Die Untersuchung der synaptischen Vesikel Recycling Verwenden des UKW-Farbstoffe Während evozierte, spontan, und Miniatur Synaptic Aktivitäten

Wir beschreiben die Verwendung von Styryl FM Farbstoffe Bild synaptischen Vesikel-Recycling in der funktionellen Nervenenden. Dieses Protokoll kann nicht nur beschworen, sondern auch spontan und Miniatur synaptischen Tätigkeiten angewendet werden. Das Protokoll erweitert die Vielzahl von synaptischen Ereignisse, die effektiv ausgewertet werden können.

Synaptische Vesikel in Nervenfunktionsterminals unterziehen Exozytose und Endozytose. Diese synaptischen Vesikel-Recycling kann mit FM Styryl-Farbstoffe, die Membran Umsatz offenbaren effektiv analysiert. Herkömmliche Protokolle für die Verwendung von FM-Farbstoffe wurden für die Analyse von Neuronen nach stimulierte (hervorgerufen) synaptische Aktivität entwickelt. Kürzlich Protokolle werden für die Analyse der FM-Signale, die schwächer synaptischen Aktivitäten, wie spontane oder Miniatur synaptischen Ereignisse begleiten verfügbar. Analyse dieser kleine Änderungen in FM-Signale erfordert, dass das Abbildungssystem ist empfindlich genug, um kleine Änderungen in der Intensität zu erfassen, doch ist ein Artefakt Änderungen mit großer Amplitude unterdrückt werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll, die angewendet werden, um hervorgerufen, spontan, und Miniatur-synaptischen Aktivitäten, und verwenden Sie kultivierten Hippocampus-Neuronen als Beispiel werden. Dieses Protokoll enthält auch ein Mittel zur Bewertung der Rate der Photobleichung des FM-Farbstoffe, da dies eine erheblicheQuelle von Artefakten bei der Abbildung von kleinen Änderungen in der Intensität.

Die Funktionalität der synaptischen Vesikeln ist eine wichtige Determinante der synaptischen Übertragung. Diese Vesikel Neurotransmitter freisetzen, wenn sie mit der präsynaptischen Plasmamembran (Exozytose) fusionieren, und sie werden, nachdem sie von der Plasmamembran (Endozytose) regeneriert und neu geladen mit Neurotransmitter bereit für einen weiteren Zyklus der Veröffentlichung. Erforschung der Mechanismen und Dynamik der synaptischen Vesikel Recycling Basiswert hat durch die Einführung von Styryl-Farbstoffe FM ¹ beschleunigt. Diese amphipathische Moleküle, die (in 1A, stereo von FM1-43 in Figur 1B mehrere Farbstoffe) positiv geladen sind hydrophile Kopfgruppen und hydrophoben Schwänze, reversibel ein-und aussteigen, ohne Lipidmembranen durchdringt sie. Gruppen FM Farbstoffe haben ähnliche Funktionen, die das Spektrum des Lichts, das sie aussenden beeinflussen. Zum Beispiel, FM2-10, FM1-43 und FM1-84 haben eine Doppelbindung zwischen zwei zyklischen Verbindungen und show grüne Emission. Der Unterschied zwischen ihnen ist die Länge der hydrophoben Schwanz, der seine Hydrophobie bestimmt und daher die Rate des Austritts aus der Membran (departitioning). In den Fällen des FM5-95 und FM4-64, drei Doppelbindungen verbinden die zyklische Verbindungen, und sie rote Emission zeigen. Diese Farbstoffe unterscheiden sich in ihrem hydrophilen Teile. In allen FM-Farbstoffe, die Fluoreszenzintensität erhöht, wenn sie in biologischen Membranen eingesetzt, aufgrund einer Erhöhung der Quantenausbeute in der hydrophoben Umgebung relativ zu dem hydrophilen Umgebung. So werden die Veränderungen in der FM-Intensität stellen die Veränderungen in der Membran Umsatz. Die verschiedenen Farben (Emissionsspektren) und Hydrophobien machen das FM färbt ein vielseitiges Forschungsinstrument in der synaptischen Vesikel-Recycling.

Basierend auf diesen Merkmalen werden die FM-Farbstoffe meist nach dem folgenden Schema bei der Analyse der synaptischen Vesikel-Recycling (Fig. 2) verwendet. Neurons sind in einer extrazellulären Lösung, die das FM Farbstoff getaucht, so dass es in die synaptischen Vesikel (SV) genommen werden, da sie über Endozytose (Färbung) zu bilden. Der Farbstoff wird dann durch Aufbringen einer farbstofffreien extrazellulären Lösung gewaschen, dies zeigt die funktionelle Nervenenden, dh nur die aktiv Endozytose wird eine Gruppe von synaptischen Vesikeln, die mit dem Farbstoff (Fig. 2 unten) beladen sind, enthalten. Anschließende Exozytose führt zum Verlust des FM-Farbstoff an den extrazellulären Raum und einem gleichzeitigen Verlust der Fluoreszenz (Entfärbung, sowohl wegen der departitioning zu einer hydrophilen Umgebung und Diffusion weg vom Ort der Exozytose). Daher sind die Veränderungen in der Fluoreszenzintensität FM sind Indikatoren für die synaptischen Vesikel Exo-und Endozytose.

FM-Farbstoffe werden verwendet, um zu färben und entfärben die synaptischen Vesikeln in verschiedenen Organismen und Zubereitungen ^2,3. Beispiele sind Säugetier neuronal Kulturen ^4-9, Säugetiergehirnscheiben ^{10,11, 12,13} neuromuskulären Verbindungen, Netzhaut bipolaren Neuronen ^14,15 und Haarzellen der Cochlea ^16.

Typischerweise in solchen Experimenten werden sowohl Färbung und Entfärbung von extensiv Stimulierung der Neuronen (evozierte Aktivität) ausgelöst. Kürzlich jedoch synaptischen Vesikel-Recycling in Reaktion auf schwache Stimulation wurde auch untersucht, ebenso wie das Recycling in Abwesenheit eines externen Stimulus (spontan und Miniatur synaptische Aktivität) ^9,17-19. Spontanen und Miniatur synaptischen Aktivitäten als diejenigen, die in der Abwesenheit von externen Stimuli auftreten definiert, wobei erstere mit der spontanen Zündung von Aktionspotentialen (Fig. 3). Diese schwachen synaptischen Aktivitäten werden mit kleineren Änderungen in der FM-Signale als die von umfangreichen Stimulation ausgelöst verbunden. Die Messung erfordert, daß die Veränderungen in der FM fluoreszierReferenzintensität genau widerspiegeln synaptischen Vesikel Endozytose oder Exozytose aber nicht artifactual Änderungen in der Intensität. Eine Ursache des Artefakts ist die Anwesenheit von nicht-spezifische Färbung der Plasmamembran durch FM-Farbstoffe. Schrittweise Auswaschung dieser Komponente wird zu einer allmählichen Veränderung der Fluoreszenzintensität gemessen, die fälschlicherweise synaptischen Aktivitäten zugeschrieben wird, zu führen. Dieser Faktor kann durch geeignete Methoden reduziert werden (siehe Protokoll). Die wichtigste Ursache des Artefakts ist das Bleichen von FM-Farbstoff in synaptischen Vesikeln erhalten. Die Photobleaching bedingte Veränderungen FM Intensität im Vergleich zu den biologischen (synaptischen) Änderungen, die gemessen werden klein sein. Die jüngste Entwicklung von empfindlichen Kameras, z. B. die Elektronenvervielfachungsladungsgekoppelte Vorrichtung (EM-CCD)-Kamera, ist es möglich, zu minimieren Bleichen durch Verkürzen Belichtungszeit und die Schwächung der Intensität des Lichts verwendet werden, um die Fluorophore anzuregen. Eine weitere Ursache des Artefakts ist eine Drift in die Fokussierung Niveau der Lichtmikroskop. Die Fokusdrift während eines Bildgebungssitzung kann durch mechanische oder thermische Effekte verursacht werden, und fälschlicherweise zu einer Änderung in der gemessenen Fluoreszenzintensität führen.

Hier beschreiben wir Protokolle und Geräte, die es möglich, UKW-Farbstoffe verwenden, um synaptische Vesikel-Recycling auch im Rahmen von schwachen oder gar keine Stimulation zu analysieren, insbesondere das Miniatur synaptische Aktivität zu machen. Wir zeigen Beispiele für die Färbung und Entfärbung von Vesikeln während evozierte und spontane synaptische Ereignisse, mit kultivierten Hippocampus-Neuronen Nagetier, und die Abbildung der Entfärbung Phase. Wir zeigen auch, wie der Grad der FM Farbstoff Bleichen zu bewerten, in Abwesenheit von jedem FM-Farbstoffverlust durch synaptische Aktivitäten.

1. Primärkultur von Nervenzellen aus dem Gehirn von Säugetieren

Alle in dieser Studie durchgeführten Tierversuche werden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der Universität von Iowa genehmigt.

1. Vorbereitung der dissoziierten Zellkulturen der CA1-CA3-Regionen des Hippocampus von Mäusen oder Ratten auf die postnatale 0-1 Tage ^19,20. Platte der Hippocampus-Zellen auf 12-mm-Deckgläser (Dicke Nummer 0) mit der Ratten-Gliazellen Feeder-Schicht, in 24-Well-Platten voreingestellt und in einer Dichte von 12.000 Zellen / Well.
2. Kultur die Neuronen im Hippocampus für mindestens 8 Tage für funktionelle Nervenenden zu entwickeln ^21. Wir verwenden Neuronen auf 11-14 Tagen in vitro, wenn einzelne Nervenenden sind relativ isoliert ohne viel Clustering. Neuronen können für Experimente bis zu etwa 21 bis 28 Tagen in vitro zB Willig et al. Nosyreva ²² und ²³ und Kavalali verwendet werden.
3. Fürfunktionelle Studien, bewerten Deckgläser (vor-Färbung) von Indikatoren für eine gesunde Neuronen mit Durchlichtmikroskopie (zB Phasenkontrast-Optik mit einer Vergrößerung von 10-20X). Die Indikatoren der Gesundheit gehören: eine einheitliche Gliazellen Schicht, eine klare Zell Rand um den Neuronen, erweitert Dendriten ohne Perlen Strukturen, einen Mangel an gruppierten Somata, und ein Mangel an gebündelt Neuriten.

2. Laden der synaptischen Vesikeln mit der FM-Färbung (Färbung)

1. Die Färbung durch synaptische Aktivität durch elektrische Feldstimulation hervorgerufen (betrifft die Aktionspotentiale)
   1. Bereiten Färbung Lösung ein, indem Sie den FM-Farbstoff zu einem HEPES-basierte farbstofffreien Lösung, zB Tyrode-Lösung (siehe SOLUTIONS für Details). Die Konzentration des FM Farbstoff 10 uM FM1-43 und 2,5 uM FM4-64. Typische Konzentrationsbereiche sind: 2-15 uM FM1-43 oder 2,5-20 uM FM4-64 ^3,6. Für Experimente erfordern Unterdrückung von wiederkehrendenglutamatergen synaptischen Aktivität und die Induktion der synaptischen Plastizität, weiter Antagonisten der ionotropen Glutamat-Rezeptoren hinzu: AMPA-Rezeptoren (zB 10 uM CNQX) und NMDA-Rezeptoren (zB 50 uM AP5).
   2. Übertragen eines Deckglases mit Zellen aus dem Kulturmedium zu der Bilderzeugungskammer, die mit Tyrode-Lösung Klar vorbefüllt. Wir verwenden eine Abbildungskammer mit den Stimulationselektroden an den Seitenwänden (Platindrähte von 6,3 mm, RC-21BRFS getrennt) befestigt. Diese Kammer ist als geschlossener Imaging-Kammer entwickelt, aber wir nutzen es als eine offene Kammer (dh ohne eine obere Deckglas), mit Badewanne Volumen von ~ 200 ul. Während der Übertragung nicht die kultivierten Zellen an der Luft aussetzen und nicht einklemmen der kultivierten Zellen mit der Pinzette (Pick up das Deckglas von dem Umfang und nicht in der Nähe der Mitte).
   3. Die Perfusion Imaging-Kammer mit Klar Tyrode-Lösung bei Raumtemperatur (23-25 ​​° C).
   4. Bewerben Färbung Lösung 1 durch ConStant Perfusion.
   5. Evoke synaptischen Aktivität durch Anlegen elektrischer Impulse. Für maximale Anfärbung des gesamten Recycling-Pool von synaptischen Vesikeln in Hippocampus-Neuronen stimulieren die Kulturen bei 10 Hz 60-120 ²⁴ sec. Beim Versuch, die maximale Effizienz der Feldstimulation zu erreichen, halten mehrere Funktionen im Sinn. 1) Die Höhe der Bad-Lösung sollte so niedrig wie möglich sein, während die Neuronen und Stimulationselektroden in einer dünnen Schicht von Tyrode-Lösung (in der Reihenfolge, die Nervenzellen am Leben zu erhalten und zu einem homogenen elektrischen Feld zu erhalten) ganz eingetaucht. 2) Stromstärke und Dauer sollte über ein Indikator der neuronalen Erregbarkeit, z. B. fluoreszierende Ca ^{2 +-Imaging} optimiert werden, in unserem Fall ein konstanter Strom von 30 mA Intensität und 1 ms Dauer gibt zuverlässige Ergebnisse. 3) Die Badlösung sollte bei konstanter Strömungs während der Stimulation anzuwenden, die elektrische Stimulation zu Elektrolyse, wodurch Protonen (H +) an der positiv geladenen Anode und der pH-Wert in der Nähe der Anode in einem statischen Bad rasch abnehmen ansammeln. Überprüfen Sie die Versauerung in einem separaten Experiment, indem mehr als ein paar hundert Impulse durch eine Lösung, die einen pH-Indikator (zB Hanks 'Salzlösung mit Phenol rot) enthält.
   6. Lassen Sie die Neuronen in Färbelösung 1 für eine weitere 60 Sekunden nach dem Feld-Stimulation beendet wird, so dass Post-Stimulus-Endozytose abgeschlossen sein wird ^25.
   7. Waschen Sie die Farblösung aus dem Bildraum durch Perfusion mit Spüllösung 1, Lösung eines farbstofffreien Tyrode und Antagonisten der AMPA-Rezeptoren und NMDA-Rezeptoren (siehe Abschnitt 2.1.1) und einem Blocker des spannungsabhängigen Na ^+-Kanäle ( zB 0,5-1 uM Tetrodotoxin, TTX). Die Kombination der Blocker den Verlust von FM-Farbstoff durch spontane synaptische Aktivität zu unterdrücken. Um die Wascheffizienz zu maximieren, erhöhen die Durchblutung Rate ( z. B. bis zu 5-6 ml / min) für 1-2 min, und fügen einen Bolus (z. B. 1 ml) der Spüllösung 1 direkt in die offene Kammer Abbildungs ​​manuell mit einer Pipette. Steuerung der Stärke und Richtung der manuellen Infusions, um nicht die kultivierten Nervenzellen stören.
2. Die Färbung durch synaptische Aktivität von High-K ^+-Lösung hervorgerufen (nicht um Aktionspotentiale).
   1. Bereiten Färbung Lösung 2 durch Hinzufügen der FM Farbstoff zu High-K ⁺ Tyrode-Lösung. Insbesondere bereiten eine modifizierte Tyrode-Lösung mit 45 mM KCl, durch äquimolare Substitution von KCl für NaCl. Falls erforderlich, fügen Antagonisten der AMPA und NMDA-Rezeptoren. Diese High-K ^+-Lösung wird kontinuierlich Neuronen depolarisieren, aktivieren Ca ^{2 +-Einstrom} in die Nervenenden und initiieren synaptischen Vesikel Exozytose zum Höchstausmaß ^26. Höhere Konzentrationen (70-90 mM) wurden auch in anderen Berichten zB Klingauf et al. Ein ²⁷ verwendetd Richards et al. ²⁸
   2. Übertragen einer Deckglas mit kultivierten Neuronen aus dem Kulturmedium auf den Imaging-Kammer mit Klar Tyrode-Lösung vorgefüllt.
   3. Stain die Neuronen bei Raumtemperatur für 1-2 min durch Anlegen Färbelösung 2 bei konstanter Perfusion oder mit einer Pipette ^26,28. Im letzteren Fall sollte die endgültige Farbstoffkonzentration durch Zugabe einer bestimmten Menge Färbelösung 2 zu einem bekannten Volumen von farbstofffreien Lösung gesteuert werden.
   4. Aus der Imaging-Kammer Waschen Sie die Farblösung, wie in Abschnitt 2.1.7 beschrieben.
3. Die Färbung durch spontane und Miniatur synaptischen Aktivität.
   1. Vorwärmen Bicarbonat-basierten Lösung (zB Minimum Essential Medium, MEM) bis 37 ° C, indem im Brutschrank für mehr als 60 min.
   2. Zur Färbung basierend auf spontane synaptische Aktivität, bereiten Färbelösung 3, indem Sie die FM Farbstoff MEM. Zur Färbung bezogen auf miniature synaptische Aktivität, bereiten Färbelösung 4 durch Zugabe von TTX auf die Farblösung 3.
   3. Flecken Neuronen durch Übertragen eines Deckglases mit kultivierten Neuronen aus dem Kulturmedium, um Lösung 3 oder 4 Färben und so dass sie in der gleichen Färbelösung bei 37 ° C für 10 min.
   4. Spülen Sie das Deckglas kurz in Spüllösung ein.
   5. Übertragen Sie das Deckglas zu Spüllösung 1 in einem bildgebenden Kammer. Beachten Sie die folgenden. 1) Die Zellen sollten nicht der Luft ausgesetzt werden, wenn nötig, übertragen Sie die Deckglas direkt mit dem Bildraum ohne Spülung. 2) Die Neuronen können bei Raumtemperatur durch Ersetzen Färbelösung 3 oder 4 mit einem HEPES-basierte Lösung gefärbt werden. 3) Neuronen für evozierte synaptische Aktivität im Zusammenhang mit hohen K ^+-Lösung unter Verwendung dieses Verfahrens gefärbt werden, indem Färbelösung 3 oder 4 mit Färbelösung 2 und der Durchführung der restlichen Schritte bei Raumtemperatur.
   6. Waschen Sie die Farblösung aus der bildgebendenKammer, wie in Abschnitt 2.1.7 beschrieben.

3. Waschen Sie sich die FM-Dye

1. Nach neuronale Färbung und anfängliche Waschen mit einem der vorstehend beschriebenen Verfahren (Abschnitt 2.1.7), weiterhin die Abbildungskammer mit Spüllösung 1 für 5-10 min bei Raumtemperatur perfundiert. Dadurch wird das FM-Farbstoff aus der Plasmamembran und die extrazelluläre Lösung zu entfernen. Im Falle unseres Abbildungskammer ist das Bad Perfusionsrate 600-1.200 &mgr; l / min. Waschen kann auch in Abwesenheit von extrazellulärem Ca ^{2 +} auf FM Farbstoffverlust durch synaptische Aktivitäten ¹⁷ drücken geführt werden. Die Waschungen können durch eine kurze Anwendung Advasep-7, einem modifizierten Cyclodextrin, das als Abfangmittel für FM Farbstoffe aus der Plasmamembran ^29-31 dient verbessert werden. Es ist wichtig, jede Advasep-7 kurzen Exposition (zB 5 sec im Fall von Monolayer-Kultur) zu halten, um zu vermeiden, sowohl die Verringerung der Intensität der FM puncta ³¹ und dabei die heaLTH der Zellen. Die Fluoreszenz von FM1-43 in der Plasmamembran kann auch durch Anwendung einer Quencher Sulforhodamin 101 (50-100 &mgr; M), die nicht eintritt synaptischen Vesikeln ³² unterdrückt werden.

4. Auf der Suche nach einem optimalen Bildfeld beim Waschen

1. Stellen Sie sicher, dass die Zellen im Bereich abgebildet werden sollen gesund, Durchlicht-Mikroskopie mit hoher Vergrößerung und hoher numerischer Apertur-Objektiv (zB 40-fach). Von diesem Abschnitt werden wir weiterhin eine inverse Mikroskop (Eclipse Ti, Nikon) mit Phasenkontrast-oder Differentialinterferenzkontrast-Optik ausgestattet zu verwenden. Dieses Mikroskop ist auch mit Perfect Focus System (PFS), die eine kontinuierliche, Echtzeit-Fokuskorrektur, die das Mikroskop überwindet Fokusdrift ermöglicht. Diese Funktion ist für Zeitraffer-Bildgebung während Entfärben mit der gleichen Fokusebene unerlässlich.
2. Stellen Sie sicher, dass die Färbung war effektiv, durch Verwendung von Fluoreszenz-Optik. Avoid Aggregate von FM puncta sei denn, sie sind das Ziel der Forschung, weil einzelne Boutons wird schwer zu erkennen sein. Achten Sie auf die Formen der FM puncta: wenn die meisten der gefärbten Boutons erscheint als Zeichenfolgen von kreisförmigen Perlen, konnten sie ungesund Nervenenden zu vertreten. Minimieren Sie die Belichtung der Neuronen, starke Fluoreszenzanregung, um Ausbleichen zu vermeiden.

5. Entladen FM Dye von der synaptischen Vesikeln (Entfärben)

1. Entfärben durch synaptische Aktivität durch elektrische Feldstimulation hervorgerufen.
   1. Wasch TTX durch Perfusion der Neuronen ausgiebig mit einer Spüllösung 2 (wie Spüllösung 1, jedoch ohne TTX). Bestätigen die Wirksamkeit von TTX Auswaschen in getrennten Versuchen unter Verwendung der gleichen Waschparameter (Perfusion Geschwindigkeit und Dauer), zB durch Fluoreszenz-Ca ^{2 +-Imaging} von cytoplasmatischen Ca ^{2 +-Transienten,} die durch Feldstimulation induziert wird, oder durch Patch-Clamp-Aufzeichnung Voltaltersabhängiger Na ^+-Ströme.
   2. Starten Sie die Abbildung der FM-Farbstoffe. Zum Abbilden FM1-43 oder FM4-64, 520 nm verwenden oder 650 nm Langpassemissionsfilter bzw. und 490 nm Anregungsfilter. Erwerben Sie Bilder alle 1-2 sec, mit einer kurzen Belichtungszeit (zB 10-20 msec), schwache Anregungsintensität (z. B. 5-10% der LED-Leistung) und hohe Empfindlichkeit (z. B. mit EM-Verstärkung). Minimieren Photobleaching der FM Farbstoffe durch Reduzierung Belichtungszeit und die Intensität der Fluoreszenzanregung. Minimieren Sie das Mikroskop Fokusdrift durch Einschalten der Perfect Focus System.
   3. Stimulieren die Nervenzellen im Spüllösung 2, mit Feld-Stimulation (zB bei 10 Hz für 120 sec) ^20.
   4. Wenden Sie mehrere Runden der Stimulation, mit dazwischenliegenden Ruhezeiten von 1-2 min, um alle Recycling synaptischer Vesikel von FM-Farbstoff führen. Dies ist wichtig bei der Beurteilung der Größe der gesamten Recycling-Pool von synaptischen Vesikeln, die mit FM-Farbstoffen gefärbt wurden in thE vorherigen Zustand ^20,33.
2. Entfärben durch synaptische Aktivitäten hervorgerufen in der Abwesenheit von Aktionspotentialen.
   1. Starten Sie die Abbildung der FM-Farbstoff.
   2. Übernehmen Sie die anregende Reagenzien in Spüllösung 1 oder 2 gelöst. Solche Reagenzien umfassen: KCl (high-K ^+-Lösung, z. B. 45 mM) ^26, Ionomycin (Ca ^{2 +-Ionophor,} das die intrazelluläre Ca ^{2 +-Konzentration} erhöht, indem Ca ^{2 +-Einstrom} in die Zelle aus der extrazellulären Lösung, verwendet z. B. bei 5 uM) ^20,34 und Saccharose (ein hypertonischen Lösung, die die Freisetzung synaptischer Vesikel aus leicht lösbare Pool, verwendet zB bei 500 mM) ^35,36 anregt. Verwenden Sie eine schnelle, lokale Durchblutungssystem für eine zuverlässige zeitliche Kontrolle der Anwendung der Reagenzien, zB die SF-77B-System von der Warner Instruments ³⁷ oder Y-Rohrsystem ^38-40.
3. Entfärben durch spontane und miniature synaptischen Aktivität.
   1. Zum Entfärben durch spontane synaptische Aktivität, waschen TTX wie oben (Abschnitt 5.1.1), mit 2 Spüllösung. Starten Sie die Abbildung der FM Farbstoffe während Perfusion Neuronen mit Spüllösung 2. Zum Entfärben durch Miniatur-synaptischen Aktivitäten, starten Sie die Abbildung der FM Farbstoffe, während sie weiterhin die Neuronen mit Spüllösung 1 (mit TTX) durchströmen.
   2. Nach basierend auf entweder spontan oder Miniatur-Aktivität Entfärben, identifizieren die funktionalen Nervenenden durch Entfärbung über evozierte synaptische Aktivität. Aktivität kann durch ein beliebiges der oben beschriebenen Verfahren hervorgerufen werden. Dieser Identifizierungsprozess ist notwendig, weil die gefärbten Strukturen können diejenigen, die nicht der funktionalen Nervenenden (z. B. langsam Recycling Endosomen oder Astrozyten Vesikel) und einer großen Menge von Entfärben durch die evozierten Aktivität Hilfen in diesem Prozess sein.

6. Die Beurteilung der Photobleaching Währungs FM Farbstoffe

1. Färben die Nervenenden mit Aldehyd-fixierbar FM Farbstoff (z. B. FM1-43FX, FM4-64FX). Dies kann durch Ersetzen FM Farbstoff mit einem fixierbaren FM Farbstoff geführt unter Verwendung der oben beschriebenen hervorgerufen, spontan, oder Miniatur-Färbung, und.
2. Auswaschen fixierbar FM Farbstoff, wie in Abschnitt 2.1.7 beschrieben.
3. Chemisch fixieren die Neuronen durch die Übertragung des Deckglases an Fixierungslösung: 4% Paraformaldehyd und 4% Saccharose in Tyrode-Lösung für 30 min bei 4 ° C. Die Fluoreszenzintensität des fixierbaren FM Farbstoff nach der chemischen Fixierung beibehalten.
4. Auswaschen Fixiermittel für 10 min in Tyrode-Lösung, durch die Übertragung der Deckglas auf frische Tyrode-Lösung zweimal.
5. Übertragen Sie das Deckglas in frische Tyrode-Lösung in der bildgebenden Kammer.
6. Starten Abbilden des fixierbaren FM Farbstoff mit dem gleichen Satz von Abbildungsparametern für lebende Neuronen. Es ist wichtig, die Abbildungskammer nach der Verwendung keine chemisch fixierte Probe sehr gut spülen, weilverbleibende Fixiermittel können nachfolgende Live-Cell-Imaging-Experimenten, die in der gleichen Kammer durchgeführt beeinflussen. Alternativ zu der feststehenden Abbildungszelle, können die gefärbten lebenden Zellen für die Beurteilung der Photobleisatz abgebildet werden. Jedoch ist es wert, wenn man bedenkt, dass es schwierig ist, die Miniatur synaptische Aktivität akut zu blockieren, zum Beispiel kann die Frequenz des Miniatur-Aktivität auf ca. 50% durch Entfernen des extrazellulären Ca ^{2 + 23} reduziert werden, aber es ist keine vollständige Blockade.
7. Am Ende jeder Bildgebungssitzung, einen Erwerb für die Beurteilung der Absolutwert der Fluoreszenzintensität FM Hintergrund. Die Intensität der FM puncta stellt nicht nur die wahre Signal von den FM-Farbstoffe in den Nervenenden, sondern auch das Hintergrundrauschen von 1) Gliazellen, die die neuronalen Monolayer-Kultur, 2) das Deckglas und optische Komponenten (z. B. Objektiv, Filter und unterliegen Spiegel), und 3) der Detektor (EM-CCD-Kamera). Hintergrundgeräusche sind assein nonstained Regionen des abgebildeten Feld ssed. Wenn solche Bereiche im Raum oder in heterogenen Intensität beschränkt, ersetze sie ein Bild mit dem Kameraverschluß geschlossen und Rauschen von dem Detektor erhalten, obwohl es kein ideales Verfahren. Erwerben Sie etwa 10 Bilder mit den gleichen Abbildungsparameter.

7. Bildanalyse

1. Importieren der erfaßten Daten in die Bildanalyse-Software als ein Stapel von Zeitreihenbildern. Wir verwenden ImageJ (WS Rasband, NIH) und der zugehörigen Plug-Ins, wie zB Bildstabilisator-Plug-in (Kang Li) zur Korrektur ein kleines Maß an Bewegung unter FM puncta und Time Series Analyzer V2.0 (Balaji Jayaprakash) zur Analyse Zeitreihen.
2. Berechnen der Änderungen in FM Intensität am Anfang und am Ende der Reihe (ΔFM). Zu diesem Zweck ist der Mittelwert der Bilder vor dem Beginn der Entfärbung und nach dem Ende der Entfärbung (beispielsweise 5 Bildfelder jeweils), und erzeugt ein Differenzbild durch subtracting ihnen.
3. Identifizierung der potentiell funktionelle Nervenenden durch Anlegen einer Intensitätsschwelle, um das Differenzbild zu erfassen und Bildpunkte, deren Intensität höher ist als der Schwellenwert. Ein Verfahren zur Einstellung der Schwelle ist, die Standardabweichung der Hintergrundintensität von der bloßen Deckbereich erhalten zu wählen.
4. Identifizieren Sie die isolierten, funktionale Nervenenden wie die angrenzenden Pixel, die festgestellt wurden, und dass eine Größe Kriterium (minimale und maximale Anzahl der Pixel in Nachbarschaft) zu erfüllen. Dieser Prozess eliminiert Hintergrundgeräusche und aggregierte Nervenenden von der Analyse.
5. Weisen Regionen-of-Interest (ROI) der erfassten Pixelcluster (mit einzelnen Cluster entsprechend einzelnen Nervenenden). Die Gesamtänderung der Intensität während Entfärben (ΔFM) ist eine typische Parameter der Analyse. Dies stellt die kumulierte Betrag der evozierten, spontan oder Miniatur synaptischen Aktivität. Ausschließen ROIs, wenn sie eine der folgenden zeigenÄnderungen in der Intensität, je nach Zweck der Experimente: eine Zunahme während der Aufnahme, eine plötzliche Abnahme vor der Stimulation, oder eine lange Wartezeit nach der Stimulation.
6. Bewerten Sie die Geschwindigkeit der Photobleichung durch den Import der erfassten Zeitreihen-Daten in die Bildanalyse-Software. Der Mittelwert der Hintergrund-Bilder (z. B. mit einem geschlossenen Verschluß) und subtrahieren sie von den einzelnen Bildern. Weisen ROIs FM puncta, die mutmaßlich zu den Nervenenden entsprechen, und Veränderungen in der ROI messen Intensität über die Zeit.

Lösungen

1. Tyrode-Lösung
   • Zusammensetzung (in mM): 125 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl _{2, 2} MgCl _2, 30 Glucose, 25 HEPES, 310 mOsm, pH 7,4.
2. Färbelösung 1
   • Tyrode-Lösung plus die FM-Farbstoff.
   • Diese Lösung wird für die Färbung verwendet wird, basierend auf synaptische Aktivität hervorgerufen durch elektrische Stimulation.
   • Fügen Sie die Antagonisten der AMPA-Rezeptoren und NMDA receptors, wenn nötig.
3. Färbelösung 2
   • High-K ⁺ Tyrode-Lösung plus die FM-Farbstoff.
   • Diese modifizierte Tyrode-Lösung wird durch die Erhöhung der KCl-Konzentration auf 45 mM, durch äquimolare Substitution von NaCl KCl hergestellt.
   • Diese Lösung wird für die Färbung verwendet wird, basierend auf evozierten synaptischen Aktivität durch kontinuierliche Depolarisation.
   • Fügen Sie die Antagonisten der AMPA-Rezeptoren und NMDA-Rezeptoren, wenn nötig.
4. Färbelösung 3
   • MEM-Lösung sowie die FM-Farbstoff.
   • Diese Lösung wird für die Färbung verwendet wird, bezogen auf die spontane synaptische Aktivität.
5. Färbelösung 4
   • MEM-Lösung sowie die FM-Farbstoff und TTX.
   • Diese Lösung wird für die Färbung verwendet wird, basierend auf Miniatur synaptischen Aktivität.
6. Spüllösung 1
   • Tyrode-Lösung sowie die Antagonisten der AMPA-Rezeptoren und NMDA-Rezeptoren, und TTX.
7. Spüllösung 2
   • Tyrode-Lösung sowie die Antagonisten der AMPA-Rezeptoren und NMDA-Rezeptoren, aber ohne TTX.

Als Beispiel zeigen wir repräsentative Ergebnisse für die Entfärbung Zeitverlauf der synaptischen Vesikel (Abbildung 4). Hippokampalen Neuronen wurden mit FM4-64 angefärbt mit der spontanen synaptischen Aktivität (Schritt 2.3) und mit Farbstoff-freie Lösung (Spüllösung 2) gewaschen. Die Abbildungs ​​zeigt die Anfangs Entfärben Zeitverlauf mit Spontanaktivität (Schritt 5.3) (Anfangsteil der durchgehenden Linie, 4A). Dies wird durch die Entfärbung Zeitkurs mit drei Runden der evozierten Aktivität mit 10 Hz Feldstimulation für 120 Sekunden jede (Schritt 5.1) gefolgt. Eine Möglichkeit der Messung der Menge des evozierten Entfärben mit einem Doppelpfeil (ΔFM _evozierte), die auf die Größe der gesamten Recycling Pool von Vesikeln entspricht dargestellt.

Bevor der erste Stimulus gegeben wurde, gab es eine allmähliche Abnahme FM Intensität (in 4B vergrößert). Dieser Rückgang wurde von Entfärbung zusammendurch spontane synaptische Aktivität (ΔFM _Spont) und Photobleaching (ΔFM _PB). Wenn der Beitrag der Photobleichung gering ist, kann die Änderung von der Basislinie preimaging (ΔFM _Spont ΔFM + _PB) als eine Annäherung an die Entfärbung Betrag der spontanen Aktivität verwendet werden.

Fig. 1 ist. Strukturen von FM-Farbstoffe. A. FM färbt Aktien einige gemeinsame Strukturmerkmale. Die hydrophilen Gruppen bleiben in wässriger Lösung und die hydrophoben Schwänze, damit die FM Farbstoffe in Membran partitioniert werden. FM2-10, FM1 und FM1-43-84 zeigen grüne Emission, während FM5-95 und FM4-64-Show Rotverschiebung Emission. B. Stereo von FM1-43, die am häufigsten verwendeten FM-Farbstoff. Hydrophile Gruppe nach oben und hydrophoben Schwänze nach unten zeigen. Nitrogen Atome sind blau. Für einen anderen Blick auf FM1-43, siehe Schote und ⁶³ Seelig.

2. Grundschema der FM Farbstoffverbrauch. Nach Applikation auf Neuronen, wird das FM-Farbstoff in die Plasmamembran eingesetzt fluoreszierend (grün), während die in der wässrigen Lösung viel weniger fluoreszierend (grau). Eine synaptische Vesikel (SV) wird durch den FM-Farbstoff beladen (gebeizt) wird, wenn es eine Endocytose durchläuft, in der Regel folgende Exozytose. Waschen Sie sich die FM-Farbstoff in der extrazellulären Lösung ermöglicht nur die gefärbten fluoreszierenden Vesikel zu sein. Anschließend wird ein synaptischen Vesikel entladen (entfärbt), wenn er erfährt Exozytose und deshalb gibt das FM-Farbstoff. Ein Bild unten zeigt eine exemplarische Färbung der kultivierten Hippocampus-Neuronen mit FM1-43 (eine Überlagerung von Fluoreszenz-und Phasenkontrast-Bilder). Es ist bemerkenswert, dass in dem in diesem Dokument beschriebenen Protokoll, die fluoreszierenden puncta darstellen präsynaptischen Nervenenden (Durchmesser ~ 1 um in typischen zentralen Neuronen) mit Clustern von Bunt synaptischen Vesikeln, nicht die einzelnen synaptischen Vesikeln (Durchmesser ~ 40 nm). Der Einfachheit halber wird diese Regelung stellt eine allgemeine Vorstellung von exo-Endozytose synaptischer Vesikel. Es können mehrere Formen der exo-Endozytose, wie der Voll Zusammenbruch Fusion gefolgt von Clathrin-vermittelte Endozytose, der transienten kiss-and-Run-exo-Endozytose und der Groß Endozytose ⁶⁴ umfassen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen diese Zahl.

3. Drei Arten von synaptischen Tätigkeiten studierte von FM-Bildgebung. Evozierte synaptische Aktivität erfordert in der Regel externe, elektrische Reize. Spontane synaptische Aktivität tritt in Abwesenheit von elektrischen Reizen. Miniatur synaptische Aktivität erfolgt spontan, ohne elektrische Reize und ohne Aktionspotentiale: Regel die Aktionspotentialerzeugung durch einem Blocker des spannungsabhängigen Na ^+-Kanal, Tetrodotoxin drückt. Weitere Aktivitäten umfassen die evozierte Aktivität, wenn Exozytose wird durch High-K ^+-Lösung (Dauer Depolarisation) stimuliert, Ionomycin (kontinuierliche Steigerung der cytoplasmatischen Ca ^{2 +-Konzentration)} und hypertonischen Lösung Saccharose (Hervorrufen Exozytose von Vesikeln in der leicht lösbaren Pool) enthält, die alle erfordern Aktionspotential Brenn für synaptische Vesikel Exozytose erfahren. Man beachte, dass in einigen Studien wurde die spontane Aktivität wird allgemein definiert, um Miniatur-Aktivität umfassen auch.

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4. Repräsentatives Ergebnis Entfärben. A. hippokampalen Neuronen wurden durch spontane Aktivität mit 2,5 uM FM4-64 für 10 min bei 37 ° C (Schritt 2.3) gefärbt und gewaschen (Protokoll 3). Neuronen wurden während Entfärben mit Spontanaktivität (Schritt 5.3) abgebildet und drei Runden von evozierten Aktivitäten (Schritt 5.1) (durchgezogene Kurve, durchschnittlich n = 25 Nervenenden). Vertikale Balken repräsentieren SEM. Y-Achse die absolute Intensität FM und "0" stellt die Intensität, wenn ein Kameraverschluss geschlossen ist. Die Gesamtmenge der evozierten Entfärbung angezeigt (ΔFM _evozierte). B. eine erweiterte Ansicht Anfangsphase der Entfärbung in A (durchgezogene Kurve, SEM Stangen der Übersichtlichkeit halber weggelassen). Während einer 60 Sek. Beobachtung war die Festhalte vor allem aufgrund spontaner Aktduktivität (ΔFM _Spont), war aber teilweise durch Photobleaching (ΔFM _PB). Das Ausbleichen zeitlichen Verlauf der FM4-64 (dicke gestrichelte Kurve) wurde in einem separaten Experiment durch Abbilden fixierbar FM4-64 (Protokoll Nr. 6) bestimmt. Der Preis war 3.2% über 2 min (eine einzelne Exponentialfunktion mit einer Zeitkonstante von 5736 sec, durch Kurvenanpassung über 9 min bestimmt) ^19. Die Photobleichung Kurve wurde als eine Exponentialfunktion mit einem Anfangswert entspricht, die von der gemessenen Intensität des FM4-64 gezeichnet. Siehe zusätzliche Abbildung S5 Kakazu et al. Bleichen ¹⁹ für die über einen längeren Zeitraum (9 min) und mit variabler Anregungsintensität und Belichtungszeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Wir haben Protokolle für Färben und Entfärben synaptischen Vesikeln in Reaktion auf evozierte, spontan und Miniatur synaptische Aktivität und für die Bildgebung bei der Entfärbung Phase beschrieben. Zusätzlich zu den bestehenden Protokollen, haben wir ein neues Protokoll der Beobachtung der FM Entfärben basierend auf Miniatur synaptische Aktivität enthalten. Mit Hilfe dieser Protokolle, bisher haben wir Anomalien in kultivierten Neuronen aus einem Maus-Modell der Bewegungsstörung Dystonie identifiziert. Im Vergleich zu ihren Kollegen in Wildtyp-Mäusen, unterzog diese Neuronen beschleunigt synaptischen Vesikel Exozytose in einem Ca ^{2 +-abhängig,} wenn sie durch hohe Aktivität ²⁰ stimuliert. Diese Neuronen zeigten auch häufiger Miniatur synaptische Aktivität, wie von Patch-Clamp-elektrophysiologischen Ableitungen der ^{Neurotransmitter-19} bestätigt.

Der kritische Aspekt des Protokolls für die Verwendung FM Farbstoffe in solchen Analysen ist Assess und minimieren Photobleaching. Subtile Veränderungen in der FM-Fluoreszenzintensität kann zuverlässig beurteilt werden, wenn die Änderungen durch Bleichen verursacht wurden, sind klein im Vergleich zu den von der synaptischen Aktivität ausgelöst. Reduzierte Photobleaching hat auch das Potenzial, zu unterdrücken oder zu beseitigen Zytotoxizität. Photobleichung kann durch Minimieren der Exposition von Fluorophoren an Anregungslicht verringert werden, und es gibt zumindest zwei Komponenten der Ausrüstung im Live-Imaging Experimente. Ein wichtiger Bestandteil ist ein empfindlicher Detektor von Photonen, zB eine EM-CCD-Kamera. Dies macht es möglich, die Dauer und Intensität der Belichtung ohne die Detektion der Fluoreszenzemission zu beeinträchtigen minimieren. Eine zugehörige Komponente ist die Lichtquelle System, das die Exposition der Probe begrenzt Anregungslicht nur, wenn der Detektor nimmt Bilder. Dies ist leicht durch ein LED-Licht ^41, die für eine effiziente Steuerung der Zeit der Belichtung ermöglicht (ON / OFF t erreichtakes viel kleiner als 1 ms). Die Belichtung kann nur während der Bildaufnahme ausgelöst werden, durch die digitale Ausgabe von der Kamera (z. B. "Fire" Terminal Andor Kamera). Zusätzliche Vorteile der Verwendung der LED umfassen: die Fähigkeit, die Lichtintensität ohne Neutralfilter, Langzeitstabilität der Lichtintensität, und die Abwesenheit von mechanischen Schwingungen, die präzise Handhabung von Glaspipetten in Patch-Clamp-Aufzeichnung stören würde steuern .

Im Allgemeinen photobleach strukturell unterschiedliche Farbstoffe mit unterschiedlichen Raten unter den gleichen Aufnahmebedingungen. Es wäre daher ideal, um das Ausmaß der Photobleichung des Fluorophors in einem bestimmten Experiment verwendeten auszuwerten. Für FM Farbstoffe in Live Nervenenden ist es technisch schwierig, die Photobleaching Rate unabhängig von der synaptischen Aktivität zu bewerten, durch spontane oder Miniatur synaptischen Aktivität. Eine Abnahme der Fluoreszenzintensität während einer solchen activity kann durch den Verlust der biologischen FM Farbstoffe (Exozytose), Bleichen von FM-Farbstoffe, oder beides sein. Glücklicherweise sind die Strukturen der fixierbaren FM Farbstoffe sind für nahezu identisch mit denen der nonfixable FM Farbstoffe. In dem hier beschriebenen Protokoll wurden fixierbar FM Farbstoffe in synaptischen Vesikeln durch die gleichen Verfahren wie nonfixable FM Farbstoffen beladen, während die synaptische Aktivität wurde anschließend durch chemische Fixierung der Probe blockiert. Bemerkenswert ist, die Rate der Photobleaching gemessen mit diesem System war so niedrig wie 2-3% über 2 min, wenn die Aufnahmebedingungen waren die gleichen wie die für Live-Cell-Imaging ^19.

FM Farbstoffe können mit unterschiedlichen Protokollen verwendet werden, um verschiedene Aspekte der synaptischen Vesikel-Recycling zu erkunden. Verschiedene synaptische Aktivitäten während der Färbung und Entfärbung kann in verschiedenen Weisen kombiniert werden, abhängig von den experimentellen Ziele und Besonderheiten der synaptischen Vesikel-Recycling zu beurteilen. Die Auswahl der antagonists auch abhängig von dem Zweck der Experimente. Weiterhin können FM-Bildgebung während der Färbungsphase als auch während der Phase ^9,18,42 Entfärbung durchgeführt werden. Es sollte auch bedacht werden, jedoch, dass die FM-Farbstoffe können unerwartete Effekte, wie die Blockierung der muskarinischen Acetylcholin-Rezeptoren ⁴³ und durchdringt die mechanotransducer Kanäle ^44, Store-betrieben Ca ^{2 +-Kanäle 45} und ⁴⁶ ATP-Rezeptoren haben. Hohe Konzentrationen von FM Farbstoffe können möglicherweise ändern die Effizienz der synaptischen Vesikel Exozytose selbst ^47. Wir empfehlen daher Vorsicht bei der Gestaltung der Experimente und der Interpretation der Ergebnisse in Bezug auf synaptischen Vesikel-Recycling. Ergänzende Methoden zu prüfen, werden in synaptischen Vesikeln von Antikörpern, deren Epitope sind intra-luminalen Domänen der Vesikel-Proteine ​​gehören ^22,48 Aufnahme. Sie umfassen auch pH-sensitive GFP-Varianten, um Vesikel ^49-51 Lumen gezielte und Aufnahme zum Ausdruckvon pH-sensitiven Antikörper-Konjugate ^52-54, von denen sowohl die inner vesikulären pH-Änderungen Begleit exo-Endozytose zu erkennen.

Sobald eine solche unerwünschten Wirkungen sind ausgeschlossen, FM Farbstoffe haben breite Anwendungen. Zum Beispiel können sie verwendet werden, um anzugehen, ob die gleichen synaptischen Vesikel-Pools werden für spontane und evozierte gemeinsamen Vesikel-Freisetzungen ^17,55, in welchem ​​Umfang die Effizienz der synaptischen Vesikel-Recycling kann reguliert werden ^56,57, und welche Auswirkungen hat eine vorherige Zustand (Ruhe-oder stimuliert) stark auf den späteren Zustand der Vesikel-Recycling auf der Basis, z. B. spontane und Miniatur synaptischen Aktivität. FM Farbstoffe können auch verwendet werden, um synaptische Vesikel-Recycling auf ultrastruktureller Ebene zu bewerten, durch Korrelation von Beobachtungen aus Licht-und Elektronenmikroskopie von der FM Photo Verfahren ^30,58-62 werden. FM Farbstoff kann verwendet werden, um synaptische Funktionen und intrazellulären Ca ^{2 +} con gleichzeitig überwacht werdenKonzentration ^5. Neben der Kennzeichnung von synaptischen Vesikeln, die FM-Farbstoffe und andere fluoreszente Fluid-Phase Marker, wie Fluoreszenz Dextran ⁷ kann verwendet werden, um die Masse, die Endozytose durch intensive neuronalen Aktivität ausgelöst wird, zu überwachen. Abschließend werden die Anwendungen der FM Farbstoffe bieten eine unschätzbare Quelle für Informationen über das Recycling und die synaptischen Vesikel zusätzliche synaptische Funktionen.

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die Autoren danken den Mitgliedern des Harata für die Diskussionen während der Ausführung dieser Arbeit. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der American Heart Association, der Dystonie Medical Research Foundation, die Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, der National Science Foundation und der Whitehall-Stiftung finanziert NCH