensaio simples pode ser adaptado para a investigação do citocompatibilidade suspensões de NP com qualquer linha celular de mamífero. O ensaio colorimétrico MTT baseia-se na conversão de um corante tetrazólio amarelo para púrpura, INSOLuble cristais de formazano, que pode então ser dissolvidos em DMSO ou soluções alcoólicas ácidas. ^35,36 Ao realizar em ensaios celulares in vitro, tais como o ensaio de viabilidade celular MTT em placas de multi-poços, a consistência na sementeira de células e manipulação é crítica para conseguir diferenças mínimas entre replicar amostras. Antes e durante a experiência, as células semeadas deve ser examinada sob um microscópio para assegurar a sementeira e crescimento coerente, e também para eliminar qualquer contaminação. Finalmente, microscopia também pode ser utilizado para confirmar a dissolução completa dos cristais de forma zan após a adição de DMSO.

Fototérmicos estudos foram conduzidos utilizando um laser contínuo a 808 nm. O uso de lasers pulsados ​​vs. contínuas podem aquecer materiais de forma diferente. Estudos anteriores têm comparado conversão fototérmica e ablação fototérmica com nanoestruturas de ouro como agentes PPF, ^37, mas mais pesquisas são necessárias para investigar a conversão fototérmica de polymeric NPs como as aqui descritas. Neste trabalho, o laser foi divergiu em uma lente convexa e focada com um tamanho de mancha de 6 mm. É importante ter cuidado para não perturbar o sistema óptico ao executar experimentos para evitar alterações acidentais no plano focal que poderiam causar diferenças nos resultados de conversão fototérmica. A placa quente foi usada para aquecer e manter uma temperatura constante de linha de base para o estudo.

Em conclusão, um protocolo para a preparação de polímeros electroactivos NP suspensas em meio aquoso é descrita. Acoplamento de Negishi é um método eficaz para o acoplamento de 1,4-dialcoxi-2,5-dibromobenzenos com 3,4-etilenodioxitiofeno (eDOT). Electropolimerização dos monómeros é detalhado neste protocolo. Isso prova a ser uma forma eficaz de produzir rapidamente filmes de polímeros e estudar suas propriedades eletrônicas. Os filmes poliméricos são ainda caracterizados utilizando-Vis-NIR UV espectroscopia para determinar as lacunas da banda dos polímeros neutros. Electrochemical rendimentos de polimerização em emulsão sub-100 nm NPs com morfologias esféricos uniformes. Além da terapia de ablação fototérmico, estas nanopartículas têm muitas aplicações potenciais em dispositivos electroactivos, incluindo o armazenamento de energia e sensores. Os estudos térmicos e citocompatibilidade realizados indicam que essas nanopartículas poderiam ser candidatos potenciais em aplicações biomédicas como agentes fototérmicos.

The authors have nothing to disclose.

Este trabalho foi financiado em parte pelo Fundo Texas Tecnologia Emergente (Startup a TB), o Programa de Aperfeiçoamento Texas State University Research, o Texas State University Doutorado Research Fellowship (a TC), a Parceria NSF para Pesquisa e Educação em Materiais (PREM, DMR-1205670), a Fundação Welch (AI-0045), e os Institutos Nacionais de Saúde (R01CA032132).