誘発、自発的、およびミニチュアシナプス活動中に、FM色素を用いたシナプス小胞のリサイクルの検討

私たちは、機能的な神経末端での画像シナプス小胞のリサイクルへのスチリルのFM色素の使用を記載している。このプロトコルは、誘発するだけでなく、自発的な、ミニチュアシナプス活動にも適用することができる。プロトコルは、効果的に評価することができシナプス様々なイベントが展開されます。

機能的な神経終末におけるシナプス小胞は、エキソサイトーシスとエンドサイトーシスを受ける。このシナプス小胞の再利用を効果的に、膜ターンオーバーを明らかにするスチリルFM色素を用いて分析することができる。 FM色素の使用のための従来のプロトコルは、刺激（誘発）次のニューロンシナプス活性を分析するために設計した。最近では、プロトコルは、このような自発的またはミニチュアシナプスイベントなどの弱いシナプス活動を、同行のFM信号を分析するために利用可能となっている。 FM信号のこれらの小さな変化の分析は、撮像​​システムは、強度の小さな変化を検出するのに十分な感度でありながら大振幅の人為的変化が抑制されることを必要とする。ここでは、誘発するために適用することができるプロトコルで、自発的な、そしてミニチュアシナプスの活動を説明し、一例として、培養海馬ニューロンを使用しています。これは重要なので、このプロトコルは、FM色素の光退色率を評価する手段が組み込まれて成果物のソース強度の小さな変化を画像化する。

シナプス小胞の機能は、シナプス伝達の重要な決定因子である。彼らは、シナプス前細胞質膜（エキソサイトーシス）と融合すると、これらの小胞は、神経伝達物質を放出し、それらは、細胞膜（エンドサイトーシス）から再生し、神経伝達物質がリロードされた後にリリースの別のサイクルのための準備が。のダイナミクスとシナプス小胞のリサイクルのメカニズムの研究が大幅にスチリルのFM染料¹を導入することによって加速されています。積極的に親水性の頭部基と疎水性尾部を充電しているこれらの両親媒性分子は、（ 図1A、図1BにFM1-43の立体像における複数の色素）は、可逆的にそれらを透過することなく、脂質膜を出入りすることができます。 FM色素のグループは、彼らが発する光の範囲に影響を与える類似の特徴を共有しています。例えば、FM2-10、FM1-43、FM1-84は、2つの環状化合物との間の証つの二重結合を有するW緑色発光。両者の違いは、その疎水性を決定し、従って、膜からの出口速度が（departitioning）疎水性尾部の長さである。 FM5-95およびFM4-64の場合では、3つの二重結合は、環式化合物をリンクし、それらは、赤色発光を示す。これらの染料は、それらの親水性の部分に関して異なる。それらは親水性環境に疎水性環境の相対量子収率の増加により、生体膜に挿入されるときに、すべてのFM色素は、蛍光強度が増加する。従ってFM強度の変化は、膜ターンオーバーの変化を表す。異なる色（発光スペクトル）と疎水性は、FMは、シナプス小胞のリサイクリングにおける多目的な研究ツールを染色します。

シナプス小胞のリサイクル（ 図2）を分析する際に、これらの特徴に基づいて、FM色素は、主に以下のスキームに従って使用される。ニューロンsが、それらがエンドサイトーシス（染色）を介して形成するように、シナプス小胞（のSV）中に取り込まれることを可能にする、FM色素を含有する細胞外溶液に浸されている。染料は、その後、色素のない細胞外溶液を適用することにより洗浄されるが、これはすなわちだけ積極的に受けているエンドサイトーシスは、色素（ 図2下）がロードされ、シナプス小胞のクラスターが含まれています機能性神経終末を、明らかにしている。その後のエキソサイトーシスは、細胞外空間に、FM色素の損失と蛍光の付随する損失につながる（脱色;により親水性環境へのdepartitioning離れエキソサイトーシスのサイトからの拡散の両方に）。そのためのFM蛍光強度の変化は、シナプス小胞のエキソサイトーシスとの指標である。

FM色素は様々な生物および製剤^2,3におけるシナプス小胞を染色し、脱色するために使用されている。例としては、哺乳動物のneurを含める文化^4-9、哺乳類の脳スライス^10,11、神経筋接合部^12,13、網膜双極ニューロン^14,15、および蝸牛¹⁶の有毛細胞onal。

通常、このような実験で、染色や脱色の両方を広範囲にニューロン（誘発活性）を刺激することにより誘発される。外部刺激（自発的な、ミニチュアシナプス活性^）9,17-19がない場合にリサイクルを持っているとして、最近、しかし、弱い刺激に応答してシナプス小胞のリサイクルも、分析されている。自発的かつ小型のシナプス活動は、活動電位の自然発火（ 図3）を含む前者で、外部刺激の非存在下で発生するものとして定義される。これらの弱いシナプス活動は、広範囲の刺激によって誘発比べFM信号における小さな変化に関連している。測定は、FMの変化ことを必要とfluorescリファレンスの強さを正確にシナプス小胞エキソサイトーシスまたはエンドサイトーシスが、強度の人為的ではない変化を反映する。アーティファクトの原因の一つは、FM色素による細胞膜の非特異的染色の存在である。この成分の漸進的なウォッシュアウトが誤ってシナプスの活動に起因する測定された蛍​​光強度の緩やかな変化につながる。この因子は、（プロトコルを参照）適切な方法によって低減することができる。アーティファクトの最も顕著な原因は、シナプス小胞の内部に保持FM色素の光退色である。 FMの強度の光退色に関連した変化が測定される生物学（シナプス）の変化と比較して小さくなければならない。 例えば、電子増倍電荷結合素子（EMCCD）カメラ感度カメラの最近の開発は、露光時間を短縮し、フルオロフォアを励起するために使用される光の強度を弱めることにより、光退色を最小限にすることが可能となる。アーティファクトのもう一つの原因は、ドリフトIですN光学顕微鏡の焦点のレベル。イメージングセッションの間に焦点ドリフトは、機械的または熱的効果によって引き起こされることができ、誤って測定された蛍​​光強度の変化につながる。

ここで我々はそれが可能で、特に、小型のシナプス活性、微弱または無刺激の文脈においてシナプス小胞のリサイクルを分析するためにFM色素を使用することを可能にするプロトコルおよび装置を記載している。我々は、培養した齧歯類海馬ニューロンを用いて、誘発された自発的シナプス事象中の小胞の染色および脱色の例を示しており、脱色相を撮像する。我々はまた、シナプスの活動へのFM色素の損失がない場合には、FM色素の光退色の程度を評価する方法を示します。

1。哺乳動物の脳からの初代培養神経細胞

この研究で実行されたすべての動物の手順は、アイオワ大学の制度的動物実験委員会によって承認されています。

1. 生後0-1 ^19,20にマウスまたはラットから海馬のCA3-CA1領域の解離した細胞培養を準備します。 12mmのカバースリップ（厚さ数0）にプレート海馬細胞は、ラット神経膠細胞フィーダー層で、24ウェル皿に、ウェル12,000細胞/の密度では、preseed。
2. 文化^21を開発するための機能的な神経終末のために少なくとも8日間、海馬ニューロン。個々の神経終末がはるかクラスタリングすることなく、比較的孤立しているときに我々は、in vitroで 11から14日に神経細胞を使用しています。神経細胞は、試験管など Willig ら ²²とNosyrevaとKavalali ²³ は約​​21〜28日までの実験のために使用することができます。
3. のために機能的研究は、透過光顕微鏡（10-20Xの倍率で例えば位相差光学系）を使用した健康的な神経細胞の指標について（染色前）カバースリップを評価する。健康の指標は次のとおりです。均一なグリア細胞層、ニューロンの周りに明確な細胞のマージン、ビーズの構造なしに拡張樹状突起、クラスタ化された細胞体の欠如、およびバンドルされた神経突起がないことを。

2。 FM色素でシナプス小胞（染色）をロード

1. 原因電場刺激により誘発されるシナプス活動に染色（活動電位を伴う）
   1. HEPES系色素を含まない溶液に、FM色素を添加することにより、染色溶液1を準備し、 例えばタイロード液（詳細は解決策を参照してください）。 FM色素の濃度は、10μMのFM1-43および2.5μMのFM4-64である。典型的な濃度範囲は以下のとおりです。2月15日μMFM1-43、または2.5〜20μMのFM4-64 ^3,6。再発の抑制を必要とする実験のためにグルタミン酸作動性シナプス活性とシナプス可塑性の誘導は、さらにイオンチャネル型グルタミン酸受容体の拮抗薬を追加します。AMPA受容体（ 例えば 、10μMCNQX）およびNMDA受容体（ 例えば 、50μMAP5）。
   2. プレーンタイロード溶液をあらかじめ充填イメージング室に培養液から細胞を用いてカバースリップを転送します。我々は（6.3ミリメートル、RC-21BRFSで区切られた白金線）の側壁に付着し、刺激電極とイメージングチャンバーを使用しています。この室は、〜200μLのバス容量で、閉じられた画像化室として設計されたが、我々は（トップカバースリップのないIE）開放室としても使用されている。転送中に、空気に培養細胞を公開し、（周長ではなく、中央付近からカバースリップを上にして選択してください）​​ピンセットで培養された細胞を挟まないようにしてくださいしないでください。
   3. 室温（23-25​​℃）で無地タイロード溶液で撮像チャンバーを灌流。
   4. 染色溶液1を共同で適用されますnstant灌流。
   5. 電気パルスを印加することによって、シナプス活性を呼び起こす。海馬ニューロンにおけるシナプス小胞のリサイクル計プールの最大染色のために、60〜120秒²⁴のための10 Hzでの文化を刺激する。電場刺激の最大効率を達成しようとしたとき、念頭に置いていくつかの機能を保持します。ニューロンを保ち、完全に（）生きている神経細胞を維持するため、均質な電界を得るためでタイロード溶液の薄い層に浸漬電極を刺激しながら1）浴溶液の高さは、できるだけ低くあるべきである。 2）現在の強度および持続時間は、 例えば 、蛍光性Ca ^{2 +}イメージング神経細胞の興奮性の指標を使用して最適化する必要があります。我々の場合、30ミリアンペアの強さと1ミリ秒の持続時間の定電流は、信頼性の高い結果が得られます。 3）浴溶液は、刺激中に一定流量で適用されるべきである電気刺激は、プロトンを引き起こし、電気分解をもたらす（H +）正に帯電した陽極と静的風呂で急速に減少する負極に近いpHで蓄積する。 pHインジケーター（フェノールレッドと例えばハンクス平衡塩溶液）が含まれている溶液に百を超える数パルスを渡すことで、別の実験で酸性化を確認してください。
   6. ポスト刺激エンドサイトーシスが^25を完了されるように、電場刺激が、終了した後に追加の60秒間染色液1のニューロンのままにしておきます。
   7. （リンス液1、色素のないタイロード液を加えたAMPA受容体及びNMDA受容体（2.1.1項を参照）のアンタゴニスト、および電位依存性のNa ⁺チャネルのブロッカーでそれを灌流による撮像室から染色液を洗う例えば 0.5〜1μMテトロドトキシン、TTX）。ブロッカーの組み合わせは、自発的なシナプス活動を通じて、FM色素の損失を抑制します。洗浄効率を最大にするために、（灌流速度を増加させる例えば、最大5〜6ミリリットル/分）1〜2分間、およびピペットを用いて、手動で開いている画像化室に直接溶液1すすぎのボーラス（ 例えば 1ミリリットル）を追加します。培養ニューロンを乱さないように、手動注入の強さと方向を制御する。
2. により高K ^+溶液 （活動電位を伴わない）によって誘発されるシナプス活性の染色。
   1. 高K ⁺タイロード液に、FM色素を添加することにより、染色溶液2を準備します。具体的には、塩化ナトリウムのための塩化カリウム等モル置換により、45 mMのKClで修正されたタイロード溶液を調製する。必要に応じて、AMPAおよびNMDA受容体のアンタゴニストを追加します。この高K ^+溶液は、継続的に神経細胞を脱分極神経終末へのCa ^{2 +}流入を可能にし、最大限の範囲で²⁶にシナプス小胞エキソサイトーシスを開始します。より高濃度（70〜90ミリモル）も例えば Klingauf ら ²⁷他のレポートで使用されていたdはリチャーズら ²⁸
   2. プレーンタイロード溶液をあらかじめ充填イメージング室に培養液から培養ニューロンとカバースリップを転送します。
   3. 一定の灌流で染色液2を塗布又はピペット^26,28を用いて1〜2分間室温でニューロンを染色する。後者の場合、最終色素濃度は、無染料の溶液の既知の体積に染色液2の既知の体積を加えることによって制御されるべきである。
   4. セクション2.1.7で説明したように、撮影室から染色液を洗う。
3. 自発的な、ミニチュアシナプス活性のために染色。
   1. 以上60分間培養インキュベーターに配置することにより、37℃〜予熱し、炭酸水素ベースのソリューション（ 例えば最小必須培地、MEM）。
   2. 自発的なシナプス活性に基づいて染色のために、MEMに、FM色素を添加することにより、染色溶液3を準備します。染色のために男に基づくシナプス活性iniature、染色液3にTTXを追加することにより、染色液4を準備します。
   3. 溶液3または4を染色するために、培養培地から培養ニューロンとカバースリップを転写し、10分間37℃で同じ染色溶液でそれらを残すことによって染色ニューロン。
   4. 解決策1すすぎで簡単にカバーガラスを洗浄します。
   5. イメージングチャンバー内の溶液1すすぎにカバースリップを転送します。次の点に注意してください。 1）細胞は、空気中に露出されるべきではなく、必要に応じて、すすぎなしで画像化室に直接カバースリップを転送する。 2）ニューロンは、HEPESベースの溶液で染色溶液3または4を交換して、室温で染色することができる。 3）ニューロンは、染色溶液で2染色液3または4を交換し、室温で残りの工程を行うことにより、この方法を用いた高K ^+溶液のコンテキストで誘発シナプス活性のために染色することができる。
   6. 画像から染色液を洗うセクション2.1.7で説明したように、チャンバ。

3。 FMの染料を洗い流す

1. 上記の方法（セクション2.1.7）のいずれかによる神経染色および初期洗浄した後、室温で5〜10分間溶液1を洗浄して画像化室を灌流し続けています。これは、細胞膜と細胞外液からのFM色素を除去します。我々の撮像チャンバの場合には、浴灌流速度は600-1,200液/分である。洗浄はまた、シナプス活動¹⁷にFM色素の損失を抑制するために、細胞外Ca ^{2 +}の非存在下で実施することができる。洗浄はAdvasep-7、形質膜^29〜31からFM色素のスカベンジャーとして作用する修飾シクロデキストリンの簡単な適用により向上させることができる。それは、FM涙点³¹の強度を低減し、HEAを損なうことの両方を避けるためにあらゆるAdvasep-7の露出ショート（単層培養の場合、 例えば 5秒）を維持することが重要です細胞のLTH。原形質膜におけるFM1-43の蛍光はまた、シナプス小胞^32に入らないクエンチャーローダミン101（50μM）を適用することによって抑制することができる。

4。洗浄中に最適な画像フィールドを検索

1. 画像化される分野では、細胞が高倍率と高開口数の対物レンズ（ 例えば 40倍）で、透過光顕微鏡を用いて、健康であることを確認します。このセクションから、我々は、位相コントラストまたは微分干渉コントラスト光学系を備えた倒立顕微鏡（エクリプスチタン、ニコン）を使用し続ける。この顕微鏡はまた、顕微鏡焦点ドリフトを克服する連続的なリアルタイム焦点補正を可能にパーフェクトフォーカスシステム（PFS）を備えている。この機能は、同じ焦点面に脱色中、タイムラプスイメージングのために不可欠です。
2. その染色は蛍光光学系を使用することにより、効果的であったことを確認します。 AVFMの涙点のOID集合体の個々の神経繊維末端は見分けることが困難になるので、彼らは、研究の対象である場合を除きます。 FMの涙点の形状に注意を払う：ステンド終末の大部分は、円形のビーズの文字列として表示された場合は、不健康な神経末端を表すことができます。光退色を避けるために、強い蛍光励起にニューロンの露出を最小限に抑えることができます。

5。シナプス小胞からのFM色素をアンロード（脱色）

1. 電場刺激によって誘発シナプス活性による脱色。
   1. （溶液1すすぎとしてではなく、TTXない同じ）リンス液2で広範囲の神経細胞を灌流することにより、TTXを洗浄する。電場刺激によって誘導された細胞質のCa ^{2 +}過渡の蛍光性Ca ^{2 +}イメージングなどにより同様の洗浄パラメータ（灌流速度と持続時間）を使用して、別の実験でTTXのウォッシュアウトの有効性を確認するか、ボルトのパッチクランプ記録により年齢依存性^{Na +}電流。
   2. FM色素を撮像立。 FM1-43またはFM4-64を画像化するため、520または650nmのロングパス発光フィルタ、それぞれ490 nm励起フィルターを使用する。短い露出時間（ 例えば、10〜20ミリ秒）、弱励起強度（ 例えば、パワーLEDの5〜10％）、高感度（ 例えば、EMゲインを有する）を用いて、画像ごとに1〜2秒を取得する。露光時間と蛍光励起の強度を低減することによりFM色素の光退色を最小限にする。パーフェクトフォーカスシステムをオンにすることにより、顕微鏡焦点ドリフトを最小限に抑えることができます。
   3. （120秒間10 HzでEG）フィールド刺激を使用して^、20を溶液2すすぎのニューロンを刺激する。
   4. FM色素の全てリサイクルシナプス小胞を枯渇させる、1〜2分の休憩時間を介在させて、刺激の複数のラウンドを適用します。目にFM色素で染色したシナプス小胞の総リサイクル·プールのサイズを評価する場合、これは重要であるE以前の状態^20,33。
2. によりシナプスの活動に脱色して活動電位が存在しない場合に誘発。
   1. FM色素を撮像開始。
   2. 溶液1または2すすぎに溶解刺激試薬を適用します。このような試薬が含まれます：塩化カリウム（高K ^+溶液中、 例えば 45 mM）を^26に 、イオノマイシン（細胞外液から細胞内へのCa ^{2 +}流入を可能にすることにより、細胞内Ca ^{2 +}濃度を上昇させるのCa ^{2 +}イオノフォアは、時などに使用される^{5μM）20,34、}およびショ糖（容易に剥離可能なプール、500 mmと使用例 ^）35,36からのシナプス小胞の放出を刺激する高張液。ワーナーインスツルメンツ^37、またはY-チューブシステム^38〜40のからSF-77Bシステム例えば 、試薬を適用する際に信頼性の高い時間的制御のための高速、ローカル灌流システムを使用してください。
3. 自発とMINに脱色シナプス活性をiature。
   1. 自発シナプス活性に脱色のために、リンス液2を使用して、（5.1.1項）、上記のように、TTXを洗い流す。溶液2をすすぐとニューロンを灌流しながら、FM色素を撮像立。溶液1（TTXで）をすすぐとニューロンを灌流を継続しながら原因ミニチュアシナプスの活動に脱色については、FM色素を撮像立。
   2. 自発的またはミニチュアいずれかの活動に基づいて脱色した後、誘発シナプス活動を通じて脱色による機能神経末端を識別します。活性は、上述の方法のいずれかによって誘発することができる。染色された構造は、このプロセスの誘発活性助剤による機能性神経末端以外のもの（ 例えば、ゆっくりと再循環エンドソーム小胞または星状細胞）、および脱色の多量とすることができるので、この識別プロセスが必要である。

6。 FM色素の退色速度を評価する

1. アルデヒド固定可能なFM色素（ 例えば FM1-43FX、FM4-64FX）と神経終末を染色。これは、前述の誘発、自発的な、又は小型の染色法を用いて行われ、かつ固定可能なFM色素でFM色素を置き換えることによって可能である。
2. セクション2.1.7で説明したように固定可能なFMの染料を洗い流す。
3. 化学的に固定液にカバースリップを転送することによってニューロンを修正：4℃で30分間、タイロード液中の4％パラホルムアルデヒドおよび4％スクロース固定可能なFM色素の蛍光強度は、化学固定後に保持される。
4. 二回新鮮なタイロード液にカバースリップを転送することにより、タイロード溶液中で10分間固定液を洗い流す。
5. イメージングチャンバー内の新鮮なタイロード液にカバースリップを転送します。
6. 生ニューロンについての撮像パラメータの同じセットを使用して固定可能なFM色素を撮像開始。これは、任意の化学的に固定された試験片を使用した後に非常によくイメージング室をすすぐために重要であるため残りの固定剤は、同じチャンバ内で実施後続の生細胞イメージング実験に影響を与えることができる。別の方法として、固定細胞イメージングに、染色された生細胞は、光退色速度を評価するために画像化されることがあります。しかし、それは急性ミニチュアシナプス活性を遮断することが困難であることに留意しておく価値があり、例えば、小型の活動の周波数は、細胞外Ca ^{2 + 23を}除去することにより約50％に低減することができるが、それは完全ではない封鎖。
7. 各撮像セッションの終了時に、FM蛍光強度の絶対値を評価するための背景画像を取得する。 FMの涙点の強度は、神経終末において、FM色素からの真の信号だけでなく、神経細胞の単層培養、2）カバーガラスおよび光学部品（ 例えば 、対物レンズ、フィルタ、根底にある1）グリア細胞からのバックグラウンドノイズだけでなく、を表しミラー）、および3）検出器（EMCCDカメラ）。バックグラウンドノイズがASSEです画像化されたフィールドのnonstained地域でssed。このような領域は、強度のスペースまたは異機種が限定されている場合、カメラのシャッターを閉じた状態で、画像でそれを代用し、それが理想的な方法はないが、検出器からのノイズを取得する。同じ撮像パラメータを用いて、約10画像を取得する。

7。画像解析

1. 時系列画像のスタックとして画像解析ソフトに取得したデータをインポートします。私たちは分析するFM涙点間の動きのわずかな程度を補正するためのImageJ（WS Rasband、NIH）および関連プラグイン、 例えばブレ補正プラグイン（カンLi）を使用し、時系列アナライザV2.0（バラジJayaprakash）時系列。
2. シリーズ（Δfmの）の開始時と終了時のFM強度の変化を計算します。この目的のために、脱染の開始前及び脱色（ 例えば 、5画像フレーム毎）の終了後に画像を平均化し、subtractinによって差分画像を生成するG彼ら。
3. 差分画像に強度閾値を適用することで、潜在的に機能的な神経終末を特定し、その強度がしきい値よりも高い画素を検出。閾値を設定する一つの方法は、裸のカバースリップ領域から得られたバックグラウンド強度の標準偏差を選択することである。
4. 検出された連続する画素として単離され、機能的な神経終末を特定し、それがサイズの基準（連続性のピクセルの最小と最大の数字）を満たす。このプロセスは、バックグラウンドノイズと分析からの集約された神経末端を除去する。
5. （個々のクラスタは、個々の神経末端に対応する）検出された画素のクラスタ上の領域·オブ·インタレスト（ROIを）を割り当てます。 （Δfmの）を脱色時の強度の変化量は、分析の代表的なパラメータです。これは、誘発された自発的またはミニチュアシナプス活性の累積量を表す。彼らは次のいずれかを示す場合のROIを除外実験の目的に応じて強度の変化：録音中に増加、刺激の前突然の減少、または刺激後に長い待ち時間。
6. 画像解析ソフトに取得した時系列データをインポートすることによって、光退色の速度を評価する。背景画像を平均（ 例えば 、閉じたシャッター付き）、および個々の画像からそれを引く。推定される神経末端に対応したFM涙点へのROIを割り当て、時間の経過とともに、ROIの強度の変化を測定する。

ソリューション

1. タイロード液
   • （単位：mm）組成：125のNaCl、2のKCl、2 CaCl _2で 、2のMgCl _2、30グルコース、25 HEPES、310 mOsmで、pHは7.4。
2. 染色液1
   • タイロード液に加え、FM色素。
   • この溶液を電気刺激によって誘発シナプス活性に基づいて、染色のために使用される。
   • AMPA受容体およびNMDAアンタゴニストを追加receptoRS必要に応じて。
3. 染色液2
   • 高K ⁺タイロード液に加え、FM色素。
   • この改変タイロード溶液をNaCl用のKCl等モル置換することにより、45 mMのKCl濃度を増加させることによって調製される。
   • この溶液を連続的脱分極によって誘発シナプス活性に基づいて、染色のために使用される。
   • 必要に応じて、AMPA受容体とNMDA受容体の拮抗薬を追加します。
4. 染色液3
   • MEM液に加え、FM色素。
   • この溶液を自発的なシナプス活性に基づいて、染色のために使用される。
5. 染色液4
   • MEM液に加え、FM色素およびTTX。
   • この溶液を、小型のシナプス活性に基づいて、染色のために使用される。
6. 解決策1すすぎ
   • タイロード溶液を加えたAMPA受容体およびNMDA受容体のアンタゴニスト、およびTTX。
7. 解決策2すすぎ
   • タイロード溶液を加えたAMPA受容体およびNMDA受容体のアンタゴニストが、TTXなし。

一例として、我々は、シナプス小胞の脱染色の時間経過（ 図4）のための代表的な結果を示す。培養海馬ニューロンは自発的シナプス活性（ステップ2.3）を使用して、FM4-64で染色し、染料を含まない溶液（溶液2すすぎ）で洗浄した。イメージングは、自発的な活動（ステップ5.3）、（連続線の最初の部分、 図4A）を使用して、初期の脱色時間経過を示す。これは、120秒毎（ステップ5.1）、10 Hzの電場刺激で誘発された活動の3つのラウンドを用いて脱色時間経過が続く。誘発脱色の量を測定する一つの方法は、小胞のリサイクル計プールのサイズに対応して両端矢印（Δfmの_誘発 ）で示されている。

最初の刺激が与えられた前に、（ 図4Bに拡大）のFM強度が徐々に減少した。この減少は、脱染色で構成されていた自発シナプス活動へ（Δfmの_SPONT）と光退色（Δfmの_PB）。光退色の寄与が小さい場合には、preimagingベースライン（Δfmの_自発 +Δfmの_PB）からの変更点は、自発的な活動の脱色量の近似として使用することができる。

図1。 FM色素の構造。A. FM染料を共有いくつかの共通の構造的特徴。親水性基は、水性溶液中に滞在し、疎水性尾部は、FM色素は膜に分割することを可能にする。 FM2-10、FM1-43とFM1-84のショー緑色発光、FM5-95およびFM4-64のショーレッドシフトし、発光している。FM1-43のBの立体像、最も一般的に使用されたFM色素。親水基は、上を向いていると疎水性尾部が下を向いている。 Nitrフィブリノーゲン原子は青色です。 FM1-43の他の図については、SchoteとSeelig ^63を参照してください。

図2。水溶液中でそれがはるかに少ない蛍光（灰色）であるのに対し、FM色素の使用の基本的なスキームは、ニューロンに適用した後、原形質膜に挿入されたFM色素は、蛍光（緑色）となる。それは通常、エキソサイトーシスに続いて、エンドサイトーシスを受けるとき、シナプス小胞（SV）は、FM色素により（染色）がロードされている。細胞外液中のFM染料を洗い流すのみ染色された小胞は蛍光できるようにします。それはエキソサイトーシスを受けるため、FM色素を離したときに、その後、シナプス小胞は（脱染）アンロードされます。下の画像はFM1-43と培養した海馬神経細胞の模範染色（蛍光および位相コントラスト画像の重ね合わせを示している）。それは、このホワイトペーパーで説明されたプロトコルでは、蛍光涙点は、シナプス前神経末端ステンドシナプス小胞のクラスターと（典型的な中枢ニューロンの直径約1ミクロン）ではなく、個々のシナプス小胞（直径〜40 nm）を表していることに注目すべきである。簡略化のために、このスキームは、シナプス小胞のエキソサイトーシスの概念を表す。このようなクラスリン依存性エンドサイトーシス、一過性のキス·アンド·ランエキソサイトーシス、およびバルクエンドサイトーシス⁶⁴に続くフル崩壊融合などのエキソサイトーシスの複数のフォームを含めることができます。 の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。この図。

図3。 FMイメージングによって研究シナプス活動の3つのタイプ。誘発シナプス活性は、一般的に外部の電気的​​刺激を必要とします。自発的なシナプス活性は、電気的刺激がない場合に発生します。ミニチュアシナプス活性は、電気的刺激がなく、活動電位なしで自然に発生し、通常の活動電位発生が電位依存性Na ^{+チャネル} 、テトロドトキシンのブロッカーによって抑制される。エキソサイトーシスは、高K ^+溶液 （連続脱分極）、イオノマイシン（細胞質Ca ^{2 +}濃度の継続的な増加）、およびショ糖（容易に放出可能プール内小胞のエキソサイトーシスを誘導する）を含む高張液によって刺激されたときに追加の活動が誘発活動が含まれ、エキソサイトーシスを受けるシナプス小胞のための活動電位発火を必要としませんすべてが。いくつかの研究において、自発的な活動が広くならびに小型の活性を包含するように定義されることに留意されたい。

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図4。脱色の代表的な結果。A.培養海馬ニューロンは、37℃（ステップ2.3）で10分間、2.5μMFM4-64との自発的な活動によって染色し、（プロトコル3）で洗浄した。ニューロンは自発的活動（ステップ5.3）で脱色の際に画像化され、誘発活動（ステップ5.1）、（連続した曲線は、N = 25の神経末端の平均）の3回行った。垂直バーは、SEMを表す。 Y軸は、カメラのシャッターが閉じているときに強度を表す絶対的なFM強度「0」を表す。誘発脱色の総量（Δfmの_誘発 ）が表示されます。B. AnはパネルA（連続曲線、明確にするために省略のSEMバー）で脱染の初期段階の表示を拡大した。 60秒の観察中、拘留は主に自発的な行為によるものであったivity（Δfmの_SPONT）が、（Δfmの_Pb）を光退色に部分的に起因した。 FM4-64（太い点線）の光退色時間経過を固定可能FM4-64（プロトコル6）を撮像することによって別の実験で決定した。速度は、2分（9分間にわたってカーブフィッティングにより決定5736秒の時定数を有する単一指数関数^）19上に2〜3％であった。光退色曲線はFM4-64の測定強度と初期値と同等の指数関数として描かれた。嘉数らに補足図S5参照。光退色のための¹⁹より長い期間（9分）にわたって、および可変励起強度と露光時間で。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

私たちは誘発、自発的な、ミニチュアシナプス活動に応答してシナプス小胞を染色し、脱色用、および脱色段階中の画像化のためのプロトコルを記載している。既存のプロトコルに加えて、我々は小型のシナプス活性に基づいて、FM脱色を観察する新しいプロトコルを含んでいた。これらのプロトコルを使用して、我々は以前に運動障害、ジストニアのモデルマウスから培養ニューロンにおける異常を同定した。野生型マウスにおけるそれらの対応物と比較して、これらのニューロンは、高活性²⁰で刺激したときのCa ^{2 +}依存的にシナプス小胞エキソサイトーシスを促進さ受けた。神経伝達物質の放出¹⁹のパッチクランプ電気生理学的記録により確認されたものニューロンはまた、より頻繁に小型のシナプス活性を示した。

このような分析でのFM染料を使用するためのプロトコルの重要な側面は、ASSEにあるSSと光退色を最小限に抑えます。光退色に起因する変化はシナプス活性によって引き起こされるものと比較して小さい場合FM蛍光強度の微妙な変化を確実に評価することができる。縮小光退色にも細胞毒性を抑制または排除する可能性を秘めています。光退色は、励起光に対する蛍光体の曝露を最小限に抑えることによって低減することができ、ライブイメージング実験でこれを行うための装置の少なくとも2つの成分​​が存在する。一つの重要な構成要素は、EMCCDカメラ例えば 、光子の高感度検出器である。これは、負に蛍光発光の検出に影響を与えることなく、露光の持続時間及び強度を最小化することが可能となる。関連付けられたコンポーネントは、検出器が画像を取得する場合にのみ励起光に対する試料の曝露を制限する光源システムである。これは簡単に露光タイミングの効率的な制御を可能にするLED光源^41（ON / OFF tで達成されるakes 1ミリ秒よりもはるかに少ない）。露出はカメラからのデジタル出力（アンドールカメラでは例えば 「火」の端末）で、唯一の画像取り込みの際にトリガすることができます。 LEDを使用することの追加の利点としては、中性濃度フィルタを使用せずに光強度を制御する能力は、光強度の長期安定性、およびパッチクランプ記録のようにガラスピペットの正確なハンドリングを妨げる機械的振動が存在しないことを。

一般的に、構造的に異なる染料が同一の撮像条件の下で異なる速度で光退色する。従って、特定の実験において使用されるフ​​ルオロフォアの光退色の程度を評価することが理想的であろう。ライブ神経末端においてFM色素については、それは、自発的または小型のシナプス活性に、シナプス活性の退​​色速度の独立性を評価するために技術的に困難である。このようなactivit時の蛍光強度の減少yはFM色素（エキソサイトーシス）、FM色素の退色、または両方の生物学的損失に起因する可能性がある。幸いなことに、固定可能なFM色素の構造はnonfixable FM色素とほぼ同一であるように設計されている。シナプス活性は、試料の化学的固定によって、後にブロックされたのに対し、ここで記述されたプロトコルでは、固定可能なFM色素は、nonfixable FM染料と同様の方法で、シナプス小胞に入れた。撮像条件は、生細胞イメージングのための¹⁹のものと同じであった場合に特に、このシステムを用いて測定された光退色の速度は、2分かけて2〜3％と低かった。

FM色素は、シナプス小胞の再利用の多様な側面を探求するために、異なるプロトコルで使用することができる。染色および脱色中に別のシナプス活動は、実験の目的と評価されるシナプス小胞のリサイクルの具体的な機能に応じて、さまざまな方法で組み合わせることができる。 antagonの選択ISTSはまた、実験の目的に依存します。また、FMイメージングは、染色段階の間、並びに脱色段階^9,18,42の間に実施することができる。また、留意すべきである、しかし、FM色素は、例えば、ムスカリン性アセチルコリン受容体^43を遮断、および^44、ストア作動性Ca ^{2 +}チャネル⁴⁵ mechanotransducerチャンネルを透過し、ATP ⁴⁶受容体などの予期せぬ効果を有することができる。 FM色素の高濃度は、潜在的にシナプス小胞のエキソサイトーシス自体⁴⁷の効率を変更することができます。したがって、私たちは実験を設計し、シナプス小胞のリサイクルについての結果の解釈には注意することをお勧めします。考慮すべき補完的な方法には、エピトープ小胞タンパク質^22,48の内腔ドメインである抗体のシナプス小胞への取り込みが含まれます。彼らはまた、小胞の内腔^49-51を対象とpH感受性GFP変異体を発現させ、取り込みが含まれエキソサイトーシスに伴うイントラ水疱性pH変化を検出^52-54どちらもpH感受性のコンジュゲートの抗体。

このような望ましくない効果が排除されると、FM色素は、広い用途を有する。例えば、これらは、同じシナプス小胞プールが自発的に共有されているかどうかに対処するために使用され、小胞のリリース^17,55を誘発、どの程度シナプス小胞のリサイクルの効率は^56,57を調整することができるようにすることができ、どのような効果がない以前の状態（RESTまたは刺激されている） など 、自発的かつ小型のシナプス活性に基づいて、小胞のリサイクリングの後の状態で発揮する。 FM色素はまた、FM光変換方式^30,58-62により光および電子顕微鏡の観察を相関させることにより、超微細構造レベルでのシナプス小胞の再利用を評価するために使用することができる。 FM色素は同時に、シナプスの機能および細胞内Ca ^{2 +}詐欺を監視するために使用することができるセンタリング^5。シナプス小胞、FM色素および蛍光デキストラン⁷などの他の蛍光性流体相マーカーの標識に加えて、強い神経活動によってトリガされるバルクエンドサイトーシスをモニターするために使用することができる。結論として、FM色素のアプリケーションでは、シナプス小胞のリサイクルと追加のシナプスの機能に関する情報の貴重な情報源を提供する。

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

著者らは、この作業の実行中有用な議論のために原田研究室のメンバーに感謝。この作品は、米国心臓協会、ジストニア医学研究財団、エドワード·マリンクロット·ジュニア財団、全米科学財団、およびNCHのホワイトホール財団からの補助金によって賄われていた