Assessment of Vascular regeneração no SNC Usando o rato Retina

A retina de roedores tem sido reconhecida como uma janela de acesso para o cérebro. Neste documento técnico que proporcionam um protocolo que utiliza o modelo de ratinho de retinopatia induzida por oxigénio para estudar os mecanismos que levam à insuficiência de regeneração vascular dentro do sistema nervoso central após a lesão isquémica. O sistema descrito também pode ser aproveitada para explorar estratégias para promover o crescimento de vasos sanguíneos funcionais dentro da retina e do SNC.

A retina roedor é, talvez, o sistema de mamífero mais acessível que a investigar interacção neurovascular dentro do sistema nervoso central (SNC). É cada vez mais reconhecido que várias doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, esclerose múltipla e esclerose lateral amiotrófica apresentam elementos de comprometimento vascular. Além disso, as causas mais importantes de cegueira em populações pediátricas e de trabalho idade (retinopatia da prematuridade ea retinopatia diabética, respectivamente) são caracterizadas por degeneração vascular e insuficiência de rebrota vascular fisiológico. O objetivo deste documento técnico é fornecer um protocolo detalhado para estudar a regeneração vascular CNS na retina. O método pode ser utilizado para elucidar os mecanismos moleculares que conduzem à falha de crescimento vascular após lesão isquémica. Além disso, possíveis modalidades terapêuticas para acelerar e restaurar plexos vasculares saudáveis ​​podem ser exploradas. Achados obtained utilizando a abordagem descrita pode fornecer meios terapêuticos para retinopatias isquêmicas, tais como diabetes ou que de prematuridade e possivelmente beneficiar outros distúrbios vasculares do SNC.

Ao longo do desenvolvimento do SNC, nervos, células do sistema imunológico e vasos sanguíneos estabelecer redes notavelmente acoplados para garantir adequada perfusão tecidual e permitir a transmissão de informações sensoriais ^1-5. O colapso dos sistemas vascular resulta na oxigenação dos tecidos ea oferta insuficiente metabólica comprometida e é cada vez mais reconhecida como um importante contribuinte para a patogênese de doenças neurodegenerativas ^6. Abandono vascular e a deterioração da unidade neurovascular dentro do cérebro, por exemplo, está associado com a demência vascular, lesões vasculares da matéria branca do cérebro ⁷ e doença de Alzheimer com estenose de arteríolas e vasos de pequeno calibre ^8. Além disso, a função de barreira vascular prejudicada é pensado para contribuir esclerose múltipla ⁹ e esclerose lateral amiotrófica ^10.

De relevância direta para o modelo de retina descrito neste protocolo, cegandodoenças tais como a retinopatia diabética ¹¹ e retinopatia da prematuridade ^{12, 13} são caracterizados por uma fase de degeneração vascular precoce. O estresse isquêmico que se seguiu na retina neurovascular desencadeia uma segunda fase de neovascularização excessiva e patológica que provavelmente se origina como uma resposta compensatória ao oxigênio restabelecer o fornecimento de energia e ^14-16. Uma estratégia atractiva para superar o stress isquémico que é central para a progressão da doença é o de restaurar redes vasculares funcionais especificamente nas zonas isquêmicas do sistema neuro-retina (Figuras 2 e 3). Provocar uma resposta angiogênico controlado pode vir transversalmente como um contra-senso para uma condição em que os tratamentos anti-angiogênicos, tais como anti-VEGF são considerados tratamentos adaptados. No entanto, a evidência para a validade desta abordagem é montagem. Por exemplo, aumentando a rebrota vascular "fisiológico-like" em ischemretinopatias ic foi elegantemente demonstrado através da introdução de células precursoras endoteliais ^17, a inibição da Müller VEGF expresso de células na supressão induzida de outros fatores angiogênicos ^18, injeção de células progenitoras mielóides ^19, a inibição da NADPH oxidase a apoptose induzida por ^20, aumentando dietético ω-3 fatty poliinsaturados ingestão de ácido ^21, o tratamento com um fragmento do terminal carboxilo do triptofano tRNA ^22, e a administração directa de VEGF ou FGF-2, para a protecção de células gliais ^23. Além disso, foi demonstrado que o modulando pistas de orientação neuronais clássicos, tais como netrinas Semaforinas ou em retinopatias isquêmicas acelera a regeneração vascular de vasos saudáveis ​​dentro da retina e, consequentemente, reduz a angiogénese patológica ^{24, 25.} De relevância clínica direta, vários dos estudos realizados em animais acima mencionados fornecem evidências de que a promoção re vasculargeração durante a fase isquêmica precoce de retinopatias pode reduzir significativamente risco de vista pré-retinal neovascularização ^{19, 23, 24, 26,} provavelmente através da redução da carga isquêmica.

Elaboração de estratégias terapêuticas que estimulam a regeneração dos vasos funcionais continua a ser um desafio significativo para os biólogos vasculares. Aqui nós descrevemos um sistema experimental que utiliza o modelo do rato de retinopatia induzida por oxigênio (OIR), para explorar estratégias para modular a rebrota vascular dentro da retina. Desenvolvido por Smith et al., Em 1994, ^27, este modelo serve como um proxy para retinopatias proliferativas humanos e consiste em expor filhotes P7 rato para 75% O ₂ até P12 e, posteriormente, re-introduzir os filhotes para a sala ambiente O _2-tensão (Figura 1). Este paradigma vagamente imita um cenário onde um bebê prematuro é ventiladocom o O _2. A exposição de filhotes de rato à hiperóxia provoca degeneração dos capilares da retina e microcirculação, e produz uma área reprodutível de vaso-obliteração (VO) normalmente avaliada em saída de O ₂ no P12, embora a área VO máxima é atingida aos 48 hr (P9) após exposição ao O ₂ ^28. No ratinho, as zonas avasculares VO regenerar-se espontaneamente ao longo da semana seguinte re-introdução de ar ambiente e, eventualmente, as zonas de VO são completamente re-vascularização (figura 2). Re-introdução de ar ambiente, de ratinhos submetidos a OIR também provoca neovascularização pré-retinal (NV) (máximo a P17), que é tipicamente avaliada para determinar a eficácia de paradigmas de tratamento anti-angiogénicos. Na sua forma mais pura, o modelo OIR fornece uma ferramenta altamente reprodutível e quantificável para avaliar a degeneração vascular induzida por oxigénio e determinar a extensão da neovascularização destrutiva pré-retiniana ^29-31.

Vários paradigmas de tratamento exploratório que modulam a regeneração vascular CNS pode ser investigado usando o modelo OIR incluindo o uso de compostos farmacológicos, terapia genética, deleção do gene e muito mais. A propensão de uma determinada abordagem para influenciar rebrota vascular é avaliada passo a passo na janela entre P12 (VO máxima após saída da hiperóxia) e P17 (NV máxima). A avaliação dos resultados do tratamento na NV patológico pode ser rapidamente e facilmente determinada em paralelo e foi exaustivamente descrito por Stahl e colegas ^{30, 31.} Aqui nós fornecemos um procedimento simples passo-a-passo para investigar a modulação da revascularização fisiológica dentro da retina neural por compostos farmacológicos, terapêuticos potenciais, vetores virais ou para estudar a influência dos genes candidatos em camundongos transgênicos ou nocaute.

Declaração de Ética: Todos experimentação animal adere as diretrizes de cuidados de animais estabelecidas pela Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) Declaração para o uso de animais em Ophthalmic and Vision Research e pelo Conselho Canadense de Cuidado Animal.

1. Oxigênio Induzida Retinopatia (OIR)

1. Registar a data de nascimento de filhotes de rato como P0.
2. Registre todos os pesos dos animais aquando da entrada em O ₂ para garantir uma faixa de peso adequado. Nota: Para C57BL / 6 ratos em P17, o peso corporal deve variar entre 5 e 7,5 g de NV máxima ^32. A fim de manter a consistência do ambiente, é recomendado o uso da mesma ninhada de controlo (para ratinhos geneticamente modificados, bem como ratinhos que receberam tratamentos experimentais). Ao avaliar os efeitos de um vetor viral, deve-se considerar o tropismo do vírus e dar tempo suficiente para a plena expressão de transgenes por vírus entregues. Rapidamente expressar viralOs vectores, tais como os lentivírus 3 ^ª geração ^{24, 25, 33} são recomendados.
3. Filhotes lugar do mouse no P7 (C57BL / 6 ou desejado tensão) e um CD1 fomentar mãe em uma câmara de oxigênio fixado em 75% O ₂ por 5 dias ^27. Umidade e temperatura ambiental foram mantidas constantes durante toda a exposição O _2. Nota: As instalações de investigação equipados com uma fonte central de O ₂ são ideais e limitar a substituição pesado de O vazio ₂ tanques. Se estiver trabalhando com camundongos transgênicos ou nocaute, é importante para garantir que o controle e os ratos experimental são adquiridos do mesmo fornecedor para limitar desvios genéticos dentro das mesmas cepas ^{30, 29.}
4. Em P12, remover ratinhos a partir da câmara de oxigénio e retornar os animais ao ambiente _de O _2.

2. Injeção intravítrea para entrega de Compostos para o Inner Retina (When avaliar os efeitos de um composto farmacológico ou proteína recombinante)

1. No P14, anestesiar ratos com 2% de isoflurano em oxigênio 2 L / min (ou proteção animal aprovado pelo comitê de anestésico de escolha). A fim de verificar a eficácia da anestesia, sequencialmente beliscar a cauda, ​​pé de trás e da orelha com uma pinça.
2. Posicione o mouse sobre o ventre.
3. Usando uma seringa esterilizada de 10 mL equipado com uma agulha de vidro puxado chanfrada, realizar uma injecção de um volume máximo de 1 ml de solução contendo o composto a ser investigada ou veículo (solução salina fisiológica) no limbo posterior do olho, com um 45 ° ângulo de evitar a lente. Nota: A-agulha de vidro puxado está ligado à seringa utilizando uma gota de epoxi-resina.
4. Aplique uma gota de pomada oftálmica lubrificante (de preferência com antibiótico) com um cotonete para o olho do mouse.
5. Retorne o mouse de volta para a jaula com a promoção mãe. Ratos são, então, cuidadosamente monitorizados até recoberto e totalmente ambulatorial.

3. Avaliação da perfusão navio e função de barreira (Integridade) por Angiofluoresceinografia

1. Anestesiar ratos com isoflurano a 2% em oxigênio 2 L / min (ou proteção animal aprovado pelo comitê de anestésico de escolha). A fim de verificar a eficácia da anestesia, sequencialmente beliscar a cauda, ​​pé de trás e da orelha com uma pinça. Nota: Esta é normalmente realizada no P17 quando a regeneração é avaliada. Também levar a cabo a análise em P19 e P21 para determinar se a integridade vascular é preservada ao longo do tempo.
2. Uma vez anestesiados, pesar o mouse.
3. Faça uma incisão na linha média do abdome com uma tesoura de dissecação. Nota: Os instrumentos de dissecação devem ser regularmente verificados e afiada.
4. Cortar costelas lateralmente e levantar a caixa torácica com o auxílio de uma pinça. Nota: É necessário cortar lateralmente como possível, para evitar danos no coração.
5. Após a remoção peripHeral tecido do coração, prender a aorta descendente com pinça hemostática.
6. Lentamente injetar fluoresceína-dextrano para o ventrículo esquerdo usando uma agulha G 25. Nota: Se a função de barreira vascular é investigado, 70 kDa fluoresceína-dextrano é empregado como ele vai vazar para fora dos vasos quando a integridade dos vasos é comprometida. Se o investigador quer fundido vasos sanguíneos, 2 MDa fluoresceína-dextrano é usado. As etapas críticas: 1) Para garantir uma repartição homogênea, centrífuga fluoresceína-dextrano e injetar o sobrenadante, 2) a fim de evitar a constrição dos vasos, injetar solução de fluoresceína-dextrano aquecido, 3) O seu tempo de circulação não deve excesso de 4 min.
7. Decapitar ratos 2 min após a injeção com uma tesoura de operação.

4. Enucleação e Eye Fixation

Nota: Ao avaliar as taxas de regeneração vascular, primeiro coletar retinas no P12 e, adicionalmente, no P14 e P17. Aumentar o número de ponto de tempo amostrados para determinação mais precisa das taxas de revascularização ^24.

1. Incline a cabeça do rato e colocá-lo de lado.
2. Retire a pele e as pálpebras cobrem os olhos com uma tesoura de dissecação.
3. Coloque uma pinça curva abaixo do olho e puxe-o até que o nervo óptico é cortada.
4. Vire a cabeça do rato para seu outro lado e realizar os mesmos passos (passos 4.2 e 4.3).
5. Para garantir uma melhor penetração do fixador, perfurar um buraco na câmara anterior do olho usando 30 G agulha.
6. Transferir os olhos para um tubo contendo 4% de paraformaldeído (PFA) e fixar durante 1 hora à temperatura ambiente.
7. Remover e lavar os olhos PFA 4 vezes com uma solução de PBS gelado.

5. Dissecção da retina

1. Coloque rato olhos em uma placa de Petri contendo PBS frio e realizar dissecção das retinas sob microscópio estereoscópico.
2. Retire a gordura / tecido extra em torno do olho com micro-dissecção scissors.
3. Corte a córnea com uma tesoura micro-dissecção.
4. O uso de dois pares de pinças, minuciosamente descascar a esclera distância a partir da periferia em direcção ao nervo óptico e descartar.
5. Aperte a lente (bola esbranquiçada abaixo da córnea) com uma pinça e extraí-lo do copo olho. Utilizar um par de pinças, como um apoio, e a outra para agarrar e levantar cuidadosamente e remover a lente.
6. Separar os vasos hialóide da face interna da retina utilizando escovas pequenas (tamanho 0) e uma pinça.
7. Retirar feixes de vasos hialóide ligados ao disco óptico usando uma pinça.
8. Transferência dissecados retinas de dois tubos ml de microcentrífuga contendo PBS e colocar em gelo antes de se iniciar o processo de coloração.

6. Retinal Vascular Coloração

1. Incubar as retinas dissecados durante a noite com agitação suave a 4 ° C em uma solução de fluorescência acoplado a isolectina B4 (rodamina-lectina ou outra) em PBS contendo 1 mM de _CaCl2 (uma diluição de uma solução B4 2 mg / ml isolectina é recomendado 1:100). Durante o procedimento de coloração inteira, cobrir os tubos com folha de alumínio ou uma película opaca para proteger da luz.
2. No dia seguinte, remover a solução de corante e lavar retinas 3x em PBS durante 10 min à temperatura ambiente.

7. Preparação de retina Flatmounts

1. Retinas, do lado fotorreceptor para baixo de transferência, sobre uma lâmina de microscópio e fazer quatro incisões radiais equidistantes profundas utilizando um bisturi cirúrgico para dividir a retina em quatro quadrantes de igual tamanho. Durante as incisões, a cinta da retina, com uma escova, de modo que ele não se mova.
2. Usando duas escovas embebidas em PBS, alise cuidadosamente a quadrantes fotorreceptor side-down e mergulhe a retina em meio de montagem para evitar a foto-branqueamento. Em seguida, coloque cuidadosamente uma lamela sobre a superfície da retina montado sem a aplicação de pressão e garantir que as bolhas de ar não se acumulam sob a lamínula.

8. Imagem e Quantificação de Vasoobliteration (VO) e neovascularização (NV), como descrito anteriormente ³¹

1. Tire fotos de retinas inteiras montado com um microscópio de epi-fluorescência com uma ampliação de 10x.
2. Abra a imagem da retina em software de edição de fotos, unir e medir a área total da retina, ea área avascular. Área pode ser expressa em pixels.
3. Determinar a extensão de VO, dividindo o número de pixels na área avascular pelo número de pixels na área total da retina.
4. Determinar a extensão da NV-se dividindo o número de pixels de NV pelo número de pixels na área total da retina, tal como descrito ^31.

O modelo OIR é amplamente utilizada para estudar a degeneração vascular induzida por oxigênio e neovascularização patológica induzida por isquemia na retina e tem sido fundamental para o desenvolvimento de tratamentos atualmente empregados anti-angiogênicos para doenças oculares ^{27, 29, 30.} Os resultados obtidos com este modelo pode ser vagamente extrapolados para retinopatias isquêmicas, como a retinopatia diabética proliferativa e retinopatia da prematuridade ^30.

Aqui apresentamos uma alternativa de uso deste modelo para estudar a regeneração vascular. Vamos descrever um exemplo de uma estratégia para regenerar a retina isquêmica, que foi recentemente publicado pelo nosso laboratório. No estudo apresentado, demonstramos que a isquemia neuronal sustentado ativa retículo endoplasmático (ER) estresse e através de um dos seus Endorribonucleases efetoras IRE1α, cliva o mRNA do clássico neuronal sugestão orientação netrin-1. Nós mostramosque a entrega intra-ocular do Netrin-1, estimula um programa de angiogénese reparadora em células mielóides da retina e, assim, acelera a revascularização do tecido neural após OIR ^25. Além disso, oferecemos um exemplo de regeneração vascular acelerado usando lentiviral mediada silenciamento de IRE1α.

Os paradigmas experimentais descritos pode ser modificado para investigar o tratamento exploratório de escolha. Importante, a ponto de tempo de injecção intravítrea é determinada em função da natureza do composto e explorado deve tomar em consideração o mecanismo pelo qual o tratamento investigados actua. Por exemplo, para estudar um composto farmacológico (agonista do receptor, antagonista, etc), P14 pode ser selecionado como corresponde a um ponto no tempo em que a revascularização da retina está acelerando ainda uma intervenção de ação rápida pode ajudar a acelerar a taxa de revascularização (Figuras 2 e 3-A). Quando os vectores virais sãoempregue, tempo suficiente deve ser colocado para permitir a expressão máxima do gene passageiro e um ponto temporal anterior pode ser seleccionada para garantir a total expressão do transgene, ou silenciamento completa do gene alvo (Figura 4). Lentivirais baseados são particularmente adequados a este respeito, devido à sua expressão rápida, baixa resposta inflamatória e facilidade de produção ^{24, 25.} É também fundamental para assegurar que o gene alvo é entregue para a população de células da retina apropriado (RGC, célula endotelial, célula Müller, etc), portanto, o tropismo do vector viral seleccionado deve ser considerado. Alternativamente, a estudar o papel de um gene na regeneração vascular utilizando animais transgénicos ou knockout oferece a vantagem de não necessitar de realizar injecções intra-oculares.

Figura 1. Representação esquemática do modelo OIR mouse. Filhotes rato e lactantes estão expostos a 75% O ₂ de P7 a P12. A câmara de oxigênio ventilado com constante O ₂ entrega e oxímetro é necessária. Durante este período inicial, ocorre retina vaso-obliteração. Em P12, os ratos são devolvidos ao ar ambiente (21% de O ₂₎ até P17 quando ocorre máxima tufos pré-patológica da retina. A neovascularização retrocede ao longo dos dias seguintes. O período ideal para investigar a regeneração vascular é a janela entre P12 e P17. Amostragem e avaliação de vários pontos de tempo para extensão do vaso-obliteração é a chave para elucidar as taxas precisas de revascularização.

Figura 2. Claro Tempo de revascularização retina seguinte vaso-oblite induzida por oxigênioração. A) representação gráfica de um procedimento flatmounting da retina. Uma incisão é feita pela parte superior da córnea (cúpula em preto-cinza) e esclera (linhas vermelhas pontilhadas) ea retina é provocado fora. A lente pode ser extraídos após a abertura da córnea / esclerótica ou uma vez a esclerótica é removido, como mostrado no diagrama. Vasos hialóide são então removidas e coloração dos vasos da retina realizados. Uma vez que o protocolo de coloração está terminado, a retina é então cortada em quatro secções igualmente espaçadas e montado sobre uma lâmina de microscópio vaso do lado do plano. B) retinas flatmount Lectina-corados de ratinhos submetidos a OIR. Como vasos regenerar, a área de vaso-obliteração (aqui máxima no P12) enche dentro neovascularização patológica é máxima em P17 e surge como manchas saturadas em lectina coradas retinas Oir. Ao P19-P21, retinas já totalmente regenerado suas redes vasculares. (Esta figura foi modificada de Binet et al. Cell Metabolism 2013 ²⁵⁾

. Figura 3 Exemplo de um tratamento injectável que acelera a regeneração vascular da retina: Netrin-1. A) Netrin-1 é injectada a P14 ea extensão de recrescimento vasculares avaliados no P17. Observa-se um aumento dependente da dose na regeneração vascular. Integridade B) vascular pode ser avaliado através de perfusão com um baixo peso molecular fluorescentes dextrano. Se vasos mostrar a função de barreira comprometida, o dextrano fluorescente irá vazar no exterior do recipiente (setas). (Esta figura foi modificada de Binet et al. Cell Metabolism 2013 ²⁵⁾

Figura 4. Exemplo de silenciamento de genes wiª lentiviral entregue shRNAs para a regeneração vascular da retina:. Lv.shIRE1α Para avaliar a capacidade de silenciamento gênico de IRE1α nos neurônios ganglionares da retina para ajudar a regeneração vascular, uma injeção intravítrea de uma codificação para um lentivírus shIRE1α foi injetado no P3 para que haja tempo suficiente para o silenciamento do gene, quando o crescimento vascular e vaso-obliteração é avaliada. O lentivírus 3 ^ª geração empregue neste exemplo contem uma glicoproteína do vírus da estomatite vesicular modificado (VSV-G), concebidos para visar as membranas plasmáticas. Embora estes vectores eficazmente infectar as células ganglionares da retina, a expressão também pode ser observado em outros tipos celulares locais. (A) Este tratamento não conduziu a variações notáveis ​​no induzida por oxigénio vaso-obliteração, determinada a P12, o que significa que todos os benefícios observados no vaso-obliteração medidos em pontos de tempo posteriores são devidas a um aumento da regeneração vascular. (B) Inibição da IRE1α in este paradigma melhorado dramaticamente a regeneração vascular na fase de rebrota da OIR em P17. (Esta figura foi modificada de Binet et al. Cell Metabolism 2013 ²⁵⁾ (C) Avaliar um ponto terceira vez de vaso-obliteração, como P14, é necessário para determinar as taxas precisas de revascularização. (Esta figura foi modificada de Joyal et al. Sangue 2011 ²⁴⁾ Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Qual é a maneira mais eficaz de estimular o crescimento de novos vasos saudáveis ​​no tecido nervoso isquêmico? É terapeuticamente válida para interferir e acelerar ocorrem naturalmente rebrota vascular? Em patologias neuro-isquêmica, como retinopatias isquêmicas ou acidente vascular cerebral, degeneração vascular está associado à redução da função neuronal ^35-38. Daí para combater lesão precoce, restabelecendo micro-circulação regional durante o segmento de imediato / precoce da doença pode ser benéfico. Em um contexto ocular, paradigmas experimentais que aceleram a revascularização da retina isquêmica reduzir a neovascularização patológica ^{21-25, 34} e, portanto, esta abordagem merece uma investigação mais aprofundada.

Desde a sua introdução, há 20 anos, a ^{27 de} modelo OIR revolucionou pesquisa da angiogênese da retina ^30. Aqui nós fornecemos uma aplicação adicional para este modelo para estudar strat prospectivogias para modular a regeneração fisiológica vascular na retina isquémica. Um modelo animal ideal deve englobar vários critérios, tais como a proximidade de fisiopatologia humana, alta reprodutibilidade, execução rápida e de preferência, de baixo custo. O modelo do rato da OIR atende a todos esses critérios e pode ser carregado-out em menos de 3 semanas.

Apesar dos inúmeros benefícios listados, desvantagens incluem a necessidade atual de sacrificar o mouse antes de análises e acompanhamento longitudinal, portanto, precisa de um animal ainda não é possível com ferramentas de imagem atuais. Atualmente, nas técnicas de imagem, como vivo outubro ou angiofluoresceinografia são em grande parte mal sucedido devido à limitação inerente óptico do olho do rato (raio de curvatura e tamanho pequeno), que reduz a cobertura de imagem ³⁹ para as regiões mais centrais da retina que não são relevantes para as primeiras fases do modelo.

Quando empregada para estudar a regeneração vascular como pROPOSTA neste trabalho de protocolo, todas as considerações que se aplicam ao estudo neovascularização também devem ser monitorados. Estes incluem a gravação de peso do animal para estimar a saúde metabólica do filhote, que influencia fortemente a angiogênese ^32. O controle preciso da tensão de oxigênio na câmara hiperóxico também é crítica. Variação da concentração de oxigênio tem um impacto direto sobre vasoobliteration, que pode inevitavelmente levar a erros de interpretação de dados críticos. Portanto, é recomendável que quer implementar o monitoramento eletrônico contínuo da concentração de oxigênio câmara ou, no mínimo, monitorar as mudanças diárias nos níveis de oxigênio e limitar oxycycler abertura da porta para manter os níveis de oxigênio constantes. Processamento otimizado de retinas também requer prática. Extração, montagem e coloração da retina deve ser executado com cuidado, pois a relativamente frágil retina deve ser delicadamente tratado. Além disso, como para toda a experimentação com animais geneticamente modificados, a deriva genética de uma colónia cum resultados confundir. Na ausência de uma força selectiva (de uma colónia rato, por exemplo), a alélica ou deriva genética é um processo aleatório que podem levar a grandes alterações na população ao longo de um curto período de tempo. As frequências alélicas podem mudar de geração para geração, resultando na formação de um sub-colónia ^{40, 41.} Estas mutações são amplamente indetectável e é, portanto, importante para limitar o número de gerações produzidas pelos mesmos pares de matrizes da mesma colónia. A maneira mais eficiente de atingir a maior estabilidade genética é atualizar "stocks" a cada cinco gerações ou prosseguir para retrocruzamento com um mouse comprado de fundo idênticas.

Também é recomendado para testar mutações degeneração da retina (rd) 1 e 8 ^{de 42,} pelo menos uma vez antes de iniciar uma nova linha, a fim de evitar confundir fenótipos que podem ser atribuídos a prematura degeneração de fotorreceptores. Para os animais transgênicos,é vital para garantir que tanto o controle e ratos mutantes são obtidos a partir do mesmo fornecedor e estão necessariamente no mesmo fundo genético.

À medida que continuamos a elucidar os mecanismos moleculares da formação de vasos sanguíneos e de crescimento, novas abordagens para acelerar, lento, ou orientar os vasos sanguíneos nascentes estão surgindo. Um sistema de modelo em que a modulação da vascularização pode ser explorada in vivo em um contexto patológico pode proporcionar uma ferramenta valiosa para explorar paradigmas terapêuticos potenciais para contrariar isquemia neuronal no SNC. Adaptar o modelo OIR rato para estudar a regeneração vascular fornece tal local e continuará a ser uma ferramenta valiosa para promover nossa compreensão da base molecular para a angiogênese fisiológica e patológica.

Os autores não têm nada a revelar.

PS tem um Canada Research Chair em Biologia Celular da retina e do Instituto de Pesquisa Alcon New Investigator Award. Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (221.478), a Canadian Diabetes Association (OG-3-11-3329-PS), Ciências Naturais e do Conselho de Pesquisa do Canadá Engenharia (418637) e A Fundação Fighting Blindness Canadá. O suporte também foi fornecido pelo Réseau de Recherche en Santé de la Visão du Québec.