Method Article
Descriviamo l'uso di coloranti stirilico FM per l'immagine riciclo delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi funzionali. Questo protocollo può essere applicato non solo evocata, ma anche spontanea e attività sinaptiche in miniatura. Il protocollo espande la varietà di eventi sinaptici che possono essere adeguatamente valutati.
Vescicole sinaptiche nelle terminazioni nervose funzionali subiscono esocitosi e endocitosi. Questo riciclo delle vescicole sinaptiche può essere efficacemente analizzata utilizzando coloranti stirilico FM, che rivelano fatturato membrana. Protocolli convenzionali per l'uso di coloranti FM sono stati progettati per analizzare neuroni seguente stimolata (evocati) attività sinaptica. Recentemente, protocolli sono resi disponibili per analizzare i segnali FM che accompagnano attività sinaptica deboli, come eventi sinaptici spontanei o miniatura. L'analisi di queste piccole variazioni di segnali FM richiede che il sistema di imaging è sufficientemente sensibile per rivelare piccole variazioni di intensità, ma che i cambiamenti artefatti di grande ampiezza vengono soppressi. Qui si descrive un protocollo che può essere applicato a evocata, spontanea, e attività sinaptiche in miniatura, e utilizzando colture di neuroni ippocampali come esempio. Questo protocollo incorpora anche un mezzo per determinare il tasso d'photobleaching di coloranti FM, in quanto questo è un significativofonte di artefatti quando di imaging piccole variazioni di intensità.
La funzionalità di vescicole sinaptiche è un importante determinante della trasmissione sinaptica. Tali vescicole rilasciano neurotrasmettitori quando si fondono con la membrana plasmatica presinaptica (esocitosi), e sono pronte per un altro ciclo di stampa dopo essere rigenerata dalla membrana plasmatica (endocitosi) e ricaricato con neurotrasmettitore. La ricerca sulla dinamica dei meccanismi sottostanti e riciclo delle vescicole sinaptiche è stata notevolmente accelerato dall'introduzione di coloranti styryl FM 1. Queste molecole anfipatiche, che hanno carica positiva gruppi di testa idrofile e code idrofobiche (più coloranti in figura 1A, stereoview di FM1-43 in Figura 1B), possono reversibilmente entrare e uscire membrane lipidiche senza permea. Gruppi di coloranti FM condividono caratteristiche simili che influenzano la gamma di luce che essi emettono. Ad esempio, FM2-10, FM1-43, e FM1-84 hanno un doppio legame tra due composti ciclici e show emissione verde. La differenza tra loro è la lunghezza della coda idrofoba, che determina la sua idrofobicità e quindi il tasso di uscita dalla membrana (departitioning). Nei casi di FM5-95 e FM4-64, tre doppi legami collegano i composti ciclici, e mostrano emissione rossa. Questi coloranti differiscono rispetto alle loro parti idrofile. In tutti i coloranti FM, l'intensità di fluorescenza aumenta quando inseriti nelle membrane biologiche, a causa di un aumento della resa quantica nell'ambiente idrofobo rispetto all'ambiente idrofilo. Così i cambiamenti di intensità FM rappresentano le variazioni del fatturato membrana. I diversi colori (spettri di emissione) e idrofobicità rendono la FM tinge uno strumento di ricerca versatile nel riciclo delle vescicole sinaptiche.
Sulla base di queste caratteristiche, i coloranti FM sono principalmente utilizzati secondo il seguente schema nell'analisi riciclo delle vescicole sinaptiche (Figura 2). Neurons sono immersi in una soluzione extracellulare contenente il colorante FM, permettendogli di essere ripreso in vescicole sinaptiche (SVs), in quanto costituiscono via endocitosi (colorazione). Il colorante viene poi lavata applicando una soluzione extracellulare priva di coloranti; questo rivela terminazioni nervose funzionali, cioè solo quelli sottoposti attivamente endocitosi conterrà un cluster di vescicole sinaptiche che vengono caricati con il colorante (Figura 2 in basso). Esocitosi successiva porta alla perdita del colorante FM allo spazio extracellulare e una perdita concomitante di fluorescenza (decolorante, dovuto sia alla departitioning ad un ambiente idrofilo e diffusione lontano dal sito di esocitosi). Pertanto le variazioni di intensità di fluorescenza FM sono indicatori di vescicole sinaptiche eso-ed endocitosi.
Coloranti FM sono stati utilizzati per macchiare e Destain le vescicole sinaptiche in vari organismi e preparati 2,3. Gli esempi includono neur mammifericulture onal 4-9, mammiferi fettine di cervello 10,11, giunzioni neuromuscolari 12,13, retina neuroni bipolari 14,15 e le cellule ciliate della coclea 16.
Tipicamente in tali esperimenti, sia di colorazione e decolorazione sono innescati da ampiamente stimolando i neuroni (attività evocata). Recentemente, tuttavia, riciclo delle vescicole sinaptiche in risposta alla stimolazione debole è stato anche analizzato, come ha riciclo in assenza di uno stimolo esterno (attività sinaptica spontanea e miniatura) 9,17-19. Attività sinaptiche spontanee e miniaturizzati sono definiti come quelle che si verificano in assenza di stimoli esterni, le prime riguardano la scarica spontanea dei potenziali d'azione (Figura 3). Queste attività sinaptiche deboli sono associati a piccoli cambiamenti nei segnali FM rispetto a quelli attivati dalla stimolazione ampio. La misurazione richiede che le variazioni fl FMIntensità mento riflette accuratamente synaptic esocitosi delle vescicole o endocitosi ma le modifiche non artefatti di intensità. Una causa del manufatto è la presenza di marcatura non specifica della membrana plasmatica da coloranti FM. Washout graduale di questo componente comporti un cambiamento graduale nell'intensità di fluorescenza misurata, che sarà erroneamente attribuita ad attività sinaptica. Questo fattore può essere ridotto con metodi appropriati (vedi Protocol). La causa più notevole del manufatto è il photobleaching di colorante FM trattenuto all'interno vescicole sinaptiche. I cambiamenti Fotodecolorazione relativi a intensità FM devono essere piccoli in confronto ai biologiche (Synaptic) le modifiche che vengono misurati. Il recente sviluppo di telecamere sensibili, per esempio la fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica-elettroni moltiplicando (EMCCD), permette di minimizzare photobleaching accorciando il tempo di esposizione e indebolendo l'intensità della luce usata per eccitare il fluoroforo. Un'altra causa del manufatto è a i driftn il livello di messa a fuoco del microscopio ottico. La deriva fuoco durante una sessione di imaging può essere causato da effetti meccanici o termici, e verrà erroneamente portare ad un cambiamento nell'intensità di fluorescenza misurata.
Qui si descrive protocolli e apparecchiature che consentono di utilizzare coloranti FM analizzare riciclo delle vescicole sinaptiche anche nell'ambito di stimolazione debole o non, in particolare, l'attività sinaptica miniatura. Mostriamo esempi di colorazione e decolorazione delle vescicole sinaptiche durante gli eventi evocati e spontanei, utilizzando colture di neuroni dell'ippocampo roditori, e di imaging la fase di decolorazione. Dimostriamo anche il modo di valutare il grado di FM colorante photobleaching, in assenza di eventuali perdite colorante FM a causa di attività sinaptica.
1. Cultura primarie di neuroni dal cervello dei mammiferi
Tutte le procedure sugli animali eseguiti in questo studio sono approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali e uso della University of Iowa.
2. Caricare il Synaptic vescicole con il Dye FM (colorazione)
3. Lavare il Dye FM
4. Ricerca di un campo immagine ottimale durante il lavaggio
5. Scarico FM Dye dal Synaptic vescicole (decolorante)
6. Valutare la Photobleaching Tasso di FM Coloranti
7. Image Analysis
Soluzioni
Come esempio, mostriamo risultati rappresentativi per il decorso decolorante di vescicole sinaptiche (Figura 4). Neuroni dell'ippocampo in coltura sono state colorate con FM4-64 utilizzando l'attività sinaptica spontanea (fase 2.3) e lavato con una soluzione priva di colorante (soluzione di risciacquo 2). La rappresentazione mostra l'andamento iniziale tempo decolorante utilizzando attività spontanea (passo 5.3) (parte iniziale della linea continua, Figura 4A). Segue il decorso decolorante utilizzando tre turni di attività evocata con campo 10 Hz stimolazione per 120 sec ogni (passo 5.1). Un modo per misurare la quantità di decolorante evocata è illustrata con una freccia a doppia punta (ΔFM evocati) che corrisponde alla dimensione del pool totale riciclo di vescicole.
Prima è stato dato il primo stimolo, c'è stata una graduale riduzione dell'intensità FM (ingrandito nella Figura 4B). Tale diminuzione è composto di decolorazionea causa di attività sinaptica spontanea (ΔFM Spont) e photobleaching (ΔFM PB). Quando il contributo di photobleaching è piccolo, il cambiamento dal basale preimaging (ΔFM Spont + ΔFM PB) può essere utilizzato come approssimazione alla quantità decolorante di attività spontanea.
Figura 1. Strutture di coloranti FM. A. FM coloranti condivide alcune caratteristiche strutturali comuni. I gruppi idrofili rimangono in soluzione acquosa e le code idrofobiche permettono i coloranti FM da partizionare in membrana. FM2-10, FM1-43 e FM1-84 mostra emissioni verde, mentre FM5-95 e FM4-64 mostra emissioni spostata verso il rosso. B. Stereoview di FM1-43, il colorante FM più comunemente usato. Gruppo idrofilo è rivolto verso l'alto e code idrofobiche sono rivolto verso il basso. Nitratomi Ogen sono di colore blu. Per un'altra vista della FM1-43, vedere Schote e Seelig 63.
Figura 2. Schema di base di utilizzo colorante FM. Dopo l'applicazione di neuroni, il colorante FM inserita nella membrana plasmatica diventa fluorescente (verde), mentre quella della soluzione acquosa è molto meno fluorescente (grigio). Viene caricata una vescicole sinaptiche (SV) (macchiata) dal colorante FM, quando subisce endocitosi, esocitosi tipicamente seguente. Lavando il colorante FM in soluzione extracellulare consente solo le vescicole macchiate di essere fluorescente. Successivamente, una vescicola sinaptica viene scaricato (decolorato) quando subisce esocitosi e quindi rilascia il colorante FM. L'immagine seguente mostra una colorazione esemplare di neuroni dell'ippocampo in coltura con FM1-43 (una sovrapposizione di immagini a contrasto di fase e fluorescenza). E 'da notare che, nel protocollo descritto in questo documento, i puncta fluorescenti rappresentano terminali presinaptici nervose (diametro ~ 1 micron nei neuroni tipici centrali) con grappoli di vescicole sinaptiche macchiati, non i singoli vescicole sinaptiche (diametro ~ 40 nm). Per semplicità, questo sistema rappresenta una idea generale di eso-endocitosi delle vescicole sinaptiche. Può includere molteplici forme di eso-endocitosi, come ad esempio la fusione completa crollo seguito da clatrina-mediata endocitosi, il transitorio-and-run bacio eso-endocitosi, e l'endocitosi di massa 64. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Tre tipi di attività sinaptiche studiate da imaging FM. Attività sinaptica evocata in genere richiede, stimoli elettrici esterni. Attività sinaptica spontanea avviene in assenza di stimoli elettrici. Attività sinaptica Miniature avviene spontaneamente senza stimoli elettrici e senza potenziali d'azione: di solito il potenziale d'azione generazione è soppresso da un blocco di voltaggio-dipendenti Na + canale, tetrodotossina. Altre attività includono l'attività evocata quando exocytosis è stimolata dalla soluzione high-K + (depolarizzazione continuo), ionomicina (continuo aumento citoplasmatica di Ca 2 + concentrazione), e la soluzione ipertonica contenente saccarosio (suscitando esocitosi di vescicole in piscina facilmente rilasciabile), tutti che non richiede potenziale d'azione di tiro per vescicole sinaptiche sottoporsi esocitosi. Si noti che, in alcuni studi, l'attività spontanea è ampiamente definito per includere attività miniatura pure.
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Figura 4. Risultato rappresentativa di decolorante. A. colture di neuroni ippocampali sono state colorate per attività spontanea con 2,5 mM FM4-64 per 10 min a 37 ° C (punto 2.3), e lavate (protocollo 3). I neuroni sono stati ripresi durante la decolorazione con l'attività spontanea (punto 5.3), e tre turni di attività evocate (passo 5,1) (curva continua, in media di n = 25 terminali nervosi). Le barre verticali rappresentano SEM. Asse Y rappresenta l'intensità FM assoluto e "0" rappresenta l'intensità quando un otturatore è chiuso. La quantità totale di decolorante evocato viene indicata (ΔFM Evocati). B. Una ampliato vista della fase iniziale del decolorante in pannello A (curva continua, SEM bar omesse per chiarezza). Nel corso di una osservazione di 60 secondi, detentrice è dovuto principalmente atto spontaneoivity (ΔFM Spont), ma è in parte dovuto alla photobleaching (ΔFM PB). La durata photobleaching di FM4-64 (curva tratteggiata spessa) è stato determinato in un esperimento separato per l'imaging risolvibile FM4-64 (Protocollo 6). La tariffa era 2-3% di 2 min (una singola funzione esponenziale con una costante di tempo di 5.736 secondi, determinato dalla adattano 9 min curva) 19. La curva fotoscolorimento stato disegnato come una funzione esponenziale con un valore iniziale di quella dell'intensità misurata di FM4-64. Vedere la Figura S5 supplementari in Kakazu et al. 19 per la photobleaching per il periodo più lungo (9 min), e con l'intensità di eccitazione variabile e tempo di esposizione. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Abbiamo descritto protocolli per la colorazione e decolorazione vescicole sinaptiche in risposta evocata, attività sinaptica spontanea e miniatura, e per l'imaging durante la fase di decolorazione. Oltre ai protocolli esistenti, abbiamo incluso un nuovo protocollo di osservare il decolorante FM basato su attività sinaptica miniatura. L'utilizzo di questi protocolli, abbiamo precedentemente identificato anomalie nei neuroni in coltura da un modello murino della malattia movimento distonia. In confronto alle loro controparti in topi wild-type, quei neuroni stati sottoposti accelerati sinaptica esocitosi delle vescicole in 2 modo +-dipendente Ca quando sono stimolati da elevata attività 20. Tali neuroni hanno anche mostrato più frequente attività sinaptica in miniatura, come confermato dalla patch-clamp registrazioni elettrofisiologiche di neurotrasmettitore rilascio 19.
L'aspetto critico del protocollo per usare coloranti FM in tali analisi è quello di Assess e minimizzare photobleaching. Sottili cambiamenti di intensità di fluorescenza FM possono essere valutati in modo attendibile se i cambiamenti causati dalla photobleaching sono piccoli in confronto a quelli innescati da attività sinaptica. Fotodecolorazione ridotta ha anche il potenziale per sopprimere o eliminare citotossicità. Fotoscolorimento può essere ridotto al minimo l'esposizione di fluorofori a luce di eccitazione, e ci sono almeno due componenti di apparecchiature per farlo in esperimenti live-imaging. Una componente importante è un rivelatore sensibile di fotoni, ad esempio una telecamera EMCCD. Ciò permette di minimizzare la durata e l'intensità dell'esposizione senza influire negativamente sulla rilevazione di emissione di fluorescenza. Un componente è associato il sistema sorgente luminosa che limita l'esposizione del campione a luce di eccitazione solo quando il rivelatore acquisisce immagini. Questo è facilmente ottenibile da una luce a LED 41, che consente un controllo efficace dei tempi di esposizione alla luce (ON / OFF takes molto meno di 1 msec). L'esposizione può essere attivato solo durante la cattura delle immagini, da uscita digitale dalla fotocamera (ad es morsetto "Fire" a porte chiuse Andor). Ulteriori vantaggi di utilizzare il LED seguenti: la capacità di controllare l'intensità della luce senza utilizzare filtri di densità neutri, stabilità a lungo termine dell'intensità luminosa, e l'assenza di vibrazioni meccaniche che interferirebbe con il trattamento preciso di pipette di vetro come nella registrazione patch-clamp .
In generale, strutturalmente diversi coloranti fotosbiancante a ritmi diversi nelle stesse condizioni di imaging. Sarebbe quindi ideale per valutare l'entità del photobleaching del fluoroforo utilizzato in un particolare esperimento. Per i coloranti FM in terminazioni nervose vivi, è tecnicamente impegnativo per valutare il tasso photobleaching indipendente dall'attività sinaptica, a causa di attività sinaptica spontanea o in miniatura. Una diminuzione di intensità di fluorescenza durante tale activity potrebbe essere dovuta alla perdita biologica di coloranti FM (esocitosi), photobleaching di coloranti FM, o entrambi. Fortunatamente, le strutture dei coloranti FM fissabili sono progettati per essere quasi identiche a quelle dei coloranti FM nonfixable. Nel protocollo qui descritto, coloranti FM fissabili stati caricati in vescicole sinaptiche con gli stessi metodi come coloranti FM nonfixable, mentre l'attività sinaptica è stata bloccata dopo da fissazione chimica del campione. In particolare, il tasso di photobleaching misurata usando questo sistema era partire da 2-3% di 2 min quando le condizioni di imaging erano le stesse di quelle per l'imaging live-cella 19.
Coloranti FM possono essere utilizzati con diversi protocolli di esplorare diversi aspetti del riciclo delle vescicole sinaptiche. Diverse attività sinaptica durante la colorazione e decolorazione possono essere combinati in vari modi, a seconda degli scopi sperimentali e caratteristiche specifiche di riciclo delle vescicole sinaptiche da valutare. La selezione di Antagonnalisti dipende anche dallo scopo degli esperimenti. Inoltre, l'imaging FM può essere effettuata durante la fase di colorazione e durante la fase di decolorazione 9,18,42. Va inoltre tenuto presente, tuttavia, che i coloranti FM possono avere effetti inaspettati, come ad esempio bloccando i recettori muscarinici 43, e permea i canali mechanotransducer 44,-store operati Ca 2 + canali 45 e 46 ATP recettori. Elevate concentrazioni di coloranti FM possono potenzialmente modificare l'efficienza della vescicola sinaptica esocitosi sé 47. Pertanto si consiglia cautela nel progettare gli esperimenti e interpretare i risultati in materia di riciclo delle vescicole sinaptiche. Metodi complementari da considerare comprendono l'assorbimento in vescicole sinaptiche di anticorpi cui epitopi sono domini intra-lumenal delle proteine delle vescicole 22,48. Esse comprendono anche esprimono GFP sensibile al pH varianti mirato al lume delle vescicole 49-51, e l'assorbimentodi pH-sensibile coniugati di anticorpi 52-54 entrambi i quali rilevano le variazioni di pH intra-vescicolari che accompagnano eso-endocitosi.
Una volta che sono esclusi tali effetti indesiderati, coloranti FM hanno applicazioni larghe. Ad esempio, possono essere usati per affrontare se stessi piscine vescicole sinaptiche sono condivisi per spontanea e evocati vescicola rilascia 17,55, che misura l'efficienza del riciclo delle vescicole sinaptiche possono essere regolati 56,57, e quali effetti ha uno stato precedente (riposo o stimolato) esercitare sullo stato successiva di riciclo delle vescicole sulla base, ad esempio spontanea e attività sinaptica miniatura. Coloranti FM possono anche essere utilizzati per valutare riciclo delle vescicole sinaptiche a livello ultrastrutturale, correlando le osservazioni di microscopia ottica ed elettronica con il metodo fotoconversione FM 30,58-62. Colorante FM può essere utilizzato per monitorare simultaneamente funzioni sinaptiche e Ca2 + intracellulare concentrazione 5. Inoltre l'etichettatura di vescicole sinaptiche, i coloranti FM e altri marcatori in fase fluida fluorescenti come destrano fluorescente 7 può essere utilizzato per monitorare l'endocitosi massa che è attivato da una intensa attività neuronale. In conclusione, le applicazioni di coloranti FM forniscono una preziosa fonte di informazioni riguardanti riciclo delle vescicole sinaptiche e funzioni sinaptiche aggiuntive.
Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Gli autori ringraziano i membri del laboratorio Harata per utili discussioni durante l'esecuzione di questo lavoro. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dal American Heart Association, la distonia Fondazione di ricerca medica, l'Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, la National Science Foundation e la Fondazione Whitehall a NCH
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Pulse generator | AMPI | Master-8 | |
Isolated stimulator | ![]() | DS3 | |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | This is used for assessing the cell morphology at low magnification. |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse TiE | This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift. |
Objective lens | Nikon | Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm). | |
Filter cube | Nikon | 77032509 | 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43 |
Filter cube | Nikon | 77032809 | 490/420 nm ex, 510 nm dclp, 650 nm LP em for FM4-64. |
EMCCD camera | Andor Technology | iXon EM+ DU-860 | This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence. |
Liquid recirculating chiller | Solid State Cooling Systems | Oasis 160 | This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise. |
LED | CoolLED-Custom Interconnect | 490 nm | This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation. |
Image acquisition software | Andor Technology | Solis | |
Imaging chamber | Warner Instruments | RC-21BRFS | |
Fast perfusion system | Warner Instruments | SF-77B | |
CNQX | Tocris Bioscience | 1045 | |
D,L-AP5 | Tocris Bioscience | 0106 | |
Tetrodotoxin | Tocris Bioscience | 1069 | Caution: toxic reagent. Handle with care. |
FM1-43 | Invitrogen | T35356 | |
Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX) | Invitrogen | F35355 | |
FM4-64 | Invitrogen | T13320 | |
Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX) | Invitrogen | F34653 | |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Hanks’ balanced salt | Sigma-Aldrich | H2387 | |
Minimum Essential Medium | Invitrogen | 51200-038 | This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging. |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Caution: toxic reagent. Handle with care. |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 |
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