Interferometria Bio-layer para Medição Cinética de interações proteína-proteína e alostéricas Ligante Effects

Os protocolos aqui descrever os ensaios cinéticos de interações proteína-proteína com Bio-camada Interferometria. Tipo F ATP sintase, que está envolvida no metabolismo da energia celular, pode ser inibida pela sua subunidade ε em bactérias. Temos adaptado Bio-camada de interferometria para estudar as interacções do complexo catalítico com o domínio C-terminal do inibidor ε.

Descreve-se o uso de bio-camada de interferometria para estudar interacções inibidoras de subunidade ε com o complexo catalítico de Escherichia coli ATP sintase. Bacteriana tipo F ATP sintase é o alvo de um novo antibiótico, aprovado pela FDA para combater a tuberculose resistente a medicamentos. Compreender bactérias específicas auto-inibição da sintase do ATP pelo domínio C-terminal da subunidade ε poderia proporcionar um novo meio para a enzima alvo para a descoberta de medicamentos anti-bacterianos. O domínio C-terminal de ε sofre uma alteração conformacional dramática quando as transições de enzimas entre os estados activos e inactivos, e ligandos do local catalítico, que podem influenciar de conformações de ε é predominante. As medidas do ensaio de cinética de ε ligação / dissociação com o complexo catalítico, e indiretamente meamede a mudança de ε ligado a enzima para e a partir da conformação inibitória aparentemente nondissociable. O sinal de interferometria Bio-camada não é muito sensível para a composição da solução, de modo que também pode ser utilizado para monitorizar os efeitos alostéricos de ligandos do local catalítico de alterações conformacionais do ε.

Interacções proteína-proteína são importantes para muitos processos biológicos, e métodos ópticos livre do rótulo como a superfície Plasmon Resonance (SPR) têm sido utilizados in vitro para estudar a cinética de ligação e de dissociação ^1. A maioria dos métodos sem rótulo imobilizar uma biomolécula em uma superfície do sensor e usar um sinal óptico para detectar um parceiro de ligação de solução, uma vez que se associa com a biomolécula imobilizada ^1. Enquanto SPR é um método altamente sensível, é propenso a interferências devido a mudanças no índice de refração da solução que flui sobre o sensor ^2. Apesar de não ser tão sensível quanto a SPR, Bio-camada Interferometria (BLI) é menos afetado por mudanças na composição da amostra ^1,3. BLI usa biossensores de fibra óptica que têm um revestimento biocompatível proprietária na ponta. O sistema utilizado aqui (Octeto-RED96) contém oito espectrofotômetros. A luz branca é canalizada para uma linha de sondas que se movem em um braço robótico. Sensores de fibra óptica are captado pelas sondas e mudou-se para uma placa de 96 poços contendo amostras. Uma das moléculas alvo é imobilizado na superfície do biossensor. Em seguida, os sensores são movidos para cavidades contendo o parceiro de ligação em solução. BLI monitora associação do parceiro de ligação com a molécula imobilizada e depois monitora dissociação depois de se mudar os sensores de solução sem o parceiro de ligação. A ligação de moléculas de superfície do biossensor leva a alterações na interferência óptica entre ondas de luz que reflectem para trás para os espectrofotómetros a partir de uma superfície interna e externa a partir da interface entre o sensor e solução. Estas alterações na interferência pode ser quantificado e utilizado para determinar as taxas cinéticas de ligação e de dissociação, tal como resumido na animação da figura 1.

Temos aplicado BLI para medir as interacções entre o complexo catalítico da ATP sintase bacteriana e sua subunidade ε, o qual pode auto-inibir a enzima. ATP synthase é um nanomotor rotativo encaixado à membrana que catalisa a síntese e hidrólise de ATP ^4. O complexo catalítico (F ₁₎ pode ser isolado de uma forma solúvel que funciona como uma ATPase. Subunidade ε tem dois domínios: o domínio N-terminal (NTD) é necessário para a montagem correcta e acoplamento funcional da enzima, mas não interagem directamente com as subunidades catalíticas; do domínio C-terminal (CTD) pode inibir a enzima, interagindo com várias subunidades catalíticas ^5,6. Esta regulação mediada por ε é específico para ATP sintases bacterianas e não se observa no homólogo mitocondrial. ATP sintase emergiu como um alvo para drogas antibacterianas, como mostrado pela recente aprovação do FDA bedaquiline no tratamento da tuberculose resistente aos medicamentos ^7. Assim, visando papel inibitório da ε para a descoberta da droga poderia render antibacterianos que não inibem a ATP sintase mitocondrial. Com o complexo catalítico isolado (F _1), εtorna-se uma subunidade dissociáveis. No entanto, com ε ligado a M _1, o εCTD pode sofrer uma alteração conformacional dramática, parcialmente inserção na cavidade central da enzima e formando um estado de inibição, que é pouco provável que se dissociam directamente ^6,8. Usamos BLI para medir cinética de F ₁ / ε ligação e dissociação, e indiretamente, para examinar os efeitos alostéricos do local catalítico ligantes na conformação de ε.

No nosso sistema, ε foi escolhido para a imobilização na superfície do sensor, uma vez sinal BLI (como SPR) é sensível à massa das moléculas de ligação à superfície. A subunidade ε é pequena (~ 15 kDa), em relação ao principal complexo F ₁ (~ 347 kDa). Assim, um sinal de BLI maior irá resultar da ligação de F ₁ a ε imobilizada. A fim de monitorar F ₁ de dissociação, o que pode ser muito lenta, ε deve ser fortemente imobilizada. Assim, optou-se por biotinilarE imobilizá-la em biossensores revestidas com estreptavidina. As proteínas podem ser biotinilada por (i) a modificação aleatória de lisinas da superfície ^9, (ii) a reacção de uma cisteína nativa única ou engenharia com um reagente biotina-maleimida ^{de 10} ou (iii) a adição de um péptido geneticamente biotina-receptor específico que é enzimaticamente biotinilado durante expressão in vivo da proteína marcada ^11. No nosso sistema, ε é biotinilado utilizando método (iii) ^8. Uma vez ε marcado com biotina, está imobilizado sobre sensores estreptavidina, BLI pode medir a ligação e dissociação do F ₁ que foi esvaziada da subunidade ε (F ₁ (-ε)). Para as experiências aqui descritas, os ensaios preliminares foram feitos para determinar quantidades razoáveis ​​de proteína biotinilada para imobilizar sobre os sensores. Isto pode variar, dependendo do peso molecular da proteína e do seu parceiro de ligação, mas o objectivo é o de determinar uma quantidade mínima de proteína imobilizada tchapéu fornece (i) aceitável sinal-ruído para a cinética de ligação com uma baixa concentração do parceiro de ligação (abaixo K _D) e (ii) uma distorção mínima de cinética de ligação com a concentração de quase saturação do parceiro de ligação. Além disso, a estequiometria de biotinilação pode variar (mas evitar> 1 mol biotina / proteína mol), de modo algum ensaio inicial pode ser necessário para cada novo lote de proteína biotinilada para confirmar que um sinal consistente BLI pode ser alcançada durante a imobilização da estreptavidina-revestida sensores.

1. Programação do Instrumento de BLI Assay

Ligue o instrumento pelo menos uma hora de antecedência para permitir que a lâmpada para aquecer, o que é necessário para minimizar o ruído e deriva em sinal óptico durante o experimento. Regule a temperatura desejada por meio da guia instrumento para pré-aquecimento do suporte da placa de amostra. Em seguida, criar o projeto experimental no software de aquisição de dados. Selecione "New Kinetics Experiment" na guia Assistente de Experiment. Isto apresenta um menu com abas com todos os passos que devem ser definidos.

1.1. Definição Placa

Definir as colunas para ser utilizado na chapa de amostra, de 96 poços. Atribuir colunas para conter buffer, proteína imobilizada ou parceiro de ligação. Para cada associação bem, introduzir a concentração de agente de ligação a ser usado. Nota: a definição da placa mostrada na Figura 2 tem opções para ensaios diferentes.

1.2. Definição Assay

1. Linha de Base
   Começar com uma breve etapa de linha de base (≥ 60 seg), com os sensores em tampão de ensaio (figura 2, coluna 1), para estabelecer os sinais de BLI iniciais na placa de 96 poços.
2. Carregando (imobilizando a proteína biotinilada sobre os sensores)
   Atribuir os sensores para os poços que contêm a proteína biotinilada (figura 2, coluna 2). Use a função de limite para atingir um nível pré-determinado de ligação (ver Introdução). Defina a opção de limite para que todos os sensores estarão movimentod para a próxima coluna de poços, quando qualquer um dos sensores atinge o limiar.
3. Linha de Base
   Incluir uma outra etapa de referência em tampão (Figura 2, a coluna 3, normalmente> 5 minutos), para lavar as proteínas biotiniladas nonimmobilized a partir dos sensores e os sinais de referência estabelecer novos, estáveis. Para os ensaios de ligação de base / dissociação apenas (como na Figura 3), incluir um passo adicional de linha de base (60 seg) com sensores em novos poços de tampão (Figura 2, coluna 4), ​​antes do passo de associação.
4. Associação (do parceiro de ligação à proteína imobilizada)
   Para um ensaio de ligação de base / dissociação (como na Figura 3), seleccionar um intervalo de concentrações de agente de ligação a ser usadas para diferentes sensores / poços (figura 2, coluna 5). Ajustar o tempo de passo, de modo que pelo menos uma concentração de saturação do agente de ligação deve aproximar-se do equilíbrio de sinal de ligação. Para umaensaio para testar os efeitos alostéricos de pequenos ligantes na dissociação do complexo proteína-proteína (tal como na Figura 5), seleccionar uma única concentração elevada de agente de ligação (~ 10 vezes superior ao estimado K _D) para a utilização em todos os poços de associação.
5. A dissociação (do parceiro de ligação)
   Para um ensaio de ligação de base / dissociação única (como mostrado na Figura 3), pode designar os sensores para voltar à coluna 4 (Figura 2), os mesmos poços como tampão utilizados para a linha de base extra antes de associação. Para um ensaio para testar os efeitos alostéricos de pequenos ligantes, em vez designam sensores para mover a coluna 6 (Figura 2), em que cada poço pode conter tampão mais diferentes ligandos alosticos.

1.3. Atribuição Sensor

Indicam os locais do tabuleiro sensor que irá conter sensores prewetted para o ensaio. Identificar todas as posições vazias desde o experimento fail se não sensores são apanhados.

1.4. Revisão Experiment

Visualize todas as medidas planejadas para verificar se há erros e voltar para corrigi-los.

1.5. Execute Experiment

Digite os detalhes necessários, incluindo a localização dos arquivos de dados. Digite a temperatura desejada para o experimento. Se os sensores ainda exigem prewetting, selecione a opção de adiar o início do experimento. Finalmente, uma vez que toda a preparação da amostra é completo (passo 2) e tanto a placa de amostra e sensor de bandeja são carregados no instrumento, clique no botão Go para executar o ensaio.

2. Preparação de Amostras

1. Preparar um tampão de teste apropriado. Tampão utilizada para as experiências mostradas nas Figuras 3 e 5: 20 mM de MOPS (ácido 3 - (N-morfolino) propanossulfónico), Tris (tris (hidroximetil) amino-metano) (adicionados para ajustar o pH a 8,0), KCl 50 mM. Incluir BSA (albumina de soro de bovino, de ácidos gordos livres-, 0,5mg / ml final) no tampão para todas as etapas do ensaio e para todas as diluições da proteína biotinilada ou parceiro de ligação para minimizar a ligação não específica de proteínas para os sensores.
2. Dilui-se a proteína biotinilada (ε) em tampão de ensaio até uma concentração apropriada (ver introdução).
3. Preparar diluições do parceiro de ligação (F ₁ (-ε)) em tampão de ensaio (ver discussão para a gama de concentrações de usar).
4. Prewet os sensores revestidos com estreptavidina durante pelo menos 10 minutos para remover o revestimento de protecção de sacarose. Retire o suporte contendo o sensor a partir da bandeja do sensor e inserir uma placa de 96 poços no fundo do tabuleiro, deslizando um canto da placa no entalhe de orientação sobre a bandeja. Para a coluna de sensores a utilizar, adicionar 200 ul de tampão de ensaio por po em que a coluna da placa de 96 poços. Retorne o rack de sensores para a bandeja na orientação correta (com guias em slots).
5. Conforme designado durante a programação na Etapa 1, preencha o poçosf a placa amostra com tampão de ensaio ou as diluições adequadas de proteína, como mostrado na Figura 2. Evite a introdução de bolhas, pois podem causar ruído no sinal óptico. Incluem um ou mais poços de referência que omitem ou (i) a proteína biotinilada ou (ii) o parceiro de ligação.
6. Abra a porta do aparelho e inserir o sensor de bandeja para o palco (à esquerda), com abas da bandeja inseridos nos slots do palco. Insira a placa de amostra no suporte da placa (à direita), certifique-se de que a placa está bem encaixada e na orientação correta, conforme indicado no suporte da placa. Fechar a porta e iniciar o ensaio de o programa de aquisição de dados (passo 1.5).

3. Informática

1. Após o ensaio foi executado, abra o software de análise de dados e carregar a pasta que contém os dados. Clique na aba "Processamento" para ver um menu passo a passo de Processamento (à esquerda) e os dados cinéticos matérias, com cada sensor (AH) atribuída uma cor diferente (verFigura 3).
2. Em "Seleção de dados", clique no botão "Sensor Seleção". Sobre a "Amostra Prata Map", designar os poços para 1 ou 2 sensores de controle (G, H em ensaio da Figura 3), como poços de referência. No menu Processamento, marque a caixa "subtração" e selecione "Wells referência" para subtrair sinal de referência (simples ou média) de sinal de todos os outros sensores.
3. Alinhe todos os vestígios de Y = 0 usando a etapa "Alinhar eixo Y". Selecione "linha de base", como a etapa de alinhamento (sendo esta a última linha de base antes da etapa Association). Para o "Intervalo de tempo", digite os últimos 10 segundos do que da linha de base (ou seja, 50-60 seg para 60 seg linha de base, como na Figura 3).
4. Marque a caixa "Inter-passo Correção" para minimizar as mudanças de sinal entre as etapas de associação e dissociação. Selecione alinhar a linha de base ou dissociação.
5. Selecione a função de filtração Savitzky-Golay na maioria dos casos e clique em "Dados do Processo" para prosseguir. Inspecione visualmenteos dados finais processados ​​(painel inferior direito). Com ensaios destinados a análise de dados global (como na Figura 4), ​​se os traços de sinal mostram uma mudança significativa entre Associação e etapas de dissociação, altere a seleção de dissociação ou a linha de base para a "Correção Inter-passo" e reprocessar os dados antes de prosseguir para dados Análise.

4. Análise de Dados

Clique na guia "Análise" in Análise de Dados para começar. Nota: o exemplo os passos indicados a seguir são para a análise global de múltiplas curvas de ligação / dissociação (como na Figura 3).

1. Para o "Passo a analisar", escolha associação e dissociação. Para o "Modelo", selecione 01:01. Nota: outras opções disponíveis são limitados.
2. Para a "montagem", escolha Global (completa). Para o "Group By", selecione Cor (como no gráfico). Selecione "R _max desvinculado por Sensor" para permitir montagem independente de R _max (resposta de sinal máxima sobre saturando ligação do partner à proteína imobilizada). Nota: fazemos isso para a maioria dos ensaios, como sensores de variar um pouco na quantidade de proteína imobilizada (veja a Figura 3, Loading).
3. Na tabela apresentada, certifique-se todos os vestígios de sensores a serem analisados ​​têm a mesma cor, então eles vão ser analisados ​​como um conjunto global. Se necessário, selecione uma ou mais sensores traça omitir de montagem mundial: na coluna "Incluir", clique com o botão direito sobre a posição do sensor desejado e selecione "Excluir Wells".
4. Clique em "Curvas em forma!" para iniciar a análise de regressão não-linear. Examine os resultados de ajuste, que incluem (i) sobreposição das curvas de regressão com vestígios de dados de sensores (como na Figura 4), ​​(ii) parcelas de resíduos de montagem, e (iii) uma tabela com os valores dos parâmetros determinados (constantes de velocidade, R _max, K _D) e estatísticas (erros padrão para os parâmetros, Qui-quadrado, R ^2).
5. Em "Exportar Dados", salve os resultados ajustados, clicando em "Exportar tabela csv para.". Para graphing ou uma análise mais aprofundada de dados / curvas equipadas com outro software, clique em "Exportar Resultados de montagem" para salvar os dados de cada sensor e curva ajustada em um arquivo de texto.

Ligação em tempo real e da cinética de dissociação BLI são mostrados na Figura 3. Esta experiência foi feita com tampão de ensaio de associação e dissociação. Esta experiência foi iniciada com um passo da linha de base de 10 minutos uma vez que os sensores foram prewet apenas brevemente. Em seguida, ε biotinilado foi carregado sobre os sensores. No dissociação detectável de ε ocorreu em todas as etapas restantes, como visto a partir da curva de referência (G) que não tinha parceiro de ligação acrescentou. Um segundo sensor de referência (H) era desprovida de proteína imobilizada e mostrou baixa ligação não específica do parceiro de ligação. Várias concentrações de F ₁ (-ε) foram usados ​​no passo de associação de sensores de AF, a fim de ajustar os resultados globalmente e obter os melhores valores para k _{a, d} k, e K _D. Os resultados foram processados ​​tal como no protocolo, obtendo-se os vestígios de dados (azul) na Figura 4. Neste caso, o sensor de referência traço H foi subtraída da amostra trases para corrigir a ligação não específica do sócio e sinal do sistema de ligação deriva. Na etapa de análise de dados, todas as curvas eram globalmente em forma com um modelo de 1:1 _(um único k, único k _d), o "Global (completa)" ajuste assume dissociação completa do parceiro de ligação (sinal voltará a zero no infinito tempo) (Figura 4, vermelho). Note-se que, para as duas concentrações mais elevadas de F ₁ (-ε), há pequenos mas significativos os desvios dos dados a partir de a, 1:1 modelo global. Foram usados ​​baixos níveis de ligando imobilizado (biotinilado subunidade "ε"), e o ajuste não foi melhorada pela inclusão de um factor de transporte de massa do modelo (não representado). No entanto, F ₁ (- "ε") é um grande complexo (~ 350 kDa), e outras experiências (não mostrados) sugere que esses desvios são devidos à reduzida acessibilidade de ligação de uma fracção de ligando imobilizado, isto é, um F ₁ ligado a um "ε" pode estericamente dificultar o acesso a outro biotinilado"Ε" obrigado na mesma tetramer estreptavidina.

A Figura 5 mostra uma experiência diferente no qual a enzima foi ligado ao sensor imobilizado ε na presença de 1 mM de ATP / EDTA; que predispõe a maioria F ₁ / complexos "ε" de assumir a conformação noninhibitory, que se dissocia facilmente ^8. Os sensores foram então transferidas para a dissociação poços contendo tampão de ensaio com diferentes ligandos. Isto demonstra os efeitos de diferentes ligantes na conformação de ε. Por exemplo, a exposição a MgADP / Pi diminuiu drasticamente dissociação net, indicando que ε deslocou à conformação, estado inibitório firmemente amarrado. Cinética de dissociação complexos foram observados desde diferentes ligantes causado diferentes turnos na fração de F _1. Complexos ε com ε nos (nondissociable) conformações ativas (dissociáveis) ou inibidoras. É também possível que as alterações conformacionais significativas de proteínas ligadascontribuir diretamente para alterações no sinal BLI, mas, em nossos estudos, este parece ser insignificante em comparação com o sinal para a ligação / dissociação do grande complexo F ₁ (ver Shah et al ^8, Figura 5D;. transição para as curvas 3 e 6 mostram comportamento muito semelhante, embora suas condições favorecem conformações distintas de F bound _1). O software de análise de dados não foi projetado para tais cinética de dissociação complexos. Assim, nós exportamos os dados em arquivos de texto para a análise de regressão não linear com outro software.

Figura 1. Princípios de Bio-camada Interferometria. Animação resume a física subjacente para a detecção de interação biomolecular por BLI. A luz que passa através das sondas é reflectida de volta para os espectrofotómetros (i) a partir da superfície interna do sensor e (ii) a partir do exterior emterface do sensor com a solução amostra. Isto resulta num padrão de interferência. A ligação de moléculas de superfície do sensor muda o padrão de interferência. Este podem ser plotados como uma mudança nanômetros de intensidade relativa vs comprimento de onda. Monitorando essa mudança nanômetros ao longo do tempo fornece cinética de ligação e de dissociação. Gráficos são adaptados com permissão de FortéBio ^12.

Figura 2. Arranjo esquemático de amostras da placa de amostragem de 96 poços. Os sensores serão movidas em paralelo a partir de coluna para coluna e pode ser movido para a esquerda ou para a direita, tal como definido no protocolo de ensaio particular. Wells com cor cinza representam tampão de ensaio enquanto vermelho, azul e verde representam proteína imobilizada, sócio e liga ligaçãoNDS, respectivamente.

Captura de tela Figura 3. Mostrando dados brutos de um ensaio BLI. Linhas vermelhas verticais indicam movimento de sensores entre as etapas de análise de protocolo. Passo tipos são indicados na imagem. Locais de tampão e as amostras são como mostrado na Figura 2. Como observado por números na parte superior do gráfico, sensores revestidos com estreptavidina foram transferidos entre diferentes colunas da placa de amostra, na seguinte ordem: 123.454. A legenda abaixo do gráfico indica a cor de rastreio de dados de cada sensor. No carregar passo, cada sensor excepto H foi incubado com 50 nM biotinilado subunidade "ε". No passo de associação, sensores foram incubadas com concentrações nM de "ε" empobrecido F _1: 30 (A, H), 20 (B), 15 (C), 10 (D), 5 (E), 2.5 (F), 0 nM (G). Clique aqui para ver imagem ampliada.

Captura Figura 4. Tela dos dados analisados ​​a partir do ensaio de BLI da Figura 3. Os dados foram processados ​​e montado como descrito no texto. Apenas os passos de associação e dissociação são mostrados, dividida por uma linha vertical vermelha. As curvas de dados processados ​​são azuis, a regressão não-linear se encaixa de 1:1 análise global são mostradas em vermelho. Resultados da adaptação globais ^8: k _a = 2 x 10 ⁵ m ^-1 s ^-1 (± 0,1%), K _d = 4,8 x 10 ^-5 s ^-1 ("±" 0,1%), obtendo-se K _D = 0,24 nM. Bondade de ajuste: R² = 0,999054. O parâmetro de ligação máxima (R _max) estava apto separadamente para cada sensor, com valor médio = 0,813 nm ("±" 0.0803). Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 5. Resultados de um ensaio de BLI mostrando efeitos alostéricos de ligantes na conformação de ε. F ₁ (-ε) foi ligado ao sensor de ε imobilizada na presença de ATP 1 mM / EDTA. O fim da fase de associação e uma porção da fase de dissociação são mostrados. Durante a etapa de dissociação, ligantes diferentes para F ₁ sítios catalíticos (listados para cada traço) foram incluídos para observar seus efeitos alostéricos na dissociação de F ₁ de ε-bound sensor.

Instrumentos actualmente disponíveis para BLI permitir a produção e flexibilidade significativa nos ensaios para interacções biomoleculares. Várias amostras de solução são dispensados ​​em poços de uma placa de microtitulação preto, e um conjunto de sensores BLI paralelas são programados para se mover para trás e para a frente entre as colunas de poços na placa. As amostras são agitadas por agitação orbital durante todo o ensaio. O sistema utilizado aqui tem oito sensores e usa uma placa de amostras de 96 cavidades, mas um outro sistema utiliza sensores 16 e uma placa de amostra de 384 poços. Assim, a interacção entre uma biomolécula imobilizada-sensor e o seu parceiro de ligação em solução pode ser testada sob diferentes condições, com vários sensores em paralelo. Por exemplo, no primeiro ensaio aqui apresentado com a subunidade ε inibitório imobilizado, as interacções foram medidos com seis concentrações diferentes de enzima (parceiro de ligação) em paralelo (Figuras 3 e 4). Isso permitiu uma análise global a determinaçãone um único par de constantes de velocidade (k _a, k _d) para a rede de ligação e de dissociação, e, portanto, uma constante de equilíbrio de dissociação (K _D = K _d / K _a), o que concorda estreitamente com a constante de inibição _(Ki) determinadas a partir de ensaios em solução de inibição da enzima pelo ε ^8. Um segundo tipo de experiência (Figura 5) demonstraram que o BLI pode também monitorizar os efeitos alostéricos de pequenos ligantes sobre as interacções entre duas proteínas, os efeitos de diferentes ligandos foram comparadas em paralelo. Não há limitações para efeitos de ligandos alosticos detectar, uma vez que o sinal BLI depende da massa da molécula de ligação, e pode detectar directamente a ligação de compostos pequenos sob condições optimizadas ^13. No entanto, no ensaio da Figura 5, o parceiro de ligação, F _1, era um grande complexo de proteína (~ 347 kDa), de modo que o sinal de BLI para a sua ligação / dissociação não foi significativamente afectada pelo anúnciocional de ligação de pequenos ligandos, tais como ATP (~ 500 Da) no complexo F _1. Isto foi confirmado com a dosagem na qual estes ligandos não afectam o sinal BLI por F ₁ ligado a uma forma truncada da ε falta o inibidor CTD ^8. Assim, os ensaios de efeitos alostéricos deve considerar a massa do alostérico ligando em relação às massas das proteínas que interagem com, e de preferência incluem controlos para testar a resposta directa BLI para a ligação do ligando.

Note-se que determinadas etapas e modificações no protocolo experimental pode ser fundamental para alcançar melhores resultados e análise mais acurada. Por exemplo, como no protocolo aqui descrito (ver passos 1.2.3, 1.2.5), o ensaio destina-se a análise global de constantes de velocidade de dissociação de ligação e devem incluir um passo adicional de linha de base (ver o passo 1.2.3), em uma nova coluna de poços tampão (Figura 2, coluna 4), ​​antes do passo de associação, e os sensores devem ser returned à mesma coluna de poços de buffer para a etapa de dissociação (veja o passo 1.2.5). Tendo cada um dos sensores no mesmo poço (com as mesmas propriedades ópticas) antes e após o passo de associação pode melhorar a correcção de inter-passo (passo 3.4) para as etapas de associação / dissociação, e isto facilita a instalação cinética global de vários vestígios de dados (como nas Figura 4). Além disso, para os ensaios que são mais preliminar do que mostrado aqui, o programa tem uma opção para encurtar ou prolongar o tempo de qualquer passo durante o ensaio (embora seja o passo ativo). Isso é útil, por exemplo, se o sinal de carga ideal já não é conhecido, ou se é necessário mais tempo para permitir a dissociação suficiente para conseguir um bom ajuste para a taxa de dissociação.

A ligação não específica do parceiro de ligação à superfície do sensor pode ser um problema para os métodos livre do rótulo como SPR e BLI. Nos nossos testes, este foi eficazmente minimizado pela inclusão de BSA em tampão de ensaio. Tal como em imunotransfprotocolos ting, excepto BSA proteínas podem ser utilizadas, e baixas concentrações de detergente também pode minimizar a ligação não específica (Tween 20 é usado em tampão cinética do fornecedor). Mesmo com o mínimo de ligação não especifica, a maioria dos ensaios devem incluir, pelo menos, um sensor de controlo sem proteína imobilizada, mas com a maior concentração do agente de ligação no passo Association (ver Figura 3, o sensor H); subtracção da ligação não específica residual (e a sua deterioração durante a a etapa de dissociação) pode melhorar significativamente as análises cinética para a ligação / dissociação específico que está sendo estudado. Por outro lado, uma vez que os ensaios iniciais confirmam que a proteína biotinilada permanece estavelmente ligado depois de o carregar passo (ver Figura 3, o sensor de L), que o controlo pode ser omitido, e que o sensor pode ser utilizado para uma condição de amostra.

Para a determinação robusto de associação e dissociação constantes de velocidade usando BLI, vários concentrações de bparceiro NCERRAMENTO deve ser usado e todos os vestígios de dados deverá ser ajustada pela análise global, se possível (como nas Figuras 3 e 4). Idealmente, a gama de concentrações deverão abranger ~ 10 vezes acima e abaixo do K _D estimada. No nosso caso, com uma interacção de alta afinidade (K _D = 0,25 nM), o ruído de sinal-para-era deficiente para a cinética de ligação com concentrações sub-K _D. Assim, foram utilizadas as concentrações de parceiro de ligação acima do K _D de tal forma que as alterações significativas nas taxas e os níveis de ligação observados foram obtidos (ver Figura 3). Além disso, um passo de dissociação longa foi utilizado para melhorar a confiança na montagem da taxa de dissociação lenta. Com interacções de elevada afinidade, é também possível que a dissociação lenta é exagerado por religação, durante o passo de dissociação, desde ensaios BLI é feito numa amostra agitada em vez de fluxo contínuo ao longo do sensor, como por SPR. Este artefacto potencial pode ser testado com adiz em que o tampão de dissociação contém um "sumidouro" de excesso de proteína que se liga competitiva parceiro de ligação indissociável e impede que esta religação à proteína imobilizada-sensor ^14. No nosso sistema, o que foi feito, comparando os resultados com e sem nonbiotinylated (> 10 vezes acima K _D) na dissociação bem, e nós confirmou que religação não era um problema significativo ^8. Finalmente, se os conjuntos de resultados cinéticos não se encaixam bem por análise global (01:01 ou 02:01 modelos disponíveis), há outras opções de análise para resolução de problemas. Por exemplo, em vez de escolher "global (total)" (no passo 4.2), "local" pode ser escolhida para se adaptar a cada traço do sensor de forma independente. Se ligação segue um modelo 1:01 simples, traçando as taxas de ligação observados (k _obs) vs as concentrações de ligação parceiro deve mostrar uma dependência linear, com a inclinação igual à taxa de ligação de segunda ordem, intrínseco. A guia Análise do software tem um "XYgráfico "janela que permite a visualização rápida desse relacionamento.

Uma limitação do instrumento que é utilizado o intervalo de temperatura disponível. Com uma faixa de 2 ° C acima da temperatura ambiente a 40 º C, apenas as moléculas que são estáveis ​​nesse intervalo pode ser utilizado. Por outro lado, a análise termodinâmica é limitada pela gama de temperaturas estreita. Outra limitação geral é que o tempo máximo de ensaio é de aproximadamente 4 horas, após este, artefactos desenvolver devido à evaporação de amostras a partir da placa de microtitulação aberta.

BLI envolve um arranjo relativamente simples em comparação com SPR. Os sensores são deslocadas entre as colunas de poços com volumes fixos, em vez de um fluxo constante de amostra sobre o sensor. Apesar de não ser tão sensível quanto a SPR, BLI é menos afetado por mudanças no índice de refração devido a mudanças na composição da amostra. No geral, com essa relativa facilidade de uso e flexibilidade do instrumento na mudança entre as condições de ensaio, BLI fornecersa ferramenta versátil para ensaios in vitro de interações biomoleculares.

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

Agradecemos FortéBio para fornecer gráficos utilizados na Figura 1. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder GM083088 para DTM