تقييم الأوعية الدموية التجديد في الجهاز العصبي المركزي عن طريق الماوس الشبكية

منذ فترة طويلة معترف بها شبكية العين القوارض باعتبارها نافذة للوصول إلى الدماغ. في هذه الورقة التقنية التي نقدمها البروتوكول الذي يستخدم نموذج الفأر من اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين لدراسة الآليات التي تؤدي إلى فشل تجديد الأوعية الدموية داخل الجهاز العصبي المركزي بعد الإصابة الدماغية. ويمكن أيضا وصف النظام تسخيرها لاستكشاف استراتيجيات لتعزيز إعادة نمو الأوعية الدموية وظيفية داخل شبكية العين والجهاز العصبي المركزي.

شبكية العين القوارض وربما كان النظام في متناول معظم الثدييات التي للتحقيق التفاعل وعائية عصبية في الجهاز العصبي المركزي (CNS). يتزايد الاعتراف بأن العديد من الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر والتصلب المتعدد، وعناصر التصلب الوحشي الضموري الحالية للتسوية الأوعية الدموية. بالإضافة إلى ذلك، تتميز أبرز أسباب العمى في السكان في سن العمل للأطفال و(اعتلال الشبكية الخداج واعتلال الشبكية السكري، على التوالي) من خلال تنكس الأوعية الدموية وفشل الفسيولوجية إعادة نمو الأوعية الدموية. الهدف من هذه الورقة التقنية هو توفير بروتوكول مفصلة لدراسة الجهاز العصبي المركزي الأوعية الدموية في شبكية العين التجديد. طريقة يمكن استخدامها لتوضيح الآليات الجزيئية التي تؤدي إلى فشل نمو الأوعية الدموية بعد الإصابة الدماغية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استكشاف طرائق العلاجية المحتملة لتسريع واستعادة الضفائر الأوعية الدموية صحية. النتائج obtaineد باستخدام النهج المبين قد توفر السبل العلاجية لretinopathies الدماغية مثل مرض السكري أو أن الخداج وربما تستفيد اضطرابات الأوعية الدموية الأخرى في الجهاز العصبي المركزي.

خلال مراحل تطوره العصبي المركزي والأعصاب والخلايا المناعية والأوعية الدموية بشكل ملحوظ إلى جانب إنشاء شبكات لضمان نضح الأنسجة كافية وتسمح نقل المعلومات الحسية ^1-5. يتم التعرف على نتائج انهيار النظم الأوعية الدموية في الأنسجة الأوكسجين غير كافية والعرض الأيضي للخطر وبشكل متزايد باعتبارها مساهما هاما في التسبب في أمراض الاعصاب ^6. التسرب الأوعية الدموية وتدهور وحدة وعائية عصبية في الدماغ، على سبيل المثال، يرتبط الخرف الوعائي، والآفات الوعائية من المادة البيضاء في الدماغ ⁷ ومرض الزهايمر مع تضيق في الشرايين والأوعية الصغيرة ^8. بالإضافة إلى ذلك، يعتقد اختلال وظيفة الحاجز الوعائي للمساهمة التصلب المتعدد ⁹ وتصلب الأنسجة العضلية الجانبية ^10.

صلة مباشرة لنموذج الشبكية الموصوفة في هذا البروتوكول، والمسببة للعمىأمراض مثل اعتلال الشبكية السكري واعتلال الشبكية ¹¹ من ^{12 الخداج،} وتتميز من خلال ¹³ مرحلة من أوائل تنكس الأوعية الدموية. الإجهاد الدماغية التي تلت ذلك على شبكية العين وعائية عصبية يتسبب في المرحلة الثانية من اتساع الأوعية الدموية المفرطة والمرضية التي من المرجح ينشأ كرد فعل التعويضية للأوكسجين بإعادة العمل وإمدادات الطاقة ^14-16. استراتيجية جذابة للتغلب على الإجهاد الدماغية التي أمر أساسي لتطور المرض هو استعادة شبكات الأوعية الدموية الوظيفية بشكل خاص في المناطق الدماغية من العصبية الشبكية (الشكلين 2 و 3). تثير استجابة عائية تسيطر قد تأتي عبر وغير بديهية للحالة يكون فيها العلاجات المضادة للعائية مثل مكافحة VEGFs تعتبر العلاجات تكييفها. حتى الآن، والدليل على صحة هذا النهج هو في تصاعد مستمر. على سبيل المثال، وتعزيز "الفسيولوجية مثل" إعادة نمو الأوعية الدموية في ischemوقد تجلى retinopathies جيم بأناقة من خلال إدخال الخلايا البطانية السلائف ^17، وتثبيط VEGF-مولر أعرب خلية downregulation الناجم عن عوامل أخرى عائية ^18، حقن الأسلاف النخاعي ^19، وتثبيط NADPH أوكسيديز يسببها موت الخلايا المبرمج ^20، وزيادة الغذائية ω-3 الدهنية غير المشبعة تناول حمض ^21، والمعاملة مع شظية-الكربوكسيل الطرفية من التربتوفان الحمض الريبي النووي النقال مخلقة ^22، والإدارة المباشرة للVEGF أو FGF-2 لحماية الخلايا الدبقية ^23. علاوة على ذلك، لقد أثبتنا أن تحوير الكلاسيكية العظة التوجيه العصبية مثل Semaphorins أو Netrins في retinopathies الدماغية الوعائية يسرع تجديد الأوعية صحية داخل شبكية العين والأوعية الدموية يقلل المرضية ^{24 و 25} بالتالي. من الأهمية السريرية المباشرة، فإن العديد من الدراسات على الحيوانات المذكورة أعلاه توفر أدلة على أن تعزيز إعادة الأوعية الدمويةالجيل خلال المرحلة الأولى من retinopathies الدماغية يمكن أن تقلل إلى حد كبير التي تهدد البصر اتساع الأوعية الدموية في شبكية العين قبل ^{19، 23، 24، 26،} من المحتمل من خلال الحد من عبء الدماغية.

وضع الاستراتيجيات العلاجية التي تحفز تجديد السفن وظيفية لا يزال يشكل تحديا كبيرا للعلماء البيولوجيا الوعائية. نحن هنا تصف نظام التجريبية التي توظف نموذج الفأر من اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين (OIR) لاستكشاف استراتيجيات لإعادة نمو الأوعية الدموية تعدل داخل شبكية العين. التي وضعتها سميث وآخرون في عام 1994 ^27، ويقدم هذا النموذج كبديل لretinopathies التكاثري الإنسان ويتكون من تعريض الجراء P7 الماوس إلى 75٪ O ₂ حتى P12 ثم إعادة إدخال الجراء إلى الغرفة المحيطة O ₂ التوتر (الشكل 1). هذا النموذج يحاكي سيناريو فضفاضة حيث التهوية الرضع والخدج مع O _2. تعرض الجراء الماوس لفرط التأكسج يثير تنكس الشبكية والأوعية الدموية الدقيقة الشعيرات الدموية، وتعطي المجال استنساخه من الوعاء-الطمس (VO) المقررة عادة عند الخروج من O ₂ في P12، على الرغم من أن يتم التوصل منطقة VO القصوى في 48 ساعة (P9) بعد التعرض لO ₂ ^28. في الماوس، ومناطق VO اوعائي تجديد بصورة تلقائية على مدار الأسبوع التالي لإعادة إدخال هواء الغرفة والمناطق في نهاية المطاف VO يتم الانتهاء من إعادة أوعية دموية (الشكل 2). إعادة مقدمة لهواء الغرفة من الفئران تعرض لOIR أيضا يثير اتساع الأوعية الدموية في شبكية العين قبل (NV) (القصوى في P17) أن يتم تقييم عادة لتحديد مدى فعالية العلاج المضاد للنماذج عائية. في أنقى صورها، ويقدم نموذج OIR أداة تكرار للغاية وقابلة للقياس لتقييم الأوكسجين الناجم عن تنكس الأوعية الدموية وتحديد مدى اتساع الأوعية الدموية المدمرة قبل الشبكية ^29-31.

ق ق = "jove_content"> مختلف نماذج العلاج الاستكشافية التي تعدل الجهاز العصبي المركزي الأوعية الدموية التجديد يمكن التحقيق باستخدام نموذج OIR بما في ذلك استخدام المركبات الدوائية، والعلاج الجيني، حذف الجينات وأكثر من ذلك. الميل لنهج معين للتأثير على إعادة نمو الأوعية الدموية ويتم تقييم تدريجي في الإطار بين P12 (VO القصوى بعد الخروج من فرط التأكسج) وP17 (NV القصوى). تقييم نتائج العلاج على NV المرضية يمكن بسرعة وبسهولة تحديد بالتوازي ولقد وصفت بدقة من قبل ستال وزملاؤه ^{30، 31.} هنا نقدم خطوة بخطوة إجراء بسيط للتحقيق في التشكيل من عودة التوعي الفسيولوجية داخل الشبكية العصبية بواسطة مركبات الدوائية، المداواة المحتملين، ناقلات فيروسية أو لدراسة تأثير الجينات المعدلة وراثيا أو مرشح في خروج المغلوب الفئران.

بيان الأخلاق: جميع التجارب على الحيوانات تلتزم المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان التي وضعتها جمعية للبحوث في مجال طب العيون والرؤية (ARVO) بيان لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية والمجلس الكندي للرعاية الحيوان.

1. الأكسجين المستحثة اعتلال الشبكية (OIR)

1. تاريخ سجل ولادة الجراء الماوس كما P0.
2. تسجيل جميع أوزان الحيوانات عند الدخول إلى O ₂ لضمان وجود نطاق الوزن الكافي. ملاحظة: للحصول على C57BL / 6 الفئران في P17، يجب وزن الجسم تتراوح بين 5 و 7.5 غرام للNV القصوى ^32. من أجل الحفاظ على الاتساق البيئي، فمن المستحسن استخدام تتزاحم عن السيطرة (على الفئران المعدلة وراثيا، وكذلك الفئران تلقي علاجات تجريبية). عند تقييم الآثار المترتبة على ناقلات فيروسية، لا بد من النظر tropism من الفيروسات وإتاحة الوقت الكافي للتعبير كاملة من الجينات المحورة تسليم فيروسي. معربا بسرعة الفيروسيةناقلات مثل الجيل ^الثالث 3 lentiviruses ^{24، 25، 33} ويوصى.
3. الجراء مكان الماوس في P7 (C57BL / 6 أو المطلوب سلالة) وCD1 تعزيز الأم الى غرفة الأوكسجين وضعت في 75٪ O ₂ لمدة 5 أيام ^27. عقدت الرطوبة البيئية ودرجة حرارة ثابتة طوال O ₂ التعرض. ملاحظة: مرافق أبحاث مجهزة مصدر مركزي للO ₂ هي مثالية والحد من استبدال مرهقة يا فارغ ₂ الدبابات. إذا كان يعمل مع المعدلة وراثيا أو خروج المغلوب الفئران، فمن المهم لضمان أن يتم الحصول على السيطرة والفئران التجريبية من نفس المورد للحد من الانجرافات الوراثية داخل نفس سلالات ^{30، 29.}
4. في P12، وإزالة الفئران من غرفة الأوكسجين والعودة إلى الحيوانات المحيطة بناء O _2.

2. حقن Intravitreal لتسليم المركبات إلى شبكية العين الداخلية (واطآثار أون تقييم من مجمع الدوائية أو البروتين المؤتلف)

1. في P14، تخدير الفئران مع 2٪ isoflurane والأوكسجين في 2 لتر / دقيقة (أو حماية الحيوان وافقت عليها لجنة الاختيار مخدر). من أجل التحقق من فعالية التخدير، قرصة بالتتابع الذيل، القدم الخلفية والأذن مع ملقط.
2. ضع الماوس على بطنه.
3. باستخدام العقيمة 10 ميكرولتر حقنة مزودة إبرة مشطوف سحبت من الزجاج، نفذ حقنة من حجم القصوى من 1 ميكرولتر من محلول يحتوي على مركب يجري التحقيق أو مركبة (المالحة الفسيولوجية) في حوف الخلفي من العين، مع 45 درجة زاوية تجنب العدسة. ملاحظة: يتم إرفاق سحبت الزجاج الإبرة إلى حقنة باستخدام قطرة من الايبوكسي الراتنج.
4. تطبيق قطرة من مرهم للعين زيوت التشحيم (مثالي مع المضادات الحيوية) مع مسحة إلى العين الفأر.
5. عودة الماوس إلى القفص مع تعزيز الأم. ثم يتم رصدها بعناية الفئران حتى إعادةغطت والإسعافية بالكامل.

3. تقييم الإرواء السفينة والجدار وظيفة (النزاهة) من خلال تصوير الأوعية الدموية فلوريسئين

1. تخدير الفئران مع 2٪ isoflurane والأوكسجين في 2 لتر / دقيقة (أو حماية الحيوان وافقت عليها لجنة الاختيار مخدر). من أجل التحقق من فعالية التخدير، قرصة بالتتابع الذيل، القدم الخلفية والأذن مع ملقط. ملاحظة: عادة ما يتم تنفيذ ذلك في P17 عندما يتم تقييم التجدد. أيضا، إجراء التحليل في P19 وP21 لتحديد ما إذا كان الحفاظ على سلامة الأوعية الدموية على مر الزمن.
2. مرة واحدة تخدير، تزن الماوس.
3. جعل شق البطن خط الوسط مع مقص تشريح. ملاحظة: يجب أن يتم التحقق بانتظام أدوات تشريح وشحذ.
4. خفض أضلاعه أفقيا ورفع القفص الصدري بمساعدة ملقط. ملاحظة: من الضروري لخفض كما أفقيا وقت ممكن لتجنب الضرر إلى القلب.
5. بعد إزالة peripهيرال الأنسجة من القلب، المشبك الشريان الأورطي النازل مع ملقط مرقئ.
6. حقن ببطء فلوريسئين ديكستران إلى البطين الأيسر باستخدام إبرة G 25. ملاحظة: إذا تم التحقيق في وظيفة الحاجز الأوعية الدموية، ويعمل 70 كيلو دالتون ديكستران فلوريسئين-لأنها سوف يتسرب من السفن عندما يتم المساس سلامة السفينة. إذا كان المحقق يريد أن يلقي الأوعية الدموية، ويستخدم 2 MDA-فلوريسئين ديكستران. الخطوات الحاسمة: 1) لضمان إعادة تقسيم متجانسة، الطرد المركزي فلوريسئين-ديكستران وحقن طاف، 2) من أجل منع انقباض الأوعية، وضخ تحسنت حل فلوريسئين ديكستران، ينبغي 3) وقتها التداول لا تتجاوز 4 دقائق.
7. قطع رأس الفئران 2 دقيقة بعد الحقن مع مقص التشغيل.

4. سمل العيون وتثبيت

ملاحظة: عند تقييم معدلات تجديد الأوعية الدموية، وجمع الأولى في شبكية العين P12 وبالإضافة إلى ذلك في P14 وP17. زيادة عدد عينات نقطة زمنيةو لتحديد أكثر دقة لمعدلات عودة التوعي ^24.

1. إمالة الرأس الماوس ووضعه على جانبها.
2. إزالة الجلد والجفون تغطي العين باستخدام مقص تشريح.
3. وضع ملقط المنحني تحت العين واسحبه برفق حتى يتم قطع العصب البصري.
4. بدوره رئيس الماوس، على الجانب الآخر، وتؤدي نفس الخطوات (الخطوات 4.2 و 4.3).
5. لضمان انتشار أفضل من تثبيتي، ثقب حفرة في الغرفة الأمامية للعين باستخدام إبرة G 30.
6. نقل العينين إلى أنبوب يحتوي على 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) وإصلاح لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
7. إزالة PFA وتغسل العينين 4 مرات بمحلول PBS الجليد الباردة.

5. تشريح الشبكية

1. وضع عيون الماوس في طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني الباردة وأداء تشريح شبكية العين تحت stereomicroscope.
2. إزالة الدهون الزائدة / الأنسجة المحيطة بالعين مع تشريح الدقيقة الخيال العلميssors.
3. قطع القرنية مع مقص تشريح الدقيقة.
4. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط، قشر بدقة الصلبة بعيدا عن محيط نحو العصب البصري وتجاهل.
5. قرصة عدسة (الكرة بيضاء تحت القرنية) مع ملقط واستخراجها من كأس العين. استخدام زوج واحد من الملقط كوسيلة لدعم، والآخر لقبضة ورفع بعناية وإزالة العدسة.
6. فصل الأوعية الزجاجية من الجانب الداخلي من شبكية العين باستخدام فرشاة صغيرة (حجم 0) وملقط.
7. إزالة حزم من الأوعية الزجاجية متصلة القرص البصري باستخدام ملقط.
8. نقل تشريح شبكية العين إلى 2 مل أنابيب microcentrifuge تحتوي PBS ومكان على الجليد قبل بدء الإجراء تلطيخ.

6. الشبكية الوعائية تلطيخ

1. احتضان شبكية العين تشريح ليلة وضحاها مع طيف تهتز في 4 درجات مئوية في حل من جانب fluorescently-isolectin B4 (رودامين-كتين أو غيرها) في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 مم CaCl ₂ (1:100 ينصح التخفيف من حل B4 2 ملغ / مل isolectin). أثناء الإجراء تلطيخ كامل، تغطية الأنابيب مع رقائق الألومنيوم أو احباط مبهمة للحماية من ضوء.
2. في اليوم التالي، وإزالة حل تلطيخ وغسل 3X شبكية العين في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

7. إعداد الشبكية Flatmounts

1. نقل شبكية العين، من جانب مبصرة أسفل، على شريحة المجهر وجعل أربعة شقوق عميقة شعاعي على مسافة واحدة باستخدام مشرط جراحي لتقسيم شبكية العين إلى أربعة أجزاء متساوية الحجم. خلال شقوق، يستعدوا شبكية العين مع فرشاة بحيث لا يتحرك.
2. باستخدام اثنين من فرش غارقة في برنامج تلفزيوني، تتسطح بعناية الأرباع مبصرة الجانب إلى أسفل وتزج شبكية العين في تصاعد المتوسطة لمنع الصور تبيض. ثم ضع بعناية ساترة على سطح الشبكية التي شنت دون تطبيق الضغط والتأكد من أن فقاعات الهواء لا تتراكم تحت الغطاء زلة.

8. التصوير والكمي لVasoobliteration (VO)، واتساع الأوعية الدموية (NV) كما هو موضح سابقا ³¹

1. التقاط صور لشبكية العين كلها محمولة مع برنامج التحصين الموسع ومضان المجهر في التكبير من 10X.
2. فتح الصورة الشبكية في برامج تحرير الصور، غرزة معا وقياس إجمالي المساحة في شبكية العين، والمنطقة اوعائي. ويمكن التعبير عن المنطقة بالبكسل.
3. تحديد مدى VO بقسمة عدد البكسل في منطقة اوعائي من قبل عدد من وحدات البكسل في مجموع منطقة الشبكية.
4. تحديد مدى NV بقسمة عدد وحدات البكسل من NV من قبل عدد من وحدات البكسل في مجموع منطقة شبكية العين كما هو موضح ^31.

ويستخدم نموذج OIR على نطاق واسع لدراسة الأوعية الدموية الأكسجين الناجم عن تنكس والناجم عن نقص التروية اتساع الأوعية الدموية المرضية في شبكية العين وقامت بدور فعال في تطوير يعملون حاليا العلاجات المضادة للعائية لأمراض العين ^{27، 29، 30.} النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا النموذج يمكن استقراء فضفاضة لretinopathies الدماغية مثل اعتلال الشبكية السكري التكاثري واعتلال الشبكية الخداج ^30.

نحن هنا يقدم البديل استخدام هذا النموذج لدراسة تجديد الأوعية الدموية. سنقوم بشرح مثال على استراتيجية لتجديد الشبكية الدماغية التي نشرت مؤخرا من قبل المختبر. في الدراسة التي قدمت، علينا أن نظهر أن نقص تروية العصبية مستمرة ينشط الشبكة الإندوبلازمية (ER) الإجهاد وعبر واحد من endoribonucleases المستجيب لها IRE1α، يشق مرنا من الكلاسيكية جديلة التوجيه العصبية netrin-1. نعرضأن البينية العين تسليم Netrin-1، ويحفز برنامج تعويضية في الأوعية الدموية في شبكية العين خلايا الدم النخاعي، وبالتالي يسرع عودة التوعي الأنسجة العصبية بعد OIR ^25. وعلاوة على ذلك، ونحن نقدم مثالا على تسارع تجديد الأوعية الدموية باستخدام lentiviral بوساطة إسكات IRE1α.

النماذج التجريبية وصفها يمكن تعديلها التحقيق في معاملة الاستكشافية في الاختيار. الأهم من ذلك، يتم تحديد نقطة زمنية الحقن intravitreal استنادا إلى طبيعة المجمع استكشاف ويجب أن تأخذ في الاعتبار الآلية التي يعمل العلاج التحقيق. على سبيل المثال، لدراسة مركب الدوائية (مستقبلات ناهض، خصم، الخ)، ويمكن اختيار P14 كما يتوافق مع نقطة زمنية حيث عودة التوعي الشبكية يتسارع بعد التدخل السريع المفعول قد تساعد في تسريع معدل عودة التوعي (أرقام 2 و a3). عندما النواقل الفيروسية هيالعاملين، يجب أن يتم تخصيص ما يكفي من الوقت للسماح للتعبير كاملة من الجينات الركاب ونقطة وقت سابق قد يتم اختيارها لضمان التعبير الكامل للالتحوير أو إسكات كاملة من الجينات المستهدفة (الشكل 4). هي مناسبة ناقلات lentiviral تستند بشكل خاص في هذا الصدد بسبب التعبير السريع، والاستجابة الالتهابية المنخفضة وسهولة الإنتاج ^{24 و 25.} ومن الضروري أيضا التأكد من أن يتم تسليم هذا الجين المستهدف للسكان خلايا شبكية المناسب (RGC، الخلية البطانية، مولر الخليوي، الخ)، وبالتالي يجب النظر في tropism من ناقلات فيروسية المحدد. بدلا من ذلك، ودراسة دور الجينات في تجديد الأوعية الدموية باستخدام المعدلة وراثيا أو خروج المغلوب الحيوانات يوفر ميزة عدم الحاجة إلى إجراء الحقن داخل العين.

الشكل 1. تصوير تخطيطي لنموذج OIR الماوس يتعرض لها. الجراء ماوس والأمهات المرضعات إلى 75٪ O ₂ من P7 إلى P12. مطلوب غرفة الأكسجين التهوية مع ثابت O ₂ التسليم ومقياس التأكسج. خلال هذه الفترة الأولية، يحدث في الشبكية الوعاء-الطمس. في P12، يتم إرجاع الفئران لهواء الغرفة (21٪ O ₂₎ حتى عندما يحدث P17 القصوى المرضية تلمم قبل الشبكية. اتساع الأوعية الدموية يتراجع خلال الأيام التالية. الفترة المثالية لتحقيق تجديد الأوعية الدموية هو الإطار بين P12 وP17. أخذ العينات وتقييم العديد من النقاط الزمنية لمدى الوعاء-الطمس هو المفتاح لتوضيح دقيق لمعدلات عودة التوعي.

الشكل 2. وقت أثناء عودة التوعي الشبكية التالية التي يسببها الأكسجين الوعاء-obliteالتموينية. A) تصوير جرافيك إجراء flatmounting الشبكية. يتم إجراء شق خلال الجزء العلوي من القرنية (قبة الأسود والرمادي) والصلبة (خطوط حمراء منقطة) ومازحت شبكية العين خارج. العدسة يمكن استخراجها إما بعد فتح القرنية / الصلبة أو مرة واحدة تتم إزالة الصلبة كما هو مبين في الرسم البياني. ثم يتم إزالة الأوعية الزجاجية وتلطيخ الأوعية الشبكية التي يؤدونها. بعد الانتهاء بروتوكول تلطيخ، ثم يتم قطع الشبكية إلى 4 أقسام متباعدة بالتساوي وتوضع على شريحة المجهر السفينة من جانب المتابعة. B) كتين الملون شبكية العين flatmount من الفئران تعرض لOIR. كما السفن تجديد، مجال الوعاء-الطمس (هنا القصوى في P12) يملأ فيها اتساع الأوعية الدموية المرضية هي القصوى في P17 ويظهر على شكل بقع ملطخة كتين المشبعة في شبكية العين OIR. بواسطة P19-P21، وشبكية العين مجدد بالكامل شبكاتهم الأوعية الدموية. (تم تعديل هذا الرقم من بينيه وآخرون. استقلاب الخلية 2013 ²⁵⁾

الشكل 4. مثال لإسكات الجينات وايتسليم lentiviral عشر shRNAs لتجديد الأوعية الدموية في شبكية العين: Lv.shIRE1α لتقييم قدرة إسكات الجينات في الخلايا العصبية من IRE1α العقدة الشبكية لمساعدة تجديد الأوعية الدموية، تم حقن حقنة intravitreal من الترميز الفيروسة البطيئة لshIRE1α في P3 لإتاحة الوقت الكافي لإسكات الجينات عندما يتم تقييم نمو الأوعية الدموية والوعاء-الطمس. والفيروسة البطيئة الجيل ^الثالث 3 الذين يعملون في هذا المثال يحتوي على بروتين سكري فيروس التهاب الفم الحويصلي تعديل (VSV-G)، هندسيا لاستهداف الأغشية البلازما. على الرغم من أن هذه النواقل تصيب خلايا الشبكية العقدة على نحو فعال، ويمكن أيضا أن يلاحظ التعبير في أنواع الخلايا الأخرى المحلية. (A) وهذا العلاج لا يؤدي إلى تغيرات ملحوظة في الأكسجين الناجم عن الوعاء-طمس كما هو محدد في P12، مما يدل على أن جميع الفوائد لوحظ على الوعاء-طمس قياسها في نقاط وقت لاحق وذلك بسبب زيادة تجديد الأوعية الدموية. (B) تثبيط IRE1α طن هذا النموذج المحسن بشكل كبير الأوعية الدموية التجديد في مرحلة إعادة نمو OIR في P17. (تم تعديل هذا الرقم من بينيه وآخرون. استقلاب الخلية 2013 ²⁵⁾ (C) تقييم نقطة مرة الثالثة من الوعاء-طمس مثل P14، وذلك لتحديد معدلات دقيقة للعودة التوعي. (تم تعديل هذا الرقم من جويال آخرون الدم 2011 ²⁴⁾ الرجاء الضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ما هي الطريقة الأكثر فعالية لتحفيز نمو الأوعية صحية جديدة في النسيج العصبي الدماغية؟ هل يصح علاجيا لتتداخل مع وتسريع إعادة نمو الأوعية الدموية التي تحدث بشكل طبيعي؟ في الأمراض العصبية الدماغية مثل retinopathies الدماغية أو السكتة الدماغية، ويرتبط تنكس الأوعية الدموية مع انخفاض وظيفة الخلايا العصبية ^35-38. وبالتالي لمواجهة الإصابة في وقت مبكر، إعادة الإقليمية الدورة الدموية الصغرى خلال الجزء فوري / مبكرة من المرض قد تكون مفيدة. في سياق بصري، النماذج التجريبية التي تعجل عودة التوعي من الشبكية الدماغية تقليل اتساع الأوعية الدموية المرضية ^{21-25، 34} وبالتالي هذا النهج مزايا إجراء مزيد من التحقيق.

منذ إطلاقها قبل 20 عاما، ^و27 نموذج OIR قد أحدثت ثورة الأوعية الدموية في شبكية العين البحوث ^30. هنا نقدم تطبيق إضافية لهذا النموذج لدراسة STRAT المحتملينegies لتعديل الفسيولوجية الأوعية الدموية في شبكية العين تجديد الدماغية. وينبغي أن يشمل نموذج حيواني مثالية عدة معايير مثل القرب من الإنسان المرضية، علم وظائف الأعضاء، استنساخ عالية، والتنفيذ السريع وبشكل مثالي، وتكلفة منخفضة. نموذج الفأر من OIR يلبي كل هذه المعايير، ويمكن-نفذت في أقل من 3 أسابيع.

على الرغم من العديد من الفوائد المذكورة، وتشمل عيوب الحاجة الحالية للتضحية الماوس قبل التحليلات والرصد طولية بالتالي دقيقة حيوان ليس من الممكن بعد مع أدوات التصوير الحالية. حاليا، في الجسم الحي تقنيات التصوير مثل تصوير الأوعية فلوريسئين أكتوبر أو غير ناجحة إلى حد كبير نظرا لمحدودية البصرية المتأصلة في العين الماوس (دائرة نصف قطرها انحناء وحجم صغير) مما يقلل من التغطية التصوير ³⁹ إلى أكثر المناطق المركزية من الشبكية والتي ليست ذات صلة المراحل الأولى من النموذج.

عندما تستخدم لدراسة تجديد الأوعية الدموية كما عroposed في هذه الورقة البروتوكول، ينبغي أيضا أن تراقب جميع الاعتبارات التي تنطبق على دراسة اتساع الأوعية الدموية. وتشمل هذه تسجيل وزن الحيوان لتقدير صحة التمثيل الغذائي من الجرو، والتي تؤثر بشكل كبير الأوعية الدموية ^32. مراقبة دقيقة للتوتر الأوكسجين في الغرفة مفرط التأكسج أمر بالغ الأهمية أيضا. الاختلاف في تركيز الأكسجين له تأثير مباشر على vasoobliteration، التي يمكن أن تؤدي حتما إلى سوء تفسير البيانات الهامة. لذا فمن المستحسن إما تنفيذ المراقبة الإلكترونية المستمرة لتركيز الأكسجين الغرفة أو في الأقل، ورصد التغيرات اليومية في مستويات الأكسجين والحد من فتح الباب oxycycler للحفاظ على مستويات الأوكسجين المستمر. تجهيز الأمثل لشبكية العين كما يأخذ الممارسة. استخراج و التركيب و يجب أن يتم تنفيذ تلطيخ من شبكية العين مع الرعاية كما الشبكية هشة نسبيا ويجب التعامل معها بحذر. بالإضافة إلى ذلك، كما لجميع التجريب مع الحيوانات المعدلة وراثيا، والانجراف الوراثي للمستعمرة جوالنتائج نخلط. في غياب قوة انتقائية (في مستعمرة الماوس على سبيل المثال)، وأليلية أو الانجراف الوراثي هو عملية العشوائية التي يمكن أن تؤدي إلى تغييرات كبيرة في عدد السكان خلال فترة قصيرة من الزمن. يمكن تغيير الترددات أليل من جيل الى جيل، ويؤدي إلى تشكيل مستعمرة الفرعية ^{40 و 41.} هذه الطفرات لا يمكن اكتشافها إلى حد كبير وبالتالي فمن المهم للحد من عدد من الأجيال التي تنتجها أزواج المربي نفسه في نفس المستعمرة. الطريقة الأكثر فعالية لبلوغ أعلى الاستقرار الجيني هو لتحديث "المخزونات" كل خمسة أجيال أو الشروع في backcrossing مع ماوس شراؤها من خلفية مماثلة.

ويوصى أيضا لاختبار الطفرات تنكس الشبكية (الثالثة) 1 و 8 ^42، مرة واحدة على الأقل قبل بدء سطر جديد من أجل تجنب الخلط الظواهر التي يمكن أن تعزى إلى سابق لأوانه تنكس مبصرة. للحيوانات معدلة وراثيا،فمن الأهمية بمكان لضمان أن كلا من التحكم وفئرانا معدلة وراثيا يتم الحصول عليها من نفس المورد وبالضرورة على نفس الخلفية الوراثية.

ونحن نواصل توضيح الآليات الجزيئية لتشكيل الأوعية الدموية والنمو، ونهج جديدة لتسريع وبطيئة، أو توجيه الأوعية الدموية الوليدة والناشئة. والنظام النموذجي الذي التشكيل من الأوعية الدموية يمكن استكشافها في الجسم الحي في سياق المرضية قد توفر أداة قيمة لاستكشاف نماذج علاجية مستقبلية لمواجهة نقص تروية الخلايا العصبية داخل الجهاز العصبي المركزي. تكييف نموذج OIR الماوس لدراسة تجديد الأوعية الدموية يوفر مثل هذا المكان وسوف تستمر في أن تكون أداة قيمة لزيادة فهمنا من الأساس الجزيئي لتكوين الأوعية الدموية الفسيولوجية والمرضية.

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

PS حاصل على كرسي أبحاث كندا في الشبكية بيولوجيا الخلية وجائزة معهد بحوث ألكون باحث جديد. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (221478)، والجمعية الكندية للسكري (OG-3-11-3329-PS)، والعلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (418637) والعمى مؤسسة القتال كندا. وقدم الدعم أيضا من قبل RESEAU للبحوث في مجال سانتي دي لا الرؤية كيبيك.