Ressonância Magnética Funcional (fMRI), com estimulação auditiva em aves canoras

Este artigo mostra um procedimento otimizado para imagens dos substratos neurais da estimulação auditiva no cérebro songbird usando ressonância magnética funcional (fMRI). Ele descreve a preparação dos estímulos sonoros, o posicionamento do sujeito e da aquisição e posterior análise dos dados de fMRI.

A neurobiologia do canto dos pássaros, como um modelo para a fala humana, é uma área pronunciado de pesquisa em neurociência comportamental. Considerando eletrofisiologia e molecular abordagens permitem a investigação de qualquer diferentes estímulos em alguns neurônios, ou um estímulo em grandes partes do cérebro, o nível de oxigenação do sangue dependente (BOLD) Ressonância Magnética funcional (fMRI) permite combinar as vantagens, ou seja, comparar a ativação neural induzida por diferentes estímulos em todo o cérebro de uma só vez. fMRI em pássaros é um desafio por causa do pequeno tamanho de seus cérebros e porque os seus ossos e, especialmente, seu crânio compreendem inúmeras cavidades de ar, induzindo importantes artefatos de suscetibilidade. Gradiente-eco (GE) fMRI BOLD tem sido aplicado com sucesso para pássaros ^1-5 (para uma revisão, ver ^6). Estes estudos se concentraram nas áreas primárias e secundárias auditivas cerebrais, que são regiões livres de artefatos de suscetibilidade. No entanto, devido proccessos de interesse pode ocorrer para além dessas regiões, todo o cérebro fMRI BOLD é necessário utilizar uma seqüência de ressonância magnética menos suscetíveis a esses artefatos. Isto pode ser conseguido através da utilização de spin-eco (SE) NEGRITO RMf ^7,8. Neste artigo, descrevemos como usar esta técnica em tentilhões-zebra (Taeniopygia guttata), que são pequenos pássaros com um peso corporal de 15-25 g extensivamente estudado em neurociência comportamental do canto dos pássaros. O principal tema de estudos de fMRI sobre pássaros é a percepção da música e aprendizagem da música. A natureza auditiva dos estímulos combinados com os fracos sensibilidade BOLD de SE (em comparação com GE) seqüências de fMRI baseados faz com que a implementação desta técnica muito desafiador.

1. Preparação dos estímulos auditivos

1. Primeiro gravar o som-estímulos ao ser jogado dentro do furo do sistema MR 7T. O furo é de um espaço confinado, que pode distorcer os estímulos auditivos, resultando na melhoria de determinadas frequências auditivas. Figura 1 mostra as frequências aumentadas e suprimida, como mostrado pelas nossas gravações de ruído branco feito no local da cabeça da ave no magneto usando um microfone de fibra óptica (Optimic 1160, Optoacoustics). Para compensar este aumento artificial, uma função de equalizador é aplicada a cada estímulo usando o software WaveLab. Para nossa configuração particular, a função consiste em um kernel gaussiano com os seguintes parâmetros: amplitude máxima:-20dB, centrado em 3750 Hz, largura: 0,05 oitavas (correspondente à faixa 2.500-5.000 Hz para o nosso sistema).
2. Os estímulos músicas são compostas por vários motivos músicas individuais de cada pássaro intercaladas com períodos de silêncio. O dguração destes períodos silenciosos é ajustado para manter a quantidade total de som e silêncio idênticas para todos os estímulos. Esta construção conserva a variabilidade intra-individual e inter-individual natural da duração da música. O comprimento total de cada estímulo é de 16 seg. A intensidade de cada canção é normalizada em termos de correspondência raiz quadrada média e high-pass filtrado a 400 Hz, antes de ser integrado ao estímulo completo (canção e períodos de silêncio). Essas manipulações são feitas utilizando o software Praat.
3. O experimento consiste de um botão ON / OFF projeto alternando períodos de estimulação auditiva bloco (em blocos) com períodos de descanso (OFF blocos) (Figura 2). Cada bloco (ON e OFF) dura 16 segundos, o que corresponde ao tempo de aquisição de duas imagens (veja abaixo para aquisição). Cada tipo de estímulo é apresentado 25 vezes, resultando na aquisição de 50 imagens por estímulo e por assunto. A ordem de apresentação das condições deve ser ao acaso dentro e entreassuntos. Esta ordem aleatória dos estímulos podem ser codificadas em software de apresentação.

2. Assunto Preparação

2.1 Sujeito eo tamanho do grupo

Aqui é apresentado um protocolo adaptado especificamente para a utilização de (adulto) mandarins. A escolha da espécie depende da pergunta científica. No entanto, outras considerações como ave robustez para anestesia pode também ser tida em conta. Zebra tentilhões (Taeniopygia guttata) devem ser alojados em viveiros sob 12 horas de luz: 12 horas de fotoperíodo escuro e ter acesso a comida e água ad libitum durante todo o estudo. O número mínimo de indivíduos por ensaio é 15. Esse número leva em conta a sensibilidade de fMRI spin-echo ea variabilidade inter-individual natural de fenômenos biológicos medidos no experimento.

2.2 Instalação de configuração e preparação do animal

(Para especificaçãodo equipamento utilizado, referimo-nos a lista de reagentes e equipamentos específicos no final do artigo)

1. Instalar a máscara bico na cama MRI de um sistema de MR T7 e conectá-lo ao dispositivo controlador de gás com tubos de plástico. Abra as duas garrafas de gás oxigênio e nitrogênio e ligar o dispositivo controlador de gás (oxigênio vazão: 200 cc / min; nitrogênio: 400 cc / min).

Como mencionado acima, um sistema de RM T7 é usado na configuração apresentada. Outros sistemas de RM com diferentes intensidades de campo também são possíveis, mas a T7 é alcançado um bom compromisso entre a relação sinal-ruído e grau de artefatos de suscetibilidade (ver discussão). Em mais elevadas intensidades de campo a relação sinal-para-ruído irá aumentar juntamente com o grau de artefactos de susceptibilidade.

2. Ligue o sistema de controle de feedback e um dispositivo de fluxo de ar quente.
3. Anestesiar o tentilhão com 3% de isoflurano em uma mistura de oxigênio e nitrogênio através da introdução de seu bicona máscara e segurando a cabeça para baixo até que a ave está totalmente anestesiado. Isto pode ser verificada por meio de puxar o pé suavemente: quando a ave está completamente sedado o pé não vai ser retraído pela ave. Além disso, os olhos da ave irá ser parcialmente fechada.
4. Introduzir a sonda de temperatura cloacal para a tela a temperatura do corpo e monitorar a taxa de respiração, colocando um sensor pneumático debaixo da barriga do passarinho zebra. Feche o revestimento para conter o corpo do animal (Figura 3).
5. Manter a taxa de respiração dentro do intervalo de 40-100 ciclos por minuto e manter a temperatura corporal constante dentro de uma faixa estreita de 40 ± 0,5 ° C. Quando o intervalo para respirar é muito baixa / alta, ajustar o nível de anestesia (% isoflurano) em conformidade. Quando o problema persistir, o ensaio deve ser parado e o animal retirado da instalação, a fim de recuperar.
6. Posicione os alto-falantes dinâmicos não-magnéticos de cada lado da cabeça do passarinho zebra e congar-los para o amplificador. Certifique-se de que os fios dos alto-falantes são levados para longe da sonda de temperatura, pois pode influenciar a leitura da temperatura quando muito perto.
7. Coloque a bobina de superfície no topo da cabeça Finch zebra e a posição de zebra no centro do íman (e automaticamente o centro da bobina de transmissão, que está situado no meio do íman).
8. Reduzir o nível de anestesia para 1,5% de isoflurano misturado com o oxigênio e nitrogênio.

3. Aquisição de Dados

1. Adquirir um conjunto de 1 sagital, uma horizontal e uma imagem olheiro coronal gradiente-eco (GE) (sequence-piloto tri) e conjuntos de imagens multi-slice horizontal, coronal e sagital (T ₂ ponderada aquisição rápida de relaxamento avançada (pilotagem RARE) sequência SE) para determinar a posição do cérebro no íman (Figura 4).
2. Diminuir o ruído dos gradientes, aumentando os tempos de rampa para 1000 mS.
3. Prepare a sequência de fMRI: RARE T seqüência ₂ ponderada, eficaz TE: 60 ms, TR: 2000 ms, fato raro: 8, FOV: 16 mm, tamanho da matriz: 64 x 32, a orientação: sagital, espessura de corte: 0,75 mm, Inter-slice espessura de espaço: 0,05 milímetros, 15 fatias cobrindo quase todo o cérebro (Figura 4).
4. Selecione o protocolo auditiva (estímulos auditivos e tempo de entrega estímulo) no software de apresentação. Este protocolo consiste de uma seqüência de comandos - para o início de estímulos auditivos específicos - que são executadas em um número específico de digitalização. Em cada repetição na sequência fMRI, o software do scanner irá enviar um gatilho para o software de apresentação auditiva que por sua vez registra o número de varredura e executa o comando correspondente.
5. Para garantir que o software de apresentação auditiva não perder qualquer gatilho do leitor, o protocolo auditivo é iniciada em primeiro lugar. Uma vez que o protocolo é completamente carregado, a sequência de ressonância magnética é iniciado.
6. Cada experimento RMf é precedida pela aquisição de 12 imagens falsas para permitir que o sinal atribuído ao ruído scanner para alcançar um estado estável antes de iniciar a estimulação auditiva.
7. Após a aquisição de zero preencher os dados a 64 x 64.
8. Dê uma primeira olhada (preliminar) com os resultados utilizando a ferramenta funcional de paravisão (opção de processamento / Imagem Funcional). Calcule a resposta BOLD diferencial entre todos em blocos ea linha de base (OFF blocos). Esta análise dá uma primeira indicação da qualidade da experiência. Se nenhuma ativação é visto nas áreas auditivas primárias nesta fase, o pássaro provavelmente não ouviu / processados ​​os estímulos auditivos, devido a problemas técnicos com a apresentação do estímulo, o nível de anestesia, etc A instalação deverá ser verificada e medida repetida.
9. Executar uma seqüência T2 RARE 3D anatômica com a mesma orientação quanto aos exames de ressonância magnética anteriores e com TE eficaz: 60 ms, TR: 2000 ms, fato raro: 8, FOV: 16 mm, o tamanho da matriz: 256 x 128 x 64.
10. Zero-preencher os dados a 256 x 256 x 256.
11. Leve o tentilhão da cama MRI e deixá-lo recuperar da anestesia em uma gaiola sob uma lâmpada vermelha. Normalmente, a recuperação de uma Finch zebra após anestesia com isoflurano vai relativamente rápido (máximo 5 minutos). Depois de apenas alguns minutos, os pássaros vão tentar levantar-se e uma vez que a ave está totalmente recuperado, ele vai pousar em um ramo em vez de sentar no fundo da gaiola. A duração da anestesia é de cerca de 2 horas para o presente experimento. O tempo máximo de isoflurano anestesia aplicada a tentilhões-zebra em nosso laboratório é de 6 horas, após o que as aves também se recuperou dentro de 5 min.

4. Informática

1. Converta o MR-dados para analisar ou formato Nifti.
2. Porque SPM foi desenvolvido para processar os dados de ressonância magnética adquiridos nos seres humanos, isto é, para os voxels de cerca de 2 mm. Inúmeras definições SPM são adaptados a este tamanho aproximado voxel. Se a pessoa não faz wformiga para mudar todas as configurações, a maneira mais simples de proceder é aumentar artificialmente o tamanho do voxel dos dados de fMRI de aves. Ajuste o tamanho do voxel no cabeçalho multiplicando o tamanho real, voxel por 10 usando MRIcro. Deve notar-se, que este ajustamento não influencia os dados em si, não reamostragem ou quaisquer outras modificações que os dados são aplicados.

Uma alternativa para isso é o uso da 'SPMMouse ", que é um conjunto de ferramentas que permite SPM para abrir e analisar arquivos de qualquer dimensão do voxel. A ferramenta permite que os 'cérebros' SPM vidro a ser criado a partir de qualquer imagem, e ajusta automaticamente os padrões de escalas de comprimento com base nos cabeçalhos de arquivos de imagem ou dados introduzidos pelo utilizador. Assim, este toolbox funciona da maneira oposta do que aquilo que nos propomos. Em vez de mudar o tamanho do voxel das imagens para caber no SPM, as configurações padrão do SPM são alteradas para usar imagens com diferentes tamanhos de voxel.

3. Realinhar os dados de fMRI. Co-registrar o conjunto de dados 3D anatômico de tele séries temporais fMRI. Normalizar os dados em 3D (e da série co-registrada tempo fMRI) para o tentilhão cérebro MRI atlas. Aplicar a matriz de transformação para o conjunto de dados de fMRI. Isso tudo pode ser feito utilizando o Statistical Parametric Mapping (SPM) software 8.
4. Suavizar os dados com uma largura do kernel Gaussian 0,5 mm usando SPM8.
5. Realizar análises baseadas em voxel estatísticos utilizando SPM8. Modelo os dados como um carro de caixa (sem função resposta hemodinâmica). Estimar os parâmetros do modelo com o algoritmo da máxima verossimilhança restrita clássico. Calcular o efeito médio de cada estímulo auditivo em cada disciplina (análise de efeito fixo) e, em seguida, calcular estatísticas como desejava para análises de grupo (análise de efeito misto).
6. Projetar o mapa estatístico paramétrico para o tentilhão atlas (Figura 5) ⁹ em SPM8 para localizar as ativações funcionais (Figura 6).

Nós aqui apresentada visualmente uma sequência otimizada de procedimentos para a imagem de sucesso de substratos neurais dos estímulos auditivos na finch cérebro zebra. Em primeiro lugar, o procedimento descrito para a preparação dos estímulos auditivos em resultados de estímulos que podem ser incorporados num ON / OFF paradigma bloco (Figura 2) e que são normalizados para eliminar possíveis diferenças no nível de pressão de som que pode evocar uma resposta diferencial no cérebro . Depois de preparar o tentilhão para MRI digitalização e posicionando-o para dentro do orifício do íman (Figura 1), ressonância magnética pode ser adquirido. Além disso, uma imagem de alta resolução 3D é tomada a fim de normalizar os dados para o tentilhão atlas ^9. Finalmente, a análise de pré-processamento e estatística dos dados permite a visualização dos resultados obtidos (Figura 6).

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Figura 1. Espectrogramas de ruído branco registrados no fim de estabelecer faixas de freqüência que são reforçadas / reprimida dentro do magneto. A. O ruído branco fora do magneto. B. O ruído branco gravado no local da cabeça da ave dentro do magneto. C. Branco ruído após a aplicação da função de equalizador para corrigir melhorados / suprimida bandas de frequência.

Figura 2. Visão geral do ON / OFF paradigma bloco em que os períodos de estimulação auditiva são alternadas com períodos de descanso. Cada bloco (estímulo / descanso) dura 16 segundos, durante o qual duas imagens são adquiridas. Os diferentes estímulos consistem de motivos representativos de pássaros ou outros tipos de somdependendo da experiência. Estes motivos são concatenadas e intercalados com períodos de silêncio e a duração dos períodos silenciosos é ajustado para manter a quantidade total de som e silêncio idênticas para todos os estímulos.

Figura 3. . Setup para fMRI auditiva em pequenos pássaros canoros A. cama animal Inset:. Visão esquemática detalhada do posicionamento da ave no leito animais do scanner: B. bobina de cabeça RF, C. máscara de Bico com D. fornecimento de gás anestésico, E. fones de ouvido não-magnéticos, F. sensores travesseiro pneumático para monitorar a taxa de respiração, sonda de temperatura cloacal G., H. feedback do sistema de aquecimento controlado para manter o corpotemperatura da ave estável durante a medição. Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 4. Geometria fatia para imagens fMRI do cérebro inteiro. Composição de imagens editor de geometria em software paravisão. Anteriormente adquiridos axiais, imagens de pilotagem RARAS sagital e coronal são usados ​​para definir a orientação da fatia para a fMRI.

Figura 5. Vista lateral de uma representação 3D do hemisfério esquerdo com estruturas delineadas a partir do tentilhão atlas ^9, projetada em sua fatia médio-sagital. O código de cores dos núcleos delineado é apresentado à direita. Estes delineated estruturas fazem parte da via motora vocal: HVC, núcleo robustus arcopallii (AR), nXII pars tracheosyringealis (nXIIts), a caminho do cérebro anterior anterior: núcleo lateral magnocelular pars lateralis (LMAN), área de X (X), o sistema auditivo: campo L, núcleo ovoidalis (Ov), núcleo mesencephalicus lateral pars dorsalis (DLM), o sistema olfativo: bulbo olfatório (OB) e do sistema visual: núcleo entopalliallis (E), tectum Opticum (TEO).

Figura 6. Exemplo de uma resposta BOLD fMRI na região primária auditiva, Campo L, e nas regiões auditivas secundárias adjacentes evocadas por diferentes estímulos auditivos em relação à condição de repouso. As imagens consistem em mapas estatísticos paramétricos sobrepostas em imagens anatômicas de alta resolução do cérebro zebra finch atlas ^9. T-valores são codificados por cores de acordo com aescala indicado na figura e na qual apenas os voxels foi encontrado o t-teste a ser significativo (p <0,001) são exibidos.

Neste relatório, nós descrevemos um protocolo otimizado para o detalhado na caracterização vivo de substratos neurais da estimulação auditiva em tentilhões-zebra anestesiados.

Em consonância com o protocolo apresentado, a maioria dos estudos de ativação cerebral funcionais em animais utilizando fMRI BOLD, anestesiar os animais durante a aquisição. Treinar animais para acostumá-los ao ambiente ímã eo ruído do scanner durante os períodos de estudo também é possível, mas bastante demorado e desafiador e, portanto, raramente empregada.

Apesar de a anestesia minimiza os efeitos induzidos por estresse nas respostas fisiológicas de interesse e facilita o manuseio do animal, o seu efeito tanto na resposta neural e sobre a função de transferência entre a atividade neural ea resposta BOLD medido em fMRI é um tópico de pesquisa on-going e importante . Portanto, os efeitos da anestesia na resposta NEGRITO durante audestimulação itory em tentilhões-zebra foram investigados em nosso laboratório ^2. Assim, três anestésicos utilizados na zebra tentilhões - medetomodine, isoflurano e uretano - atuando em diferentes sistemas de neurotransmissores, foram estudados. Os resultados indicaram que a estimulação auditiva resultou em respostas claras NEGRITO com todos os três tipos de anestésicos, mas que as diferenças ligeiras ocorreu entre os três reagentes, por exemplo, em relação à extensão do espaço de activação. Com base nos resultados deste estudo, e no facto de que a anestesia de isoflurano é mais comum em aplicações clínicas, uma vez que tem a grande vantagem de ter a recuperação relativamente rápida e menores efeitos secundários e, portanto, tem o maior potencial para a utilização em estudos longitudinais, tornou-se isoflurano o anestésico de escolha para tentilhão fMRI em nosso laboratório.

Neste protocolo, usamos spin-echo (SE) fMRI em vez do (GE) fMRI gradiente-eco mais tradicional. Comparado a GE fMRI, SE fMRI tema grande vantagem de fornecimento de sinal a todo o cérebro, como não existe qualquer queda de sinal nas imagens. Outra vantagem do SE BOLD fMRI é a sua especificidade melhor espacial ^10,11. Com efeito, no campo magnético elevado, o componente do sinal intravascular NEGRITO SE é reduzida (devido a um longo TE) e o componente extravascular de vasos grandes é suprimida (por 180 ° reorientação da sequência de impulsos de MRI SE). O sinal BOLD SE é, assim, dominada por um sinal extravascular preciso provenientes de pequenos vasos ^12-14. A principal limitação do SE fMRI é a sua sensibilidade relativamente fraco, exigindo seqüências otimizadas e paradigmas de estimulação otimizados. O contraste com o ruído (CNR) aumenta com a intensidade do campo ^15. Um longo período de TE também aumenta o CNR, mas compromete a relação sinal-para-ruído ^12,13,15. O ideal TE corresponde geralmente a um tempo igual ou maior do que o valor de T ₂ dos tecidos. Nós mostramos que, em T7,um valor de TE de 60 milisegundos fornece um RNC e uma relação sinal-para-ruído suficiente para detectar diferenças significativas nas respostas desencadeadas pelo NEGRITO diferentes estímulos (Poirier, 2010).

Comparado a GE T2 * ponderada contraste, SE contraste T2 exige um longo TR (1.500-2.000 ms em 7T). Para ser capaz de imagem de 15 fatias, foi utilizada uma TR de 2.000 ms. Para manter o tempo de aquisição de um limite razoável, as seqüências de ressonância magnética SE precisa ser acelerado. Isso geralmente é conseguido usando o echo planar imaging (EPI) esquema de amostragem ^10,16-19. No entanto, o EPI induz distorções de imagem que aumentam a magnitude do campo magnético, e contamina o sinal Negrito com T2 * efeitos (tornando o sinal mais forte, mas menos específico). EPI também produz um ruído acústico muito intensa, tornando-o menos relevante para a utilização na investigação de estímulos auditivos. Temos, assim, utilizada uma sequência rara com um tamanho de matriz de 64 x 32, o que resultou num tempo de aquisição de 8 s. Este resolut temporaision ainda é compatível com a resposta BOLD lento induzida pelo delineamento em blocos, mas muito lento para provar precisamente o curso do tempo da resposta BOLD ou usar projetos relacionados ao evento. Com esta sequência, que assim obteve um sinal SE T2 puro, que é caracterizada por uma muito boa especificidade espacial, uma sensibilidade suficientemente elevada para detectar respostas diferenciais corajosa e uma resolução temporal compatível com o paradigma estímulo utilizado ^20,21.

Vantagens e limitações do uso de fMRI em aves canoras

Durante as últimas décadas, fMRI tornou-se uma das mais populares técnicas de neuroimagem em clínica neurociência cognitiva para o estudo da atividade cerebral durante várias tarefas que vão desde simples sensório-motor para tarefas altamente cognitivas. Na pesquisa pré-clínica, este método é, no entanto, ainda só raramente usado. A escassez de experiências de ressonância magnética concluída em pequenos animais e, particularmente, aves canoras, até à data, possivelmenterelaciona-se com o facto de que a anestesia ou sedação é necessária para conseguir a imobilização completa dos sujeitos (ver discussão acima). Portanto, esta é considerada a principal desvantagem da técnica e restringe o tipo de questões que podem ser abordadas. No entanto, apesar de fMRI requer anestesia eo sinal BOLD reflete, principalmente, os potenciais de campo locais e, portanto, difere dos potenciais de ação medidos no gene precoce eletrofisiológico e imediata (IEG) estudos (por exemplo ^22), fMRI BOLD confirmou muitos resultados obtidos por estas técnicas.

Até à data, as técnicas mais populares songbird neurociência ainda são expressão dependente da atividade de gravações IEG e eletrofisiológico da atividade única ou multi-unidade. Estas técnicas de beneficiar de uma resolução espacial muito elevada (5-30 mM; nível celular). No entanto, eles são altamente invasivo ou mesmo letais. Além disso, as técnicas electrofisiológicas se limitam ao número de locatiões que podem ser amostradas em uma experiência e, consequentemente, exige uma hipóteses a priori sobre a localização do substrato neuronal envolvida no processo investigado. Em contraste, RMf NEGRITO permite uma abordagem de todo o cérebro - com uma resolução espacial de 250 um - e assim pode ser usada para efectuar experiências pressuposto-livres. Finalmente, e mais importante, a não-invasivo de ressonância magnética permite medidas longitudinais repetidas sobre os mesmos assuntos, o que abre um grande leque de novas possibilidades.

Não há conflitos de interesse declarados.

Esta pesquisa foi apoiada por doações da Fundação de Pesquisa - Flandres (FWO, projeto Nr G.0420.02 e G.0443.11N), a Fundação Hercules (concessão Nr AUHA0012), concertadas Acções de Investigação (GOA financiamento) da Universidade de Antuérpia, e parcialmente patrocinado pela EC - FP6 projeto Dimi, LSHB-CT-2005-512146 e EC - FP6 projeto EMIL LSHC-CT-2004-503569 para A.VdL. G.DG e CP são bolsistas de pós-doutorado da Fundação de Pesquisa - Flandres (FWO).