Exame do Synaptic Vesicle Reciclagem Usando FM Corantes Durante Evocado, espontânea, e as atividades de Synaptic miniatura

Descreve-se o uso de corantes estiril FM imagem sináptica reciclagem vesícula nos terminais nervosos funcionais. Este protocolo pode ser aplicado não só a evocada, mas também espontânea e actividades sinápticas em miniatura. O protocolo expande a variedade de eventos sinápticos que podem ser eficazmente analisados.

Vesículas sinápticas em terminações nervosas funcionais sofrem exocitose e endocitose. Esta reciclagem das vesículas sinápticas pode ser efetivamente analisados ​​usando corantes estiril FM, que revelam turnover da membrana. Protocolos convencionais para o uso de corantes FM foram concebidos para a análise de neurônios seguinte estimulada (evocado) atividade sináptica. Recentemente, protocolos tornaram-se disponíveis para a análise dos sinais de FM que acompanham as atividades sinápticas mais fracos, como eventos sinápticas espontâneas ou em miniatura. A análise destas pequenas alterações nos sinais de FM requer que o sistema de imagem é suficientemente sensível para detectar pequenas alterações na intensidade, ainda que as mudanças de artefatuais de grande amplitude são suprimidas. Aqui, descrevemos um protocolo que pode ser aplicado a evocado, espontânea, e actividades sinápticas em miniatura, e usar os neurónios do hipocampo em cultura como um exemplo. Este protocolo inclui também um meio de avaliar a taxa de fotobranqueamento de corantes FM, como este é um significativofonte de artefactos quando imagens pequenas alterações em intensidade.

A funcionalidade das vesículas sinápticas é um importante determinante da transmissão sináptica. Essas vesículas libertar neurotransmissores quando se fundem com a membrana plasmática pré-sináptica (exocitose), e tornam-se pronto para um outro ciclo de libertação depois de ser regenerada a partir da membrana plasmática (endocitose) e recarregado com neurotransmissor. A investigação sobre a dinâmica dos mecanismos subjacentes e reciclagem das vesículas sinápticas foi muito acelerado pela introdução de corantes estiril FM ^1. Estas moléculas anfipáticas, que têm carga positiva grupos de cabeça hidrófilos e caudas hidrofóbicas (vários corantes na Figura 1A, stereoview de FM1-43 na figura 1B), de forma reversível pode entrar e sair de membranas lipídicas sem impregnar a. Grupos de corantes FM compartilham características semelhantes que influenciam a gama de luz que eles emitem. Por exemplo, FM2-10, FM1-43, e FM1-84 tem uma dupla ligação entre os dois compostos cíclicos e shoemissão verde w. A diferença entre eles é o comprimento da cauda hidrofóbica, que determina a sua hidrofobicidade e, por conseguinte, a taxa de saída da membrana (departitioning). Nos casos de FM5-95 e FM4-64, três ligações duplas ligação dos compostos cíclicos, e que mostram emissão vermelha. Estes corantes são diferentes no que diz respeito às suas partes hidrofílicas. Em todos os corantes de FM, a intensidade da fluorescência aumenta quando eles são inseridos em membranas biológicas, devido a um aumento no rendimento quântico do ambiente hidrófobo em relação ao ambiente hidrofílico. Assim, as alterações na intensidade de FM representam as alterações no volume de membrana. As diferentes cores (espectros de emissão) e hidrofobicidades fazer a FM tinge uma ferramenta de pesquisa versátil na reciclagem de vesículas sinápticas.

Com base nestas características, os corantes FM são principalmente utilizados de acordo com o seguinte esquema, quando analisando reciclagem das vesículas sinápticas (Figura 2). Neurons são banhadas em uma solução extracelular contendo o corante FM, permitindo que ele seja levado para vesículas sinápticas (SVS), que fazem através de endocitose (coloração). O corante é então lavado por aplicação de uma solução extracelular livre de corante, isto revela as terminações nervosas funcionais, isto é, apenas aqueles submetidos a endocitose activamente, devem conter um conjunto de vesículas sinápticas que são carregados com o corante (Figura 2 abaixo). Exocitose subsequente conduz à perda do corante FM para o espaço extracelular e uma perda concomitante de fluorescência (descoloração, devido a tanto o departitioning para um ambiente hidrofílico e difusão para longe do local de exocitose). Por conseguinte, as alterações na intensidade de fluorescência de FM são indicadores de vesícula sináptica exo e endocitose.

Corantes FM foram utilizados para corar e Destain as vesículas sinápticas em vários organismos e preparações ^2,3. Exemplos incluem neur mamíferosculturas onal ^4-9, fatias de cérebro de mamíferos ^10,11, junções neuromusculares ^12,13, neurônios bipolares da retina ^14,15, e as células ciliadas da cóclea ^16.

Normalmente em tais experiências, tanto coloração e descoloração são acionados por extensivamente estimular os neurônios (atividade evocada). Recentemente, no entanto, a reciclagem de vesícula sináptica em resposta à estimulação fraco foi também analisado, como tem de reciclagem, na ausência de um estímulo externo (actividade sináptica e espontânea diminuta) ^9,17-19. Atividades sinápticas espontâneas e miniatura são definidos como aqueles que ocorrem na ausência de estímulos externos, com o primeiro envolvendo a queima espontânea de potenciais de ação (Figura 3). Essas atividades sinápticas fracas estão associados a mudanças menores em sinais de FM que aquelas desencadeadas por estimulação extensa. A medição requer que as alterações na fluores FMintensidade cia refletir com precisão a exocitose das vesículas sinápticas ou endocitose mas as alterações não de artefatos em intensidade. Uma causa do artefacto é a presença de coloração não específica da membrana plasmática por corantes FM. Washout gradual deste componente vai conduzir a uma mudança gradual na intensidade da fluorescência medida, que serão erroneamente atribuído às actividades sinápticas. Este factor pode ser reduzido por métodos adequados (ver protocolo). A causa mais notável do artefato é a fotodegradação de corante FM retida dentro vesículas sinápticas. As mudanças relacionadas à fotodegradação na intensidade FM deve ser pequeno em comparação com os biológicos (sinápticas) mudanças que são medidos. O recente desenvolvimento de câmaras sensíveis, por exemplo, a câmara do dispositivo de carga acoplada multiplicação de electrões (EMCCD), faz com que seja possível, para minimizar a fotodegradação, encurtando o tempo de exposição e enfraquecimento da intensidade da luz usada para excitar o fluoróforo. Outra causa do artefato é um i derivan o nível de concentração da microscopia de luz. O desvio do foco, durante uma sessão de imagem pode ser causada por efeitos mecânicos ou térmicos, e erroneamente conduzir a uma mudança na intensidade de fluorescência medido.

Aqui descrevemos protocolos e equipamentos que tornam possível a utilização de corantes FM para analisar a reciclagem de vesículas sinápticas, mesmo no contexto de uma fraca ou nenhuma estimulação, em particular, a actividade sináptica em miniatura. Mostramos exemplos de coloração e descoloração de vesículas sinápticas evocadas durante os eventos e espontânea, utilizando culturas de neurônios do hipocampo de roedores, e imaginando a fase de descoloração. Também demonstramos como avaliar o grau de FM corante fotodegradação, na ausência de qualquer perda corante FM devido às atividades sinápticas.

1. Cultura primária de neurônios do cérebro dos mamíferos

Todos os procedimentos com animais realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê da Universidade de Iowa Institutional Animal Care e Use.

1. Prepare a cultura de células dissociadas de regiões CA3-CA1 do hipocampo de ratos ou ratazanas, nos dias pós-natal 0-1 ^19,20. Placa as células do hipocampo em lamelas de 12 mm de espessura (número 0) pré-carregados com a camada alimentadora de células gliais de rato, em placas de 24 poços, e a uma densidade de 12.000 células / poço.
2. Cultura dos neurônios do hipocampo para pelo menos 8 dias para terminais nervosos funcionais para desenvolver ^21. Nós usamos neurônios em 11-14 dias in vitro quando terminais nervosos individuais são relativamente isolado, sem muita aglomeração. Neurónios pode ser usado para as experiências até cerca de 21-28 dias in vitro, por exemplo Willig et al. ²² e Nosyreva e Kavalali ^23.
3. Paraestudos funcionais, avaliar lamelas (antes da coloração) para os indicadores de neurônios saudáveis, utilizando microscopia de luz transmitida (por exemplo, a óptica de contraste de fase com uma ampliação de 10-20x). Os indicadores de boa saúde incluem: uma camada uniforme glial celular, uma margem de celular claro ao redor dos neurônios, dendritos estendido sem estruturas de contas, a falta de somata cluster, e uma falta de neurites empacotados.

2. Carregando o Synaptic vesículas com o corante FM (coloração)

1. A coloração devido à atividade sináptica evocada por estimulação campo elétrico (refere-se potenciais de ação)
   1. Prepare coloração solução 1, adicionando o corante FM para uma solução livre de tintura baseada em HEPES, por exemplo, a solução de Tyrode (ver soluções para mais detalhes). A concentração do corante FM é 10 uM FM1-43 e 2,5 uM FM4-64. Gamas de concentração típicos são: 2-15 uM FM1-43, ou 2,5-20 uM FM4-64 ^3,6. Para experiências que requerem a supressão da recorrenteactividade sináptica glutamatérgica e a indução da plasticidade sináptica, adicionar mais antagonistas de receptores de glutamato ionotrópicos: receptores AMPA (por exemplo, 10 uM CNQX) e receptores de NMDA (por exemplo, 50 uM de AP5).
   2. Transferir uma lamela com células a partir do meio de cultura para a câmara de imagem pré-cheio com a solução de Tyrode normal. Usamos uma câmara de imagem com os eletrodos de estimulação presas às paredes laterais (fios de platina separados de 6,3 mm, RC-21BRFS). Esta câmara foi concebida como uma câmara de imagem fechada, mas podemos usá-lo como uma câmara aberta (ou seja, sem uma lamela superior), com um volume de banho de ~ 200 mL. Durante a transferência, não exponha as células cultivadas ao ar, e evitar beliscar as células cultivadas com a pinça (pegar a lamela-se a partir do perímetro ao invés de perto do centro).
   3. Perfundir a câmara de imagem com uma solução de Tyrode simples à temperatura ambiente (23-25 ​​° C).
   4. Aplicar a coloração solução 1 por coperfusão nstant.
   5. Evoke atividade sináptica através da aplicação de pulsos elétricos. Para a coloração máxima do conjunto total de reciclagem de vesículas sinápticas em neurónios do hipocampo, estimular as culturas a 10 Hz durante 60-120 seg ^24. Ao tentar alcançar a máxima eficiência da estimulação campo, manter várias características em mente. 1) A altura da solução do banho deve ser tão baixa quanto possível, embora mantendo os neurónios e eléctrodos de estimulação inteiramente imerso em uma camada fina de solução de Tyrode (a fim de manter os neurónios vivos e para obter um campo eléctrico homogéneo). 2) Intensidade de corrente e duração deve ser optimizada utilizando um indicador de excitabilidade neuronal, por exemplo, fluorescente de Ca ^{2 +} de imagem, no nosso caso, uma corrente constante de 30 mA de intensidade e duração de 1 mseg dá resultados fiáveis. 3) A solução do banho deve ser aplicado a um caudal constante durante a estimulação, a estimulação eléctrica conduz a electrólise, causando prótons (H +) para acumular pelo ânodo carregado positivamente e o pH perto do ânodo para diminuir rapidamente em banho estático. Verifique a acidificação numa experiência separada fazendo passar mais do que algumas centenas de impulsos por meio de uma solução que contém um indicador de pH (por exemplo, solução salina equilibrada de Hanks com vermelho de fenol).
   6. Deixe os neurônios em solução de coloração 1 para um adicional de 60 segundos após a estimulação campo é encerrado, a fim de que a endocitose de pós-estímulo será completado ^25.
   7. Lave a solução de coloração fora da câmara de imagem irrigando-a com a lavagem solução 1, a solução de um Tyrode livre de pigmento mais antagonistas dos receptores AMPA e receptores NMDA (ver secção 2.1.1), e um bloqueador de canais de Na ⁺ dependentes de voltagem ( por exemplo, 0,5-1 uM tetrodotoxina, TTX). A combinação de bloqueadores irá suprimir a perda de corante FM através da actividade sináptica espontânea. Para maximizar a eficiência da lavagem, aumentar a taxa de perfusão ( por exemplo até 5-6 ml / min) durante 1-2 minutos, e adicionar um bolus (por exemplo, 1 ml) de solução de lavagem 1 directamente para a câmara de imagem aberta manualmente, usando uma pipeta. Controle a força e direção de infusão manual, de modo a não perturbar os neurônios cultivados.
2. A coloração devido à atividade sináptica evocada por solução high-K ⁺ (não envolve potenciais de ação).
   1. Preparar solução de coloração 2 por adição do corante FM a solução do-K ⁺ elevado Tyrode. Especificamente, se preparar uma solução de Tyrode modificada com KCl 45 mM, por substituição equimolar de KCl para NaCl. Se necessário, adicionar os antagonistas de receptores de AMPA e NMDA. Esta solução de alta-K ⁺ despolarizará neurónios continuamente, permitir influxo de ^{Ca2 +} em terminais nervosos, e iniciar a exocitose de vesículas à medida máxima ^26. As concentrações mais elevadas (70-90 mm) também foram utilizados em outros relatórios de ²⁷ um, por exemplo Klingauf et al.²⁸ d Richards et al.
   2. Transferir uma lamela com neurônios cultivados a partir do meio de cultura para a câmara de imagem pré-preenchido com solução de Tyrode normal.
   3. Manchar os neurónios à temperatura ambiente durante 1-2 minutos de aplicação da solução de coloração 2 a perfusão constante ou usando uma pipeta ^26,28. Neste último caso, a concentração final do corante deve ser controlado pela adição de um volume conhecido de solução de coloração 2 a um volume conhecido de uma solução livre de corante.
   4. Lava-se a solução de coloração para fora da câmara de imagem, como descrito na secção 2.1.7.
3. A coloração devido à atividade sináptica espontânea e em miniatura.
   1. Pré-aquecer solução à base de bicarbonato (por exemplo, Meio Essencial Mínimo, MEM) a 37 ° C, colocando na incubadora cultura por mais de 60 min.
   2. Para a coloração com base na actividade sináptica espontânea, preparar uma solução de coloração 3 através da adição do corante FM para MEM. Para a coloração com base no miniature atividade sináptica, preparar solução de coloração 4 adicionando TTX para a solução de coloração 3.
   3. Neurónios mancha de transferência de uma lamela com neurónios cultivados a partir de meio de cultura para a coloração solução de 3 ou 4, e deixando-as na mesma solução de coloração a 37 ° C durante 10 min.
   4. Lavar as lamelas brevemente na solução 1 enxaguar.
   5. Transfira a lamela a solução 1 lavagem em uma câmara de imagem. Tenha em mente o seguinte. 1) As células não deve ser exposto ao ar, se necessário, transferir o lamela diretamente para a câmara de imagem sem enxaguar. 2) neurónios podem ser corados à temperatura ambiente através da substituição de solução de coloração de 3 ou 4 com uma solução à base de HEPES. 3) Os neurónios podem ser coradas para actividade sináptica evocada no contexto de uma solução de alta-K ⁺ utilizando este método, através da substituição de uma solução de coloração de 3 ou 4 com uma solução de coloração 2 e levando a cabo os passos restantes, à temperatura ambiente.
   6. Lava-se a solução de coloração para fora da imagemcâmara como descrito no ponto 2.1.7.

3. Lavar o Dye FM

1. Após coloração neuronal e lavagem inicial por qualquer um dos métodos descritos acima (secção 2.1.7), continuam a perfundir a câmara de imagem com uma solução de lavagem, durante 5-10 min à temperatura ambiente. Isto irá remover o corante FM a partir da membrana do plasma e a solução extracelular. No caso de a câmara de imagem, a taxa de perfusão do banho é 600-1,200 ul / min. Lavagem pode também ser efectuada na ausência de Ca2 ⁺ extra para suprimir a perda de corante FM devido a actividades sinápticas ^17. As lavagens pode ser aumentada por uma breve aplicação de ADVASEP-7, uma ciclodextrina modificada, que serve como um limpador de corantes FM a partir da membrana plasmática ^29-31. É crucial para manter qualquer exposição ADVASEP-7 curto (por exemplo 5 segundos, no caso de uma cultura em monocamada) para evitar tanto a redução da intensidade da puncta FM ³¹ e comprometendo o health das células. A fluorescência a partir de FM1-43 na membrana de plasma também pode ser suprimida por uma aplicação de um agente de extinção sulforrodamina 101 (50-100 uM), que não entra em vesículas sinápticas ^32.

4. Procurando por um campo de imagem ideal durante a lavagem

1. Verifique se as células na área a ser trabalhada são saudáveis, através de microscopia de luz transmitida com uma lente objetiva de grande ampliação e high-numérico de abertura (por exemplo, 40X). Nesta seção, continuamos a usar um microscópio invertido (Eclipse Ti, Nikon) equipado com contraste de fase ou de interferência diferencial contraste óptica. Este microscópio também é equipado com Sistema Perfect Focus (PFS) que permite a contínua e em tempo real, correção de foco, o que supera o foco deriva microscópio. Esse recurso é essencial para imagens de lapso de tempo durante descoloração com o mesmo plano de foco.
2. Verifique se a coloração foi eficaz, usando óptica de fluorescência. Av.agregados OID puncta FM a menos que eles são alvo de investigação, porque boutons individuais vai ser difícil de discernir. Preste atenção às formas do puncta FM: se a maioria dos boutons manchadas aparecem como colares de contas circulares, eles poderiam representar terminais nervosos insalubres. Minimizar a exposição dos neurónios para excitação de fluorescência forte, a fim de evitar a fotodegradação.

5. Descarga FM Dye do Synaptic vesículas (Descoloração)

1. Descoloração devido à atividade sináptica evocada por estimulação campo elétrico.
   1. Wash TTX fora irrigando os neurônios extensivamente com uma solução de lavagem 2 (o mesmo que uma solução de lavagem, mas sem TTX). Confirmam a eficácia de lavagem TTX em experiências separadas, utilizando os mesmos parâmetros (taxa de perfusão de lavagem e de duração), por exemplo através de fluorescência de ^{Ca2 +} citoplasmático imagiologia de transientes de Ca ^{2 +} induzidos pela estimulação do campo, ou de gravação de patch-clamp de voltscorrentes de Na ⁺ dependentes da idade.
   2. Comece imaginando os corantes FM. For Imaging FM1-43 ou FM4-64, utilize 520 nm ou 650 filtros de emissão passe nm, respectivamente, e um filtro de excitação 490 nm. Adquirir imagens a cada 1-2 segundos, usando um curto tempo de exposição (por exemplo 10-20 ms), intensidade de excitação fraca (por exemplo, 5-10% de poder de LED), e alta sensibilidade (por exemplo, com o ganho de EM). Minimizar a fotodegradação dos corantes FM através da redução do tempo de exposição e a intensidade de excitação de fluorescência. Minimizar o foco deriva microscópio ativando o sistema perfeito Focus.
   3. Estimular os neurônios em solução 2 de lavagem, utilizando campo-estimulação (por exemplo, a 10 Hz para 120 segundos) ^20.
   4. Aplique várias rodadas de estímulo, com intervenientes períodos de descanso de 1-2 min, para esgotar todas as vesículas sinápticas reciclagem de corante FM. Isso é importante quando se avalia o tamanho do pool total reciclagem de vesículas sinápticas que foram corados com corantes FM em poe estado anterior ^20,33.
2. Descoloração devido às atividades sinápticas evocada na ausência de potenciais de ação.
   1. Comece imaginando o corante FM.
   2. Aplicar os reagentes estimulantes dissolvidos na solução 1 ou 2 enxaguamento. Tais reagentes incluem: (solução de K ⁺ elevado, por exemplo 45 mM) KCl ^26, ionomicina (um ionóforo de Ca ^{2 +} intracelular, que levanta a concentração de ^{Ca2 +,} permitindo influxo de ^{Ca2 +} para dentro da célula a partir da solução extracelular, por exemplo, utilizado em 5 M) ^20,34, e sacarose (uma solução hipertônica que estimula a liberação de vesículas sinápticas de piscina prontamente libertado, por exemplo, usado em 500 mm) ^35,36. Utilize um sistema de perfusão rápida, local para um controle temporal confiável na aplicação dos reagentes, por exemplo, o sistema SF-77B a partir de Warner Instruments ^37, ou sistema Y-tubo ^38-40.
3. Descoloração devido ao espontâneo e miniature atividade sináptica.
   1. Para descoloração devido à atividade sináptica espontânea, lavar a TTX como acima (seção 5.1.1), usando uma solução de 2 enxaguar. Comece imaginando os corantes FM enquanto irrigando neurônios com solução 2 de enxaguar. Para descoloração devido às atividades sinápticas em miniatura, comece imaginando os corantes FM, continuando a perfuse os neurônios com a solução 1 (com TTX) enxaguar.
   2. Depois de descoloração com base na atividade espontânea ou em miniatura, identificar os terminais nervosos funcionais por descoloração via atividade sináptica evocado. A actividade pode ser provocada por qualquer um dos procedimentos descritos acima. Este processo de identificação é necessário porque as estruturas coradas podem ser outros que não os terminais nervosos funcionais (por exemplo, reciclando lentamente endossomas ou vesículas astrocíticos) e uma grande quantidade de descoloração por os auxiliares de actividade evocadas neste processo.

6. Avaliando o Fotodegradação Taxa de FM Corantes

1. Manchar os terminais nervosos com corante FM aldeído-solucionáveis ​​(por exemplo, FM1-43FX, FM4-64FX). Isto pode feito usando o, método de coloração espontânea, ou diminuto evocado acima descrito, e pela substituição de corante FM com um corante FM fixável.
2. Lavar o corante FM solucionáveis ​​como descrito na seção 2.1.7.
3. Quimicamente corrigir os neurónios através da transferência da lamela de solução fixadora: 4% de paraformaldeído e 4% de sacarose na solução de Tyrode durante 30 minutos a 4 ° C. A intensidade de fluorescência do corante FM fixável será retida após a fixação química.
4. Lavar o fixador por 10 minutos em solução de Tyrode, transferindo a lamela a solução de Tyrode fresco duas vezes.
5. Transfira a lamela em solução de Tyrode fresco na câmara de imagem.
6. Comece imaginando o corante FM solucionáveis ​​usando o mesmo conjunto de parâmetros de imagem como de neurônios vivos. É importante para enxaguar a câmara de imagem muito bem após o uso de qualquer amostra fixada quimicamente, porquequalquer fixador restante pode afetar experimentos com imagens ao vivo de células posteriores efectuados na mesma câmara. Em alternativa ao imagens de células fixa, as células vivas manchadas pode ser trabalhada para avaliar a taxa de fotodegradação. No entanto, deve-se ter em mente que é difícil para bloquear a actividade sináptica miniatura aguda, por exemplo, a frequência de actividade diminuta pode ser reduzida para aproximadamente 50% através da remoção do Ca2 ^{+ extra-23,} mas não é uma solução completa bloqueio.
7. No fim de cada sessão de imagem, adquirir uma imagem de fundo para avaliar o valor absoluto da intensidade de fluorescência de FM. A intensidade dos pontos lacrimais FM representa não somente o verdadeiro sinal de corantes FM em terminais nervosos, mas também o ruído de fundo a partir de 1), as células gliais que estão na base da cultura de monocamada neuronal, 2) a lamela e componentes ópticos (por exemplo, lentes, filtros e objectivo espelhos), e 3) o detector (câmara EMCCD). O ruído de fundo é assessed em regiões nonstained do campo de imagens. Quando tais regiões estão limitados no espaço ou heterogénea em intensidade, a substituí-lo com uma imagem com o obturador da câmara fechada e adquirir o ruído do detector, embora não seja um método ideal. Adquirir cerca de 10 imagens com os mesmos parâmetros de imagem.

7. Análise de Imagem

1. Importe os dados adquiridos para o software de análise de imagem, como uma pilha de imagens de séries temporais. Usamos ImageJ (WS Rasband, NIH) e os plug-ins associados, por exemplo, Estabilizador de Imagem plug-in (Kang Li) para corrigir um pequeno grau de movimento entre puncta FM e Time Series Analyzer V2.0 (Balaji Jayaprakash) para analisar da série histórica.
2. Calcule as variações na intensidade de FM no início e no final da série (ΔFM). Para este fim, a média das imagens antes do início da descoloração e após o término de descoloração (por exemplo, cinco quadros de imagem de cada), e gerar uma imagem de diferença por subtracting-los.
3. Identificar os terminais nervosos potencialmente funcionais através da aplicação de um limiar de intensidade para a imagem de diferença, e detectar os pixels cuja intensidade é maior do que o limiar. Um método de definição do limite é escolher o desvio padrão da intensidade de fundo obtido a partir da área de lamela nua.
4. Identificar os terminais nervosos, funcionais isolados como os pixels adjacentes que foram detectados e que satisfaçam um critério tamanho (número mínimo e máximo de pixels em contigüidade). Este processo elimina o ruído de fundo e terminais nervosos agregados de análise.
5. Atribuir regiões de interesses (ROI) sobre os aglomerados de pixels detectados (com os conjuntos individuais correspondentes às terminações nervosas individuais). A variação total de intensidade durante a descoloração (ΔFM) é um parâmetro típico de análise. Isto representa o montante acumulado de atividade sináptica evocada, espontânea ou em miniatura. Excluir ROIs se eles apresentam algum dos seguintesmudanças na intensidade, dependendo do objectivo das experiências: um aumento durante a gravação, uma diminuição repentina antes do estímulo, ou uma longa latência após a estimulação.
6. Avaliar a taxa de fotodegradação por importar os dados de séries adquiridas para o software de análise de imagem. Calcular a média dos imagens de fundo (por exemplo, com um obturador fechado), e subtrai-lo a partir das imagens individuais. Atribuir ROIs para puncta FM que supostamente correspondem a terminações nervosas, e medir as mudanças na intensidade ROI ao longo do tempo.

Soluções

1. Solução de Tyrode
   • Composição (em mM): 125 NaCl, KCl 2, 2 de _CaCl2, 2 de _MgCl2, 30 de glucose, 25 de HEPES, 310 mOsm, pH 7,4.
2. Solução de coloração 1
   • Tyrode da solução mais o corante FM.
   • Esta solução é utilizada para a coloração, com base na actividade sináptica evocados por estimulação eléctrica.
   • Adicionar os antagonistas dos receptores AMPA e NMDA receptors, se necessário.
3. Solução de coloração 2
   • A solução de K ⁺ de elevada Tyrode mais o corante FM.
   • Esta solução de Tyrode modificado é preparado através do aumento da concentração de KCl a 45 mM, por substituição equimolar de KCl para NaCl.
   • Esta solução é utilizada para a coloração, com base na actividade sináptica evocada por despolarização contínua.
   • Adicionar os antagonistas de receptores de AMPA e os receptores NMDA, se necessário.
4. Solução de coloração 3
   • Solução MEM mais do corante FM.
   • Esta solução é utilizada para a coloração, com base na actividade sináptica espontânea.
5. Solução de coloração 4
   • Solução MEM mais do corante FM e TTX.
   • Esta solução é utilizada para a coloração, com base na actividade sináptica em miniatura.
6. Solução 1 Lavar
   • Tyrode da solução mais os antagonistas de receptores de AMPA e os receptores NMDA, e TTX.
7. Solução 2 Enxaguar
   • Tyrode da solução mais os antagonistas de receptores de AMPA e os receptores NMDA, mas sem a TTX.

Como um exemplo, mostramos resultados representativos para o curso de tempo da descoloração das vesículas sinápticas (Figura 4). Neurónios do hipocampo em cultura foram coradas com FM4-64 utilizando a actividade sináptica espontânea (passo 2.3) e lavou-se com solução livre de corante (solução 2 enxaguamento). A imagem mostra o curso inicial de tempo de descoloração usando atividade espontânea (passo 5.3) (parte inicial da linha contínua, a Figura 4A). Isto é seguido por o curso de tempo de descoloração usando três rondas de actividade evocada, com 10 Hz campo de estimulação, durante 120 segundos cada (passo 5.1). Uma forma de medir a quantidade de descoloração evocada é ilustrada com uma seta de ponta dupla (ΔFM _Evocado) que corresponde ao tamanho do pool total de reciclagem de vesículas.

Antes foi dado o primeiro estímulo, houve uma diminuição progressiva na intensidade de FM (ampliada na Figura 4B). Esta diminuição foi composta por descoloraçãodevido à atividade sináptica espontânea (ΔFM _Spont) e fotodegradação (ΔFM _PB). Quando a contribuição de fotobranqueamento é pequeno, a alteração da linha de base preimaging (ΔFM _Spont + ΔFM _PB) pode ser usado como uma aproximação ao valor da descoloração da actividade espontânea.

Figura 1. Estruturas de corantes FM. A. FM tinge compartilha algumas características estruturais comuns. Os grupos hidrofílicos permanecer em solução aquosa e as caudas hidrofóbicas permitem que os corantes FM para ser dividida em membrana. FM2-10, FM1-43 e FM1-84 emissão verde show, enquanto que a emissão vermelho deslocado FM5-95 e FM4-64 show. B. Stereovie de FM1-43, o corante FM mais comumente usado. Grupo hidrofílico é voltada para cima e caudas hidrofóbicas estão virados para baixo. Nitrátomos Ogen são de cor azul. Por outro ponto de vista de FM1-43, ver Schote e Seelig ^63.

Figura 2. Esquema básico de utilização do corante FM. Após aplicação a neurónios, o corante FM inserida na membrana do plasma torna-se fluorescente (verde), ao passo que na solução aquosa é muito menos fluorescente (cinzento). Uma vesícula sináptica (SV) é carregado (coradas) pelo corante FM, quando sofre endocitose, normalmente a seguir a exocitose. Lavar o corante FM em solução extracelular permite apenas as vesículas manchadas de ser fluorescente. Posteriormente, uma das vesículas sinápticas é descarregado (descorados) quando ele passa por exocitose e, portanto, libera o corante FM. Uma imagem abaixo ilustra uma coloração exemplar de neurônios do hipocampo cultivadas com FM1-43 (uma sobreposição de fluorescência e fase imagens de contraste). É digno de nota que, no protocolo descrito no presente artigo, os puncta fluorescentes representam terminais pré-sinápticos nervosas (diâmetros ~ 1 mícron em neurônios centrais típicos) com aglomerados de vesículas sinápticas manchadas, e não as vesículas sinápticas individuais (diâmetro ~ 40 nm). Para simplificar, este sistema representa uma idéia geral de exo-endocitose de vesículas sinápticas. Ele pode incluir múltiplas formas de exo-endocitose, como a fusão full-colapso seguido por endocitose mediada por clatrina, o transitório beijo-and-run exo-endocitose, ea endocitose volume ^64. Clique aqui para ver uma versão maior esta figura.

Figura 3. Três tipos de atividades sinápticas estudados por imagem FM. Atividade sináptica Evocado normalmente requer estímulos externos, elétricos. Actividade sináptica espontânea ocorre na ausência de estímulos eléctricos. Atividade sináptica miniatura ocorre espontaneamente, sem estímulos elétricos e sem potenciais de ação: normalmente, o potencial de ação geração é suprimida por um bloqueador de dependentes de voltagem Na ⁺ canal, tetrodotoxina. Outras actividades incluem a actividade evocada quando a exocitose é estimulado pela solução de elevado K ⁺ (despolarização contínua), ionomicina (aumento contínuo no citoplasma concentração de ^{Ca2 +),} e uma solução contendo sacarose hipertónica (induzir exocitose de vesículas no conjunto prontamente libertável), tudo o que não vai exigir demissão potencial de ação para vesículas sinápticas se submeter a exocitose. Note-se que, em alguns estudos, a actividade espontânea é amplamente definida para incluir actividade diminuta bem.

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Figura 4. Resultado representativas de descoloração. A. neurónios do hipocampo em cultura foram coradas por actividade espontânea com 2,5 uM FM4-64 durante 10 min a 37 ° C (passo 2.3), e lavou-se (Protocolo 3). Os neurônios foram fotografadas durante descoloração com atividade espontânea (passo 5.3), e três rodadas de atividades evocados (passo 5.1) (curva contínua, média de n = 25 terminais nervosos). As barras verticais representam SEM. Eixo Y representa a intensidade absoluta de FM e "0" representa a intensidade quando um obturador da câmara é fechada. A quantidade total de descoloração evocada é indicado (ΔFM _evocados). B. Um expandiu vista da fase inicial de descoloração no painel A (curva contínua, bares SEM omitidos para maior clareza). Durante a 60 segundos de observação, a detentora deveu-se principalmente ao ato espontâneoivity (ΔFM _Spont), mas foi em parte devido à fotodegradação (ΔFM _PB). O curso do tempo fotodegradação de FM4-64 (curva pontilhada de espessura) foi determinada em um experimento separado pela imagem solucionáveis ​​FM4-64 (Protocolo 6). A taxa foi de 2-3% ao longo de 2 min (uma única função exponencial com uma constante de tempo de 5,736 segundos, determinada pelo ajuste da curva ao longo de 9 min) ^19. A curva de fotodegradação foi desenhada como uma função exponencial com um valor inicial equivalente à da intensidade medida de FM4-64. Veja a figura S5 suplementar no Kakazu et al. ¹⁹ para a fotodegradação no longo período (9 min), e com intensidade de excitação variável e tempo de exposição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Descrevemos os protocolos de coloração e descoloração vesículas sinápticas em resposta a evocada, atividade sináptica espontânea e miniatura, e para geração de imagens durante a fase de descoloração. Em adição aos protocolos existentes, que têm incluído um novo protocolo de observar a descoloração FM com base na actividade sináptica em miniatura. Usando estes protocolos, que anteriormente identificado anormalidades nos neurônios cultivados a partir de um modelo do rato da distonia distúrbio de movimento. Na comparação com os seus homólogos em camundongos selvagens, esses neurônios foram submetidos acelerado exocitose das vesículas sinápticas em Ca ^{2 +} forma-dependente quando estimulada pela alta atividade ^20. Esses neurônios também mostrou atividade sináptica em miniatura mais freqüentes, como foi confirmado por patch-clamp gravações eletrofisiológicas da liberação de neurotransmissores ^19.

O aspecto crítico do protocolo para a utilização de corantes FM nessas análises é a Assess e minimizar fotodegradação. Mudanças sutis na intensidade de fluorescência FM pode ser avaliado de forma confiável se as mudanças causadas pela fotodegradação são pequenos em comparação com aqueles desencadeados pela atividade sináptica. Fotobranqueamento reduzida também tem o potencial para suprimir ou eliminar a citotoxicidade. Fotobranqueamento pode ser reduzido, minimizando a exposição de fluoróforos a luz de excitação, e existem pelo menos duas componentes do equipamento de fazer isso em experimentos ao vivo de imagiologia. Um componente importante é um detector sensível de fótons, por exemplo, uma câmera EMCCD. Isto faz com que seja possível, para minimizar a duração e intensidade da exposição, sem afectar negativamente a detecção de emissão de fluorescência. Um componente associado é o sistema de fonte de luz, que limita a exposição do espécime com luz de excitação só quando o detector adquire imagens. Isto é facilmente alcançado por uma luz LED ^41, que permite o controle eficiente do tempo de exposição à luz (ON / OFF takes muito menos do que 1 ms). A exposição pode ser acionado somente durante a captura da imagem, por saída digital do (por exemplo, terminal "Fire" em câmera Andor) câmera. As vantagens adicionais da utilização do diodo emissor de luz incluem: a capacidade para controlar a intensidade da luz, sem o uso de filtros de densidade neutra, a estabilidade a longo prazo da intensidade da luz, e a ausência de vibrações mecânicas, que iriam interferir com o manuseamento preciso de pipetas de vidro como na gravação de patch-clamp .

De um modo geral, estruturalmente diferentes corantes photobleach a taxas diferentes sob as mesmas condições de imagem. Assim, seria ideal para avaliar o grau de fotobranqueamento do fluoróforo utilizado numa experiência em particular. Para corantes FM em terminais nervosos ao vivo, é um desafio técnico para avaliar a taxa de fotodegradação independente da atividade sináptica, devido à atividade sináptica espontânea ou em miniatura. Uma redução na intensidade da fluorescência durante tais activity pode ser devido à perda biológica de corantes FM (exocitose), a fotodegradação de corantes FM, ou de ambos. Felizmente, as estruturas dos corantes FM corrigíveis são concebidos para serem praticamente idênticas às dos corantes FM nonfixable. No protocolo descrito aqui, corantes FM corrigíveis foram carregados em vesículas sinápticas pelos mesmos métodos como corantes FM nonfixable, enquanto que a actividade sináptica depois foi bloqueada por fixação química da amostra. Notavelmente, a taxa de fotobranqueamento medido utilizando este sistema era tão baixo como 2-3% ao longo de 2 min, quando as condições de imagiologia foram os mesmos que aqueles para imagens ao vivo de células ^19.

Corantes FM pode ser usado com diferentes protocolos para explorar diversos aspectos da reciclagem das vesículas sinápticas. Diferentes actividades sinápticas durante a coloração e descoloração podem ser combinadas de várias maneiras, dependendo das finalidades experimentais e características específicas de reciclagem das vesículas sinápticas a ser avaliadas. A seleção de Antagonistas também depende da finalidade das experiências. Além disso, a imagem de FM pode ser levada a cabo durante a fase de coloração, bem como durante a fase de descoloração ^9,18,42. Também deve-se ter em mente, contudo, que os corantes FM pode ter efeitos inesperados, como bloquear os receptores de acetilcolina muscarínicos ^43, e permeando os canais mechanotransducer ^44, Ca ^{2 +} canais operados lojas ⁴⁵ e ATP receptores ^46. Concentrações elevadas de corantes FM pode potencialmente alterar a eficiência de sináptica si exocitose da vesícula ^47. Assim, recomendamos cautela na elaboração dos experimentos e interpretar os resultados em matéria de reciclagem de vesículas sinápticas. Métodos complementares a serem considerados incluem a captação em vesículas sinápticas de anticorpos cujos epitopos são domínios intra-luminais das proteínas das vesículas ^22,48. Eles também incluem expressando GFP sensível ao pH variantes alvejado a lúmen da vesícula ^49-51, e captaçãode anticorpos conjugados sensíveis ao pH ^52-54 ambos os quais detectam as variações de pH intra-vesicular acompanham exo-endocitose.

Uma vez que tais efeitos indesejados são excluídas, corantes FM tem amplas aplicações. Por exemplo, eles podem ser utilizados para abordar se os mesmos conjuntos de vesículas sinápticas são partilhados por espontânea e libertação evocada vesículas ^17,55, em que medida a eficiência da reciclagem de vesícula sináptica pode ser regulada ^56,57, e que efeitos de um estado anterior (repouso ou estimulada) exercem sobre o estado depois de reciclagem com base na vesícula, por exemplo, espontânea e atividade sináptica em miniatura. Corantes FM também pode ser utilizado para avaliar a reciclagem de vesículas sinápticas, ao nível ultra-estrutural, correlacionando observações de microscopia óptica e electrónica pelo método fotoconversão FM ^30,58-62. Corante FM pode ser utilizado para monitorizar simultaneamente funções sinápticas e Ca ^{2 +} intracelular concentração ^5. Em adição à marcação das vesículas sinápticas, os corantes de FM e de outros marcadores fluorescentes em fase fluido, tal como o dextrano fluorescente ⁷ pode ser utilizado para monitorar a endocitose em massa que é accionado por uma intensa actividade neuronal. Em conclusão, as aplicações dos corantes FM oferecem uma valiosa fonte de informações sobre a reciclagem de vesículas sinápticas e as funções sinápticas adicionais.

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Os autores agradecem aos membros do laboratório Harata para discussões úteis durante toda a execução deste trabalho. Este trabalho foi financiado por doações da Associação Americana do Coração, a Fundação Distonia Pesquisa Médica, o Edward Mallinckrodt, Fundação Jr., da National Science Foundation e da Fundação Whitehall para NCH