Esame delle vescicole sinaptiche Riciclaggio Uso FM coloranti Durante evocati, spontaneo, e miniatura Attività Synaptic

Descriviamo l'uso di coloranti stirilico FM per l'immagine riciclo delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi funzionali. Questo protocollo può essere applicato non solo evocata, ma anche spontanea e attività sinaptiche in miniatura. Il protocollo espande la varietà di eventi sinaptici che possono essere adeguatamente valutati.

Vescicole sinaptiche nelle terminazioni nervose funzionali subiscono esocitosi e endocitosi. Questo riciclo delle vescicole sinaptiche può essere efficacemente analizzata utilizzando coloranti stirilico FM, che rivelano fatturato membrana. Protocolli convenzionali per l'uso di coloranti FM sono stati progettati per analizzare neuroni seguente stimolata (evocati) attività sinaptica. Recentemente, protocolli sono resi disponibili per analizzare i segnali FM che accompagnano attività sinaptica deboli, come eventi sinaptici spontanei o miniatura. L'analisi di queste piccole variazioni di segnali FM richiede che il sistema di imaging è sufficientemente sensibile per rivelare piccole variazioni di intensità, ma che i cambiamenti artefatti di grande ampiezza vengono soppressi. Qui si descrive un protocollo che può essere applicato a evocata, spontanea, e attività sinaptiche in miniatura, e utilizzando colture di neuroni ippocampali come esempio. Questo protocollo incorpora anche un mezzo per determinare il tasso d'photobleaching di coloranti FM, in quanto questo è un significativofonte di artefatti quando di imaging piccole variazioni di intensità.

La funzionalità di vescicole sinaptiche è un importante determinante della trasmissione sinaptica. Tali vescicole rilasciano neurotrasmettitori quando si fondono con la membrana plasmatica presinaptica (esocitosi), e sono pronte per un altro ciclo di stampa dopo essere rigenerata dalla membrana plasmatica (endocitosi) e ricaricato con neurotrasmettitore. La ricerca sulla dinamica dei meccanismi sottostanti e riciclo delle vescicole sinaptiche è stata notevolmente accelerato dall'introduzione di coloranti styryl FM ^1. Queste molecole anfipatiche, che hanno carica positiva gruppi di testa idrofile e code idrofobiche (più coloranti in figura 1A, stereoview di FM1-43 in Figura 1B), possono reversibilmente entrare e uscire membrane lipidiche senza permea. Gruppi di coloranti FM condividono caratteristiche simili che influenzano la gamma di luce che essi emettono. Ad esempio, FM2-10, FM1-43, e FM1-84 hanno un doppio legame tra due composti ciclici e show emissione verde. La differenza tra loro è la lunghezza della coda idrofoba, che determina la sua idrofobicità e quindi il tasso di uscita dalla membrana (departitioning). Nei casi di FM5-95 e FM4-64, tre doppi legami collegano i composti ciclici, e mostrano emissione rossa. Questi coloranti differiscono rispetto alle loro parti idrofile. In tutti i coloranti FM, l'intensità di fluorescenza aumenta quando inseriti nelle membrane biologiche, a causa di un aumento della resa quantica nell'ambiente idrofobo rispetto all'ambiente idrofilo. Così i cambiamenti di intensità FM rappresentano le variazioni del fatturato membrana. I diversi colori (spettri di emissione) e idrofobicità rendono la FM tinge uno strumento di ricerca versatile nel riciclo delle vescicole sinaptiche.

Sulla base di queste caratteristiche, i coloranti FM sono principalmente utilizzati secondo il seguente schema nell'analisi riciclo delle vescicole sinaptiche (Figura 2). Neurons sono immersi in una soluzione extracellulare contenente il colorante FM, permettendogli di essere ripreso in vescicole sinaptiche (SVs), in quanto costituiscono via endocitosi (colorazione). Il colorante viene poi lavata applicando una soluzione extracellulare priva di coloranti; questo rivela terminazioni nervose funzionali, cioè solo quelli sottoposti attivamente endocitosi conterrà un cluster di vescicole sinaptiche che vengono caricati con il colorante (Figura 2 in basso). Esocitosi successiva porta alla perdita del colorante FM allo spazio extracellulare e una perdita concomitante di fluorescenza (decolorante, dovuto sia alla departitioning ad un ambiente idrofilo e diffusione lontano dal sito di esocitosi). Pertanto le variazioni di intensità di fluorescenza FM sono indicatori di vescicole sinaptiche eso-ed endocitosi.

Coloranti FM sono stati utilizzati per macchiare e Destain le vescicole sinaptiche in vari organismi e preparati ^2,3. Gli esempi includono neur mammifericulture onal ^4-9, mammiferi fettine di cervello ^10,11, giunzioni neuromuscolari ^12,13, retina neuroni bipolari ^14,15 e le cellule ciliate della coclea ^16.

Tipicamente in tali esperimenti, sia di colorazione e decolorazione sono innescati da ampiamente stimolando i neuroni (attività evocata). Recentemente, tuttavia, riciclo delle vescicole sinaptiche in risposta alla stimolazione debole è stato anche analizzato, come ha riciclo in assenza di uno stimolo esterno (attività sinaptica spontanea e miniatura) ^9,17-19. Attività sinaptiche spontanee e miniaturizzati sono definiti come quelle che si verificano in assenza di stimoli esterni, le prime riguardano la scarica spontanea dei potenziali d'azione (Figura 3). Queste attività sinaptiche deboli sono associati a piccoli cambiamenti nei segnali FM rispetto a quelli attivati ​​dalla stimolazione ampio. La misurazione richiede che le variazioni fl FMIntensità mento riflette accuratamente synaptic esocitosi delle vescicole o endocitosi ma le modifiche non artefatti di intensità. Una causa del manufatto è la presenza di marcatura non specifica della membrana plasmatica da coloranti FM. Washout graduale di questo componente comporti un cambiamento graduale nell'intensità di fluorescenza misurata, che sarà erroneamente attribuita ad attività sinaptica. Questo fattore può essere ridotto con metodi appropriati (vedi Protocol). La causa più notevole del manufatto è il photobleaching di colorante FM trattenuto all'interno vescicole sinaptiche. I cambiamenti Fotodecolorazione relativi a intensità FM devono essere piccoli in confronto ai biologiche (Synaptic) le modifiche che vengono misurati. Il recente sviluppo di telecamere sensibili, per esempio la fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica-elettroni moltiplicando (EMCCD), permette di minimizzare photobleaching accorciando il tempo di esposizione e indebolendo l'intensità della luce usata per eccitare il fluoroforo. Un'altra causa del manufatto è a i driftn il livello di messa a fuoco del microscopio ottico. La deriva fuoco durante una sessione di imaging può essere causato da effetti meccanici o termici, e verrà erroneamente portare ad un cambiamento nell'intensità di fluorescenza misurata.

Qui si descrive protocolli e apparecchiature che consentono di utilizzare coloranti FM analizzare riciclo delle vescicole sinaptiche anche nell'ambito di stimolazione debole o non, in particolare, l'attività sinaptica miniatura. Mostriamo esempi di colorazione e decolorazione delle vescicole sinaptiche durante gli eventi evocati e spontanei, utilizzando colture di neuroni dell'ippocampo roditori, e di imaging la fase di decolorazione. Dimostriamo anche il modo di valutare il grado di FM colorante photobleaching, in assenza di eventuali perdite colorante FM a causa di attività sinaptica.

1. Cultura primarie di neuroni dal cervello dei mammiferi

Tutte le procedure sugli animali eseguiti in questo studio sono approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali e uso della University of Iowa.

1. Preparare la coltura cellulare dissociata delle regioni CA3-CA1 dell'ippocampo di topi o ratti a giorni postnatali 0-1 ^19,20. Piastra le cellule dell'ippocampo sulle lamelle 12 mm (spessore numero 0) preconfigurate con lo strato alimentatore ratto gliali, in piatti da 24 pozzetti, e ad una densità di 12.000 cellule / pozzetto.
2. Cultura i neuroni dell'ippocampo per almeno 8 giorni per i terminali nervosi funzionali a sviluppare ^21. Usiamo i neuroni in 11-14 giorni in vitro in cui i terminali nervosi individuali sono relativamente isolati senza molto clustering. Neuroni possono essere usate per esperimenti fino a circa 21-28 giorni in vitro es Willig et al. ²² e Nosyreva e Kavalali ^23.
3. Perstudi funzionali, valutano coprioggetti (prima della colorazione) per gli indicatori di neuroni sani utilizzando la microscopia a luce trasmessa (ad es ottica a contrasto di fase con un ingrandimento di 10-20X). Gli indicatori di buona salute includono: uno strato uniforme di cellule gliali, un chiaro margine di cellulare intorno ai neuroni, dendriti estesi senza strutture in rilievo, la mancanza di somata cluster, e la mancanza di neuriti bundle.

2. Caricare il Synaptic vescicole con il Dye FM (colorazione)

1. Colorazione a causa di attività sinaptica evocata dalla stimolazione campo elettrico (comporta potenziali d'azione)
   1. Preparare colorazione Soluzione 1 aggiungendo il colorante FM ad una soluzione priva di colorante a base di HEPES, ad esempio, la soluzione di Tyrode (vedi SOLUZIONI per i dettagli). La concentrazione di colorante FM è 10 mM FM1-43 e 2,5 micron FM4-64. Intervalli di concentrazione tipici sono: 2-15 mM FM1-43, o 2,5-20 mM FM4-64 ^3,6. Per gli esperimenti che richiedono la soppressione delle recidiveattività sinaptica glutammatergica e l'induzione della plasticità sinaptica, aggiungono ulteriore antagonisti dei recettori del glutammato ionotropici: i recettori AMPA (ad esempio 10 micron CNQX) e recettori NMDA (per esempio 50 micron AP5).
   2. Trasferire un coprioggetto con cellule dal mezzo di coltura alla camera di imaging preriempita con soluzione di Tyrode pianura. Usiamo una camera di imaging con gli elettrodi di stimolazione attaccati alle pareti laterali (fili di platino separati di 6,3 mm RC-21BRFS). Questa camera è concepito come una camera di imaging chiusa, ma lo usiamo come una camera aperta (cioè senza un vetrino in alto), con un volume bagno di ~ 200 microlitri. Durante il trasferimento, non esporre le cellule coltivate all'aria, ed evitare di pizzicare le cellule in coltura con le pinzette (scegliere il vetrino dal perimetro piuttosto che vicino al centro).
   3. Perfusione camera di imaging con la soluzione di Tyrode normale a temperatura ambiente (23-25 ​​° C).
   4. Applicare la colorazione Soluzione 1 da coperfusione nstant.
   5. Evocare attività sinaptica applicando impulsi elettrici. Per la colorazione massima del pool totale riciclo delle vescicole sinaptiche nei neuroni dell'ippocampo, stimolare le colture a 10 Hz per 60-120 sec ^24. Quando si cerca di raggiungere l'efficienza massima di stimolazione del campo, tenere diverse caratteristiche in mente. 1) L'altezza della soluzione del bagno dovrebbe essere il più basso possibile, mantenendo i neuroni e stimolante elettrodi completamente immersi in un sottile strato di soluzione di Tyrode (per mantenere i neuroni vivi e di ottenere un campo elettrico omogeneo). 2) L'intensità e la durata devono essere ottimizzati utilizzando un indicatore di eccitabilità neuronale, ad esempio fluorescente Ca ^{2 +} di imaging; nel nostro caso, una corrente costante di 30 mA intensità e la durata di 1 msec dà risultati affidabili. 3) La soluzione del bagno deve essere applicato a flusso costante durante la stimolazione, la stimolazione elettrica porta ad elettrolisi, causando protoni (H ^{+) per accumulare all'anodo carica positiva e il pH vicino l'anodo a diminuire rapidamente in un bagno statico. Controllare l'acidificazione in un esperimento separato passando più di poche centinaia di impulsi attraverso una soluzione contenente un pH-indicatore (soluzione salina bilanciata es Hanks 'con rosso fenolo).}
   6. Lasciare i neuroni nella soluzione colorante 1 per un ulteriore 60 sec dopo stimolazione campo è terminata, in modo che il post-stimolo endocitosi sarà completata ^25.
   7. Lavare la soluzione colorante fuori dalla camera di imaging mediante perfusione con soluzione di lavaggio 1, una soluzione di Tyrode senza colorante più antagonisti dei recettori AMPA e NMDA (vedere la sezione 2.1.1), e un bloccante dei canali Na ⁺ voltaggio-dipendenti ( ad esempio 0,5-1 micron tetrodotossina, TTX). La combinazione di blocco evita la perdita di colorante FM attraverso l'attività sinaptica spontanea. Per massimizzare l'efficienza di lavaggio, aumentare il tasso di perfusione ( esempio fino a 5-6 ml / min) per 1-2 min, e aggiungere un bolo (ad esempio 1 ml) di soluzione di risciacquo 1 direttamente alla camera di imaging aperta manualmente, mediante pipetta. Controllare la forza e la direzione di infusione manuale, in modo da non disturbare i neuroni in coltura.
2. Colorazione a causa di attività sinaptica evocata dalla soluzione high-K ⁺ (non comporta potenziali d'azione).
   1. Preparare colorazione soluzione 2, aggiungendo il colorante FM alla soluzione di alto K ⁺ Tyrode. In particolare, preparare una soluzione di Tyrode modificato con 45 mM KCl, per sostituzione equimolare di KCl di NaCl. Se necessario, aggiungere antagonisti dei recettori AMPA e NMDA. Questa soluzione high-K ⁺ sarà depolarizzare neuroni continuamente, attivare Ca ^{2 +} afflusso nelle terminazioni nervose, e di avviare delle vescicole sinaptiche esocitosi nella misura massima ^26. Concentrazioni più elevate (70-90 mm) sono stati utilizzati anche in altre relazioni es Klingauf et al. ²⁷ und Richards et al ^28.
   2. Trasferire un coprioggetto con i neuroni in coltura dal mezzo di coltura alla camera di imaging preriempita con soluzione di Tyrode pianura.
   3. Macchiare i neuroni a temperatura ambiente per 1-2 min applicando soluzione colorante 2 a perfusione costante o usando una pipetta ^26,28. In quest'ultimo caso, la concentrazione finale colorante dovrebbe essere controllato con l'aggiunta di un volume noto di soluzione colorante 2 ad un volume noto di soluzione senza colorante.
   4. Lavare la soluzione colorante fuori dalla camera di imaging, come descritto nella sezione 2.1.7.
3. Colorazione a causa di attività sinaptica spontanea e in miniatura.
   1. Soluzione Preriscaldare basata bicarbonato-(es mezzo essenziale minimo, MEM) a 37 ° C ponendo in incubatrice cultura per più di 60 min.
   2. Per la colorazione basato su attività sinaptica spontanea, preparare soluzione colorante 3 aggiungendo il colorante FM a MEM. Per la colorazione basato su miniature attività sinaptica, preparare la soluzione colorante 4 aggiungendo TTX per la soluzione colorante 3.
   3. Neuroni macchia trasferendo un vetrino coprioggetto con neuroni coltivati ​​da terreno di coltura per la colorazione soluzione 3 o 4, e lasciandoli nella stessa soluzione colorante a 37 ° C per 10 min.
   4. Sciacquare il vetrino brevemente nella soluzione di risciacquo 1.
   5. Trasferire il vetrino di soluzione di risciacquo 1 in una camera di imaging. Tenete a mente quanto segue. 1) Le cellule non dovrebbero essere esposti all'aria, se necessario, trasferire il vetrino direttamente alla camera di imaging senza risciacquo. 2) I neuroni possono essere colorati a temperatura ambiente sostituendo soluzione colorante 3 o 4 con una soluzione basata HEPES. 3) I neuroni possono essere colorati per attività sinaptica evocata nel contesto della soluzione high-K ⁺ utilizzando questo metodo, sostituendo soluzione colorante 3 o 4 con soluzione colorante 2 ed eseguire le fasi rimanenti a temperatura ambiente.
   6. Lavare la soluzione colorante di imagingCamera come descritto nella sezione 2.1.7.

3. Lavare il Dye FM

1. Dopo la colorazione neuronale e lavaggio iniziale da uno qualsiasi dei metodi sopra descritti (sezione 2.1.7), continuare a perfusione camera di imaging con soluzione di risciacquo 1 per 5-10 minuti a temperatura ambiente. Questo rimuoverà il colorante FM dalla membrana plasmatica e la soluzione extracellulare. Nel caso di una camera di imaging, il tasso bagno perfusione è 600-1.200 ml / min. Lavaggio può essere effettuato anche in assenza di Ca ^{2 +} extracellulare per sopprimere FM perdita colorante a causa di attività sinaptica ^17. I lavaggi possono essere migliorate breve applicazione di Advasep-7, una ciclodestrina modificata che serve come scavenger di coloranti FM dalla membrana plasmatica ^29-31. È fondamentale mantenere qualsiasi Advasep-7 esposizione breve (ad esempio 5 secondi nel caso di coltura monostrato) per evitare sia riducendo l'intensità di FM puncta ³¹ e compromettere la health delle cellule. La fluorescenza da FM1-43 nella membrana plasmatica può essere soppressa da un'applicazione di un sulforodamina quencher 101 (50-100 mM) che non entra vescicole sinaptiche ^32.

4. Ricerca di un campo immagine ottimale durante il lavaggio

1. Verificare che le celle nel campo da acquisire sono sani, utilizzando la microscopia a luce trasmessa con una lente obiettivo ad alto ingrandimento e high-numerico-apertura (ad esempio 40X). Da questa sezione, continuiamo ad usare un microscopio invertito (Eclipse Ti, Nikon) equipaggiato con contrasto di fase o ottica a contrasto di interferenza differenziale. Questo microscopio è dotato anche perfetto Focus System (PFS) che consente continuo, Correz.mes.fuoco tempo reale, che supera il focus deriva microscopio. Questa caratteristica è essenziale per time-lapse imaging durante decolorazione con lo stesso piano di messa a fuoco.
2. Verificare che la colorazione è stata efficace, utilizzando l'ottica in fluorescenza. Avaggregati OID puncta FM a meno che non siano oggetto di ricerca, perché i singoli boutons sarà difficile da discernere. Prestare attenzione alle forme del puncta FM: se la maggior parte dei boutons colorati appaiono come fili di perle circolari, potrebbero rappresentare terminali nervosi sani. Minimizzare l'esposizione dei neuroni di forte eccitazione di fluorescenza per evitare photobleaching.

5. Scarico FM Dye dal Synaptic vescicole (decolorante)

1. Decolorazione a causa di attività sinaptica evocata dalla stimolazione campo elettrico.
   1. Lavare TTX out mediante perfusione neuroni ampiamente con una soluzione di lavaggio 2 (come soluzione di risciacquo 1 ma senza TTX). Confermare l'efficacia di TTX washout in esperimenti separati, utilizzando gli stessi parametri di lavaggio (tasso di perfusione e durata), ad esempio mediante Ca fluorescente ^{2 +} imaging citoplasmatici Ca ^{2 +} transitori indotti dalla stimolazione campo oppure la registrazione patch-clamp di voltcorrenti età-dipendenti Na ^+.
   2. Avviare l'imaging i coloranti FM. Per l'imaging FM1-43 o FM4-64, usare 520 nm o 650 filtri di emissione lungo in nm, rispettivamente, e un filtro di eccitazione 490 nm. Acquisire immagini ogni 1-2 secondi, con un breve tempo di esposizione (ad esempio 10-20 msec), l'intensità di eccitazione debole (ad esempio 5-10% dei LED di potenza), e alta sensibilità (ad esempio con guadagno EM). Ridurre al minimo photobleaching dei coloranti FM, riducendo il tempo di esposizione e l'intensità della fluorescenza di eccitazione. Ridurre al minimo l'attenzione deriva microscopio attivando il sistema di messa a fuoco perfetta.
   3. Stimolare i neuroni nella soluzione di risciacquo 2, utilizzando il campo di stimolazione (ad esempio a 10 Hz per 120 sec) ^20.
   4. Applicare vari cicli di stimolazione, con intermedi periodi di riposo di 1-2 minuti, a esaurire tutte le vescicole sinaptiche riciclaggio di colorante FM. Questo è importante nel valutare la dimensione del pool totale riciclo delle vescicole sinaptiche che sono stati colorati con coloranti FM in the prima lo stato ^20,33.
2. Decolorazione a causa di attività sinaptica evocata in assenza di potenziali d'azione.
   1. Avviare l'imaging del colorante FM.
   2. Applicare i reagenti stimolanti disciolti in soluzione di risciacquo 1 o 2. Tali reagenti comprendono: KCl (soluzione high-K ^+, ad esempio 45 mm) ^26, ionomicina (ionoforo Ca ^{2 +} che solleva il ^{Ca2 +} intracellulare concentrazione consentendo Ca ^{2 +} afflusso nella cellula dalla soluzione extracellulare, utilizzato ad esempio in 5 mM) ^20,34, e saccarosio (una soluzione ipertonica che stimola il rilascio di vescicole sinaptiche from pool facilmente rilasciabile, ad esempio utilizzato a 500 mM) ^35,36. Utilizzare un veloce sistema di perfusione, locale per un controllo temporale affidabile nell'applicazione dei reagenti, ad esempio il sistema SF-77B da Warner Instruments ^37, o il sistema Y-tube ^38-40.
3. Decolorazione a causa di spontaneo e minminiatura valida attività sinaptica.
   1. Per la decolorazione a causa di attività sinaptica spontanea, lavare TTX come sopra (punto 5.1.1), con soluzione di risciacquo 2. Avviare l'imaging coloranti FM, mentre i neuroni perfusione con soluzione di risciacquo 2. Per la decolorazione a causa di attività sinaptiche in miniatura, avviare l'imaging coloranti FM, pur continuando a perfusione i neuroni con soluzione di risciacquo 1 (con TTX).
   2. Dopo la decolorazione sulla base dell'attività spontanea o in miniatura, identificare le terminazioni nervose funzionali da decolorazione via sinaptica evocata. L'attività può essere evocato da una delle procedure sopra descritte. Questo processo di identificazione è necessario perché le strutture colorate possono essere diversi da quelli terminazioni nervose funzionali (ad es lentamente riciclaggio endosomi o vescicole astrociti) e una grande quantità di decolorante dai ausili attività evocate in questo processo.

6. Valutare la Photobleaching Tasso di FM Coloranti

1. Macchiare le terminazioni nervose con aldeide-fissabile FM colorante (es. FM1-43FX, FM4-64FX). Questo può fare usando l', spontanea, o miniatura metodo di colorazione evocato sopra descritto, e sostituendo colorante FM con un colorante fissabile FM.
2. Lavare la fissabile colorante FM come descritto nella sezione 2.1.7.
3. Chimicamente fissare i neuroni trasferendo il coprioggetto soluzione fissativa: 4% paraformaldeide e 4% di saccarosio in soluzione di Tyrode per 30 min a 4 ° C. L'intensità di fluorescenza del colorante fissabile FM sarà mantenuto dopo fissazione chimica.
4. Lavare il fissativo per 10 minuti in una soluzione di Tyrode, trasferendo il vetrino alla soluzione di Tyrode fresco due volte.
5. Trasferire il vetrino nella soluzione di Tyrode fresca nella camera di imaging.
6. Avviare imaging del fissabile colorante FM utilizzando lo stesso insieme di parametri di imaging come per i neuroni vivi. È importante risciacquare la camera di imaging molto bene dopo usando qualsiasi campione fissato chimicamente, perchéqualsiasi fissativo rimanente può influenzare i successivi esperimenti di imaging live-cell svolte nella stessa camera. In alternativa al imaging cellulare fisso, le cellule vive macchiate potrebbero essere esposte per determinare il tasso photobleaching. Tuttavia, si deve tener presente che è difficile bloccare l'attività sinaptica miniatura acutamente, ad esempio, la frequenza di attività miniatura può essere ridotta a ~ 50% rimuovendo il Ca ^{2 +} extracellulare ^23, ma non è un completo blocco.
7. Al termine di ogni sessione di imaging, acquisire un'immagine di sfondo per valutare il valore assoluto dell'intensità di fluorescenza FM. L'intensità di puncta FM rappresenta non solo il vero segnale dai coloranti FM in terminazioni nervose, ma anche il rumore di fondo da 1) cellule gliali che sono alla base della coltura monostrato neuronale, 2) il coprioggetto e componenti ottici (lenti es obiettivo, filtri e specchi), e 3) il rivelatore (telecamera EMCCD). Il rumore di fondo è assessed in regioni nonstained del campo immaginata. Quando tali regioni sono limitate nello spazio o eterogeneo in intensità, sostituirlo con un'immagine con l'otturatore chiuso e acquisire rumore dal rivelatore, anche se non è un metodo ideale. Acquisire circa 10 immagini utilizzando gli stessi parametri di imaging.

7. Image Analysis

1. Importare i dati acquisiti nel software di analisi delle immagini come una pila di immagini di serie temporali. Usiamo ImageJ (WS Rasband, NIH) e il plug-in associati, ad esempio, stabilizzatore d'immagine plug-in (Kang Li) per correggere un piccolo grado di movimento fra puncta FM, e Time Series Analyzer V2.0 (Balaji Jayaprakash) per l'analisi le serie storiche.
2. Calcolare le variazioni di intensità FM all'inizio e alla fine della serie (ΔFM). A tal fine, la media delle immagini prima dell'inizio decolorante e dopo la fine del decolorante (es 5 fotogrammi dell'immagine ciascuno), e generare un'immagine differenza da subtractinli g.
3. Identificare i terminali nervosi potenzialmente funzionali applicando una soglia di intensità all'immagine differenza, e rilevare i cui pixel sono intensità superiore alla soglia. Un metodo di impostazione della soglia è scegliere la deviazione standard dell'intensità sfondo ottenuta dalla zona coprioggetto nudo.
4. Identificare le terminazioni nervose isolate e funzionali come i pixel contigui che sono stati rilevati e che soddisfano un criterio di dimensione (numero minimo e massimo di pixel in contiguità). Questo processo elimina il rumore di fondo e terminazioni nervose aggregati di analisi.
5. Assegnare regioni di interesse (ROI) sui cluster di pixel rilevati (con i singoli cluster corrispondente al terminazioni nervose individuali). La variazione totale di intensità durante la decolorazione (ΔFM) è un parametro tipico di analisi. Questo rappresenta il valore complessivo delle evocato, spontanea o miniatura attività sinaptica. Escludere ROI se presentano una delle seguenticambiamenti di intensità a seconda della finalità degli esperimenti: un incremento durante la registrazione, una diminuzione improvvisa prima della stimolazione, o una lunga latenza dopo stimolazione.
6. Valutare il tasso di photobleaching importando i dati di serie temporali acquisite nel software di analisi delle immagini. La media delle immagini di sfondo (ad esempio con un otturatore chiuso), e sottrarla dalle singole immagini. Assegnare ROI di puncta FM che ipoteticamente corrispondono alle terminazioni nervose, e misurare le variazioni di intensità ROI nel corso del tempo.

Soluzioni

1. Soluzione di Tyrode
   • Composizione (in mM): 125 NaCl, KCl 2, 2 CaCl _2, 2 MgCl _2, 30 glucosio, 25 HEPES, 310 mOsm, pH 7.4.
2. Soluzione colorante 1
   • Tyrode della soluzione più il colorante FM.
   • Questa soluzione viene utilizzata per la colorazione, sulla base di attività sinaptica evocata da stimolazione elettrica.
   • Aggiungere gli antagonisti dei recettori AMPA e NMDA receptors se necessario.
3. Soluzione colorante 2
   • La soluzione di alta K ⁺ Tyrode più il colorante FM.
   • Questa soluzione di Tyrode modificato è preparato aumentando la concentrazione di KCl 45 mM, per sostituzione equimolare di KCl di NaCl.
   • Questa soluzione viene utilizzata per la colorazione, sulla base di attività sinaptica evocato da depolarizzazione continua.
   • Aggiungere gli antagonisti dei recettori AMPA e NMDA se necessario.
4. Soluzione colorante 3
   • Soluzione MEM più il colorante FM.
   • Questa soluzione viene utilizzata per la colorazione, sulla base di attività sinaptica spontanea.
5. Soluzione colorante 4
   • Soluzione MEM più il colorante FM e TTX.
   • Questa soluzione viene utilizzata per la colorazione, sulla base di attività sinaptica miniatura.
6. Soluzione di risciacquo 1
   • Tyrode della soluzione più gli antagonisti dei recettori AMPA e recettori NMDA, e TTX.
7. Soluzione di risciacquo 2
   • Tyrode della soluzione più gli antagonisti dei recettori AMPA e recettori NMDA, ma senza TTX.

Come esempio, mostriamo risultati rappresentativi per il decorso decolorante di vescicole sinaptiche (Figura 4). Neuroni dell'ippocampo in coltura sono state colorate con FM4-64 utilizzando l'attività sinaptica spontanea (fase 2.3) e lavato con una soluzione priva di colorante (soluzione di risciacquo 2). La rappresentazione mostra l'andamento iniziale tempo decolorante utilizzando attività spontanea (passo 5.3) (parte iniziale della linea continua, Figura 4A). Segue il decorso decolorante utilizzando tre turni di attività evocata con campo 10 Hz stimolazione per 120 sec ogni (passo 5.1). Un modo per misurare la quantità di decolorante evocata è illustrata con una freccia a doppia punta (ΔFM _evocati) che corrisponde alla dimensione del pool totale riciclo di vescicole.

Prima è stato dato il primo stimolo, c'è stata una graduale riduzione dell'intensità FM (ingrandito nella Figura 4B). Tale diminuzione è composto di decolorazionea causa di attività sinaptica spontanea (ΔFM _Spont) e photobleaching (ΔFM _PB). Quando il contributo di photobleaching è piccolo, il cambiamento dal basale preimaging (ΔFM _Spont + ΔFM _PB) può essere utilizzato come approssimazione alla quantità decolorante di attività spontanea.

Figura 1. Strutture di coloranti FM. A. FM coloranti condivide alcune caratteristiche strutturali comuni. I gruppi idrofili rimangono in soluzione acquosa e le code idrofobiche permettono i coloranti FM da partizionare in membrana. FM2-10, FM1-43 e FM1-84 mostra emissioni verde, mentre FM5-95 e FM4-64 mostra emissioni spostata verso il rosso. B. Stereoview di FM1-43, il colorante FM più comunemente usato. Gruppo idrofilo è rivolto verso l'alto e code idrofobiche sono rivolto verso il basso. Nitratomi Ogen sono di colore blu. Per un'altra vista della FM1-43, vedere Schote e Seelig ^63.

Figura 2. Schema di base di utilizzo colorante FM. Dopo l'applicazione di neuroni, il colorante FM inserita nella membrana plasmatica diventa fluorescente (verde), mentre quella della soluzione acquosa è molto meno fluorescente (grigio). Viene caricata una vescicole sinaptiche (SV) (macchiata) dal colorante FM, quando subisce endocitosi, esocitosi tipicamente seguente. Lavando il colorante FM in soluzione extracellulare consente solo le vescicole macchiate di essere fluorescente. Successivamente, una vescicola sinaptica viene scaricato (decolorato) quando subisce esocitosi e quindi rilascia il colorante FM. L'immagine seguente mostra una colorazione esemplare di neuroni dell'ippocampo in coltura con FM1-43 (una sovrapposizione di immagini a contrasto di fase e fluorescenza). E 'da notare che, nel protocollo descritto in questo documento, i puncta fluorescenti rappresentano terminali presinaptici nervose (diametro ~ 1 micron nei neuroni tipici centrali) con grappoli di vescicole sinaptiche macchiati, non i singoli vescicole sinaptiche (diametro ~ 40 nm). Per semplicità, questo sistema rappresenta una idea generale di eso-endocitosi delle vescicole sinaptiche. Può includere molteplici forme di eso-endocitosi, come ad esempio la fusione completa crollo seguito da clatrina-mediata endocitosi, il transitorio-and-run bacio eso-endocitosi, e l'endocitosi di massa ^64. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Tre tipi di attività sinaptiche studiate da imaging FM. Attività sinaptica evocata in genere richiede, stimoli elettrici esterni. Attività sinaptica spontanea avviene in assenza di stimoli elettrici. Attività sinaptica Miniature avviene spontaneamente senza stimoli elettrici e senza potenziali d'azione: di solito il potenziale d'azione generazione è soppresso da un blocco di voltaggio-dipendenti Na ⁺ canale, tetrodotossina. Altre attività includono l'attività evocata quando exocytosis è stimolata dalla soluzione high-K ⁺ (depolarizzazione continuo), ionomicina (continuo aumento citoplasmatica di Ca ^{2 +} concentrazione), e la soluzione ipertonica contenente saccarosio (suscitando esocitosi di vescicole in piscina facilmente rilasciabile), tutti che non richiede potenziale d'azione di tiro per vescicole sinaptiche sottoporsi esocitosi. Si noti che, in alcuni studi, l'attività spontanea è ampiamente definito per includere attività miniatura pure.

IGURA 4 "fo: content-width =" 5in "src =" / files/ftp_upload/50557/50557fig4highres.jpg "width =" 500 "/>
Figura 4. Risultato rappresentativa di decolorante. A. colture di neuroni ippocampali sono state colorate per attività spontanea con 2,5 mM FM4-64 per 10 min a 37 ° C (punto 2.3), e lavate (protocollo 3). I neuroni sono stati ripresi durante la decolorazione con l'attività spontanea (punto 5.3), e tre turni di attività evocate (passo 5,1) (curva continua, in media di n = 25 terminali nervosi). Le barre verticali rappresentano SEM. Asse Y rappresenta l'intensità FM assoluto e "0" rappresenta l'intensità quando un otturatore è chiuso. La quantità totale di decolorante evocato viene indicata (ΔFM _Evocati). B. Una ampliato vista della fase iniziale del decolorante in pannello A (curva continua, SEM bar omesse per chiarezza). Nel corso di una osservazione di 60 secondi, detentrice è dovuto principalmente atto spontaneoivity (ΔFM _Spont), ma è in parte dovuto alla photobleaching (ΔFM _PB). La durata photobleaching di FM4-64 (curva tratteggiata spessa) è stato determinato in un esperimento separato per l'imaging risolvibile FM4-64 (Protocollo 6). La tariffa era 2-3% di 2 min (una singola funzione esponenziale con una costante di tempo di 5.736 secondi, determinato dalla adattano 9 min curva) ^19. La curva fotoscolorimento stato disegnato come una funzione esponenziale con un valore iniziale di quella dell'intensità misurata di FM4-64. Vedere la Figura S5 supplementari in Kakazu et al. ¹⁹ per la photobleaching per il periodo più lungo (9 min), e con l'intensità di eccitazione variabile e tempo di esposizione. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Abbiamo descritto protocolli per la colorazione e decolorazione vescicole sinaptiche in risposta evocata, attività sinaptica spontanea e miniatura, e per l'imaging durante la fase di decolorazione. Oltre ai protocolli esistenti, abbiamo incluso un nuovo protocollo di osservare il decolorante FM basato su attività sinaptica miniatura. L'utilizzo di questi protocolli, abbiamo precedentemente identificato anomalie nei neuroni in coltura da un modello murino della malattia movimento distonia. In confronto alle loro controparti in topi wild-type, quei neuroni stati sottoposti accelerati sinaptica esocitosi delle vescicole in ² modo ^+-dipendente Ca quando sono stimolati da elevata attività ^20. Tali neuroni hanno anche mostrato più frequente attività sinaptica in miniatura, come confermato dalla patch-clamp registrazioni elettrofisiologiche di neurotrasmettitore rilascio ^19.

L'aspetto critico del protocollo per usare coloranti FM in tali analisi è quello di Assess e minimizzare photobleaching. Sottili cambiamenti di intensità di fluorescenza FM possono essere valutati in modo attendibile se i cambiamenti causati dalla photobleaching sono piccoli in confronto a quelli innescati da attività sinaptica. Fotodecolorazione ridotta ha anche il potenziale per sopprimere o eliminare citotossicità. Fotoscolorimento può essere ridotto al minimo l'esposizione di fluorofori a luce di eccitazione, e ci sono almeno due componenti di apparecchiature per farlo in esperimenti live-imaging. Una componente importante è un rivelatore sensibile di fotoni, ad esempio una telecamera EMCCD. Ciò permette di minimizzare la durata e l'intensità dell'esposizione senza influire negativamente sulla rilevazione di emissione di fluorescenza. Un componente è associato il sistema sorgente luminosa che limita l'esposizione del campione a luce di eccitazione solo quando il rivelatore acquisisce immagini. Questo è facilmente ottenibile da una luce a LED ^41, che consente un controllo efficace dei tempi di esposizione alla luce (ON / OFF takes molto meno di 1 msec). L'esposizione può essere attivato solo durante la cattura delle immagini, da uscita digitale dalla fotocamera (ad es morsetto "Fire" a porte chiuse Andor). Ulteriori vantaggi di utilizzare il LED seguenti: la capacità di controllare l'intensità della luce senza utilizzare filtri di densità neutri, stabilità a lungo termine dell'intensità luminosa, e l'assenza di vibrazioni meccaniche che interferirebbe con il trattamento preciso di pipette di vetro come nella registrazione patch-clamp .

In generale, strutturalmente diversi coloranti fotosbiancante a ritmi diversi nelle stesse condizioni di imaging. Sarebbe quindi ideale per valutare l'entità del photobleaching del fluoroforo utilizzato in un particolare esperimento. Per i coloranti FM in terminazioni nervose vivi, è tecnicamente impegnativo per valutare il tasso photobleaching indipendente dall'attività sinaptica, a causa di attività sinaptica spontanea o in miniatura. Una diminuzione di intensità di fluorescenza durante tale activity potrebbe essere dovuta alla perdita biologica di coloranti FM (esocitosi), photobleaching di coloranti FM, o entrambi. Fortunatamente, le strutture dei coloranti FM fissabili sono progettati per essere quasi identiche a quelle dei coloranti FM nonfixable. Nel protocollo qui descritto, coloranti FM fissabili stati caricati in vescicole sinaptiche con gli stessi metodi come coloranti FM nonfixable, mentre l'attività sinaptica è stata bloccata dopo da fissazione chimica del campione. In particolare, il tasso di photobleaching misurata usando questo sistema era partire da 2-3% di 2 min quando le condizioni di imaging erano le stesse di quelle per l'imaging live-cella ^19.

Coloranti FM possono essere utilizzati con diversi protocolli di esplorare diversi aspetti del riciclo delle vescicole sinaptiche. Diverse attività sinaptica durante la colorazione e decolorazione possono essere combinati in vari modi, a seconda degli scopi sperimentali e caratteristiche specifiche di riciclo delle vescicole sinaptiche da valutare. La selezione di Antagonnalisti dipende anche dallo scopo degli esperimenti. Inoltre, l'imaging FM può essere effettuata durante la fase di colorazione e durante la fase di decolorazione ^9,18,42. Va inoltre tenuto presente, tuttavia, che i coloranti FM possono avere effetti inaspettati, come ad esempio bloccando i recettori muscarinici ^43, e permea i canali mechanotransducer ^44,-store operati Ca ^{2 +} canali ⁴⁵ e ⁴⁶ ATP recettori. Elevate concentrazioni di coloranti FM possono potenzialmente modificare l'efficienza della vescicola sinaptica esocitosi sé ^47. Pertanto si consiglia cautela nel progettare gli esperimenti e interpretare i risultati in materia di riciclo delle vescicole sinaptiche. Metodi complementari da considerare comprendono l'assorbimento in vescicole sinaptiche di anticorpi cui epitopi sono domini intra-lumenal delle proteine ​​delle vescicole ^22,48. Esse comprendono anche esprimono GFP sensibile al pH varianti mirato al lume delle vescicole ^49-51, e l'assorbimentodi pH-sensibile coniugati di anticorpi ^52-54 entrambi i quali rilevano le variazioni di pH intra-vescicolari che accompagnano eso-endocitosi.

Una volta che sono esclusi tali effetti indesiderati, coloranti FM hanno applicazioni larghe. Ad esempio, possono essere usati per affrontare se stessi piscine vescicole sinaptiche sono condivisi per spontanea e evocati vescicola rilascia ^17,55, che misura l'efficienza del riciclo delle vescicole sinaptiche possono essere regolati ^56,57, e quali effetti ha uno stato precedente (riposo o stimolato) esercitare sullo stato successiva di riciclo delle vescicole sulla base, ad esempio spontanea e attività sinaptica miniatura. Coloranti FM possono anche essere utilizzati per valutare riciclo delle vescicole sinaptiche a livello ultrastrutturale, correlando le osservazioni di microscopia ottica ed elettronica con il metodo fotoconversione FM ^30,58-62. Colorante FM può essere utilizzato per monitorare simultaneamente funzioni sinaptiche e ^{Ca2 +} intracellulare concentrazione ^5. Inoltre l'etichettatura di vescicole sinaptiche, i coloranti FM e altri marcatori in fase fluida fluorescenti come destrano fluorescente ⁷ può essere utilizzato per monitorare l'endocitosi massa che è attivato da una intensa attività neuronale. In conclusione, le applicazioni di coloranti FM forniscono una preziosa fonte di informazioni riguardanti riciclo delle vescicole sinaptiche e funzioni sinaptiche aggiuntive.

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Gli autori ringraziano i membri del laboratorio Harata per utili discussioni durante l'esecuzione di questo lavoro. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dal American Heart Association, la distonia Fondazione di ricerca medica, l'Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, la National Science Foundation e la Fondazione Whitehall a NCH