Imagerie par résonance magnétique (IRMf) avec une stimulation auditive chez les oiseaux chanteurs

Cet article montre une procédure optimisée pour l'imagerie des substrats neuronaux de la stimulation auditive dans le cerveau des oiseaux chanteurs en utilisant l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf). Il décrit la préparation des stimuli sonores, le positionnement du sujet et de l'acquisition et de l'analyse ultérieure des données d'IRMf.

La neurobiologie de chants d'oiseaux, comme un modèle pour la parole humaine, est une zone marquée de la recherche en neurosciences comportementales. Alors que les approches électrophysiologiques et moléculaires permettent l'enquête soit de différents stimuli sur quelques neurones, ou une relance dans de grandes parties du cerveau, le niveau d'oxygénation du sang (BOLD) d'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) permet de combiner les deux avantages, à savoir comparer l'activation des neurones induite par différents stimuli dans l'ensemble du cerveau à la fois. IRMf chez les oiseaux chanteurs est difficile en raison de la petite taille de leur cerveau et parce que leurs os et surtout de leur crâne comporte de nombreuses cavités d'air, ce qui induit des artefacts de susceptibilité importants. En écho de gradient (GE) IRMf BOLD a été appliquée avec succès pour les oiseaux chanteurs ^1-5 (pour une revue, voir ^6). Ces études ont porté sur les zones du cerveau auditifs primaires et secondaires, qui sont des régions exemptes d'artéfacts de susceptibilité. Toutefois, en raison processes d'intérêts peuvent survenir au-delà de ces régions, tout le cerveau IRMf BOLD est nécessaire en utilisant une séquence IRM moins sensibles à ces objets. Ceci peut être réalisé à l'aide d'écho de spin (SE) BOLD IRMf ^7,8. Dans cet article, nous décrivons comment utiliser cette technique dans les diamants mandarins (Taeniopygia guttata), qui sont de petits oiseaux chanteurs avec un poids de 15-25 g d'études approfondies en neurosciences comportementales des oiseaux. Le thème principal des études IRMf sur les oiseaux chanteurs est la perception de la chanson et de l'apprentissage du chant. La nature auditive des stimuli associés à la faible sensibilité BOLD de SE (contre GE) séquences IRMf base rend la mise en œuvre de cette technique très difficile.

1. Préparation des stimuli auditifs

1. D'abord enregistrer les sons stimuli tout en étant joué à l'intérieur de l'alésage du système MR 7T. L'alésage est un espace clos qui peut fausser les stimuli auditifs résultant dans l'amélioration de certaines fréquences sonores. Figure 1 montre les fréquences améliorées et supprimé comme indiqué par nos enregistrements de bruit blanc fait à l'endroit de la tête de l'oiseau à l'intérieur de l'aimant portaient l'aide d'un microphone à fibre optique (Optimic 1160, Optoacoustics). Pour compenser cette augmentation artificielle, une fonction égaliseur est appliqué à chaque stimulus en utilisant le logiciel WaveLab. Pour notre configuration particulière, la fonction se compose d'un noyau gaussien avec les paramètres suivants: amplitude maximale:-20dB, centré sur 3750 Hz, largeur: 0,05 octaves (correspondant à la gamme 2,500-5,000 Hz pour notre système).
2. Les stimuli de morceaux sont composés de plusieurs motifs de morceaux individuels de chaque oiseau entrelacés avec des périodes de silence. Le duration de ces périodes de silence est ajustée pour maintenir la quantité totale de bruit et de silence identique sur tous les stimuli. Ce bâtiment conserve la variabilité intra-individuelle et interindividuelle naturel de la longueur du morceau. La longueur totale de chaque stimulus est de 16 sec. L'intensité de chaque chanson est normalisée en termes de apparié racine carrée moyenne et passe-haut filtré à 400 Hz avant d'être intégré dans la relance complète (chant et périodes de silence). Ces manipulations sont effectuées en utilisant le logiciel Praat.
3. L'expérience se compose d'un ON / OFF conception alternant périodes de stimulation auditive de blocs (ON blocs) avec des périodes de repos (OFF blocs) (Figure 2). Chaque bloc (ON et OFF) dure 16 s, ce qui correspond au temps d'acquisition de deux images (voir ci-dessous pour l'acquisition). Chaque type de stimulus est présenté 25 fois, ce qui entraîne l'acquisition de 50 images par stimulus et par sujet. L'ordre de présentation des conditions doit être randomisés au sein et entresujets. Cet ordre aléatoire des stimuli peut être codée dans un logiciel de présentation.

2. Préparation sujet

2.1 Objet et taille du groupe

Nous présentons ici un protocole spécifiquement adapté à l'utilisation de (adultes) les diamants mandarins. Le choix de l'espèce dépend de la question scientifique. Cependant, d'autres considérations comme l'oiseau robustesse à l'anesthésie peuvent également être prises en compte. Les diamants mandarins (Taeniopygia guttata) devraient être logés dans des volières sous une lumière 12 h: photopériode de 12 heures sombres et avoir accès à la nourriture et de l'eau ad libitum pendant toute l'étude. Le nombre minimum d'individus par expérience est de 15. Ce chiffre tient compte de la sensibilité de l'IRMf spin-écho et le naturel variabilité inter-individuelle des phénomènes biologiques mesurés dans l'expérience.

2.2 Installation de la configuration et de la préparation de l'animal

(Pour les spécificationsde l'équipement utilisé, nous nous référons à la liste des réactifs et du matériel spécifique à la fin de cet article)

1. Installer le masque de bec sur le lit d'un système d'IRM 7T MR et le connecter à l'appareil de commande de gaz avec des tubes en plastique. Ouvrez l'oxygène et les bouteilles de gaz d'azote et l'interrupteur sur le dispositif de commande des gaz (oxygène de débit: 200 cc / min; azote: 400 cc / min).

Comme mentionné ci-dessus, un système MR 7T est utilisé dans la configuration présentée. D'autres systèmes IRM avec différentes intensités de champ sont également possibles, mais à 7T un bon compromis est atteint entre le rapport signal-sur-bruit et le degré d'artefacts de susceptibilité (voir discussion). Pour des intensités de champ supérieures du rapport signal à bruit augmente en même temps que le degré d'artéfacts de susceptibilité.

2. Mettez le système contrôlé de rétroaction et un dispositif de circulation d'air chaud.
3. Anesthésier le diamant mandarin avec 3% d'isoflurane dans un mélange d'oxygène et d'azote en introduisant son becdans le masque et tenant la tête vers le bas jusqu'à ce que l'oiseau est totalement anesthésié. Cela peut être vérifié en tirant le pied doucement: quand l'oiseau est entièrement sous sédation pied ne sera pas escamoté par l'oiseau. En outre, aux yeux de l'oiseau seront partiellement fermés.
4. Introduire la sonde de température du cloaque pour cribler la température du corps et de surveiller le taux de respiration en plaçant un capteur pneumatique sous le pinson ventre zèbre. Fermer l'enveloppe pour retenir le corps de l'oiseau (figure 3).
5. Maintenir le taux de respiration dans la plage de 40 à 100 respirations par minute et maintenir constante la température du corps au sein d'une gamme étroite de 40 ± 0,5 ° C. Lorsque la plage de la respiration est trop faible / élevé, réglez le niveau de l'anesthésie (isoflurane%) en conséquence. Quand le problème persiste, l'expérience doit être arrêté et l'animal retiré de la configuration afin de récupérer.
6. Placez les haut-parleurs dynamiques non-magnétiques de chaque côté de la tête diamant mandarin et conbrancher à l'amplificateur. Assurez-vous que les fils des haut-parleurs sont dirigés loin de la sonde de température, car elle peut influencer la lecture de la température lorsque trop près.
7. Placez la bobine RF de surface au-dessus de la tête de diamant mandarin et la position du diamant mandarin dans le centre de l'aimant (et automatiquement le centre de la bobine d'émission qui se situe dans le milieu de l'aimant).
8. Réduire le niveau d'anesthésie à 1,5% d'isoflurane mélangé avec de l'oxygène et de l'azote.

3. Acquisition de données

1. Acquérir un ensemble de 1 sagittal, 1 horizontal et 1 image scout coronale en écho de gradient (GE) (séquence tri-pilote) et des ensembles d'images multi-coupes horizontales, frontal et sagittal (pilotage T _2-pondéré rapide acquisition relaxation-enhanced ( RARE) séquence SE) pour déterminer la position du cerveau dans l'aimant (figure 4).
2. Diminuer le bruit des gradients en augmentant leur temps de rampe à 1.000 ms.
3. Préparer la séquence IRMf: RARE T de la séquence _2-pondéré, efficace TE: 60 ms, TR: 2,000 ms, facteur RARE: 8, FOV: 16 mm, taille de la matrice: 64 x 32, orientation: sagittal, l'épaisseur de la tranche: 0,75 mm, Inter-tranche épaisseur d'espace: 0,05 mm, 15 tranches couvrant presque la totalité du cerveau (Figure 4).
4. Sélectionnez le protocole auditif (des stimuli auditifs et le calendrier de livraison de relance) dans le logiciel de présentation. Ce protocole consiste en une séquence de commandes - pour l'ouverture de stimuli auditifs spécifiques - qui sont exécutées lors d'une numérisation nombre spécifique. A chaque répétition à l'intérieur de la séquence IRMf, le logiciel du scanner envoie un déclencheur pour le logiciel de présentation des informations auditives qui à son tour, enregistre le nombre de balayage et exécute la commande correspondante.
5. Afin de s'assurer que le logiciel de présentation des informations auditives ne manque pas de déclenchement du scanner, le protocole auditif est lancé en premier. Une fois le protocole est complètement chargée, la séquence IRMf est démarré.
6. Chaque expérience IRMf est précédée par l'acquisition de 12 images factices pour permettre au signal attribué au bruit du scanner pour atteindre un état stable avant de commencer la stimulation auditive.
7. Après l'acquisition zéro remplir les données de 64 x 64.
8. Jetez un premier coup d'oeil (préliminaire) sur les résultats à l'aide de l'outil fonctionnel de Paravision (option Traitement / imagerie fonctionnelle). Calculer la réponse BOLD différentiel entre tous sur des blocs et la base (rabais blocs). Cette analyse donne une première indication de la qualité de l'expérience. Si aucune activation se voit dans les aires auditives primaires, à ce stade, l'oiseau n'a probablement pas entendu / traitement des stimuli auditifs dus à des problèmes techniques avec la présentation de relance, le niveau d'anesthésie, etc L'installation doit être vérifiée et la mesure répétée.
9. Exécuter une séquence RARE 3D anatomique pondérée en T2 dans la même orientation que les scans IRMf précédentes et avec TE efficace: 60 ms, TR: 2,000 ms, facteur RARE: 8, FOV: 16 mm, taille de la matrice: 256 x 128 x 64.
10. Compléter par des zéros les données de 256 x 256 x 256.
11. Prenez le diamant mandarin du lit IRM et laissez-le se remettre de l'anesthésie dans une cage sous une lampe rouge. Normalement, la récupération d'un diamant mandarin après l'isoflurane va relativement rapide (maximum 5 min). Après seulement quelques minutes, les oiseaux vont essayer de se lever et une fois que l'oiseau est complètement rétabli, il se percher sur une branche au lieu de s'asseoir sur le fond de la cage. La durée de l'anesthésie est d'environ 2 h pour la présente expérience. La durée maximale de l'isoflurane appliqué aux diamants mandarins dans notre laboratoire est de 6 heures, après quoi les oiseaux ont également récupéré dans les 5 min.

4. Traitement des données

1. Convertir le-MR données dans Analyser ou le format Nifti.
2. Parce que SPM a été développé pour traiter les données d'IRMf acquises chez l'homme, c'est-à voxels de l'ordre de 2 mm. De nombreux paramètres de SPM sont adaptées à cette taille approximative de voxel. Si l'on ne want de changer tous ces paramètres, la façon la plus simple de procéder consiste à augmenter artificiellement la taille de voxel de données d'IRMf d'oiseaux. Ajustez la taille de voxel dans l'en-tête en multipliant la taille de voxel réel par 10 en utilisant MRIcro. Il convient de noter que cet ajustement ne modifie pas les données en soi, ré-échantillonnage ou d'autres modifications aux données est appliquée.

Une alternative à cela est l'utilisation de «SPMMouse», qui est une boîte à outils permettant SPM pour ouvrir et analyser les fichiers de toute dimension voxel. L'outil permet de «cerveaux de verre» SPM être créés à partir de n'importe quelle image et ajuste automatiquement par défaut des échelles de longueur basé sur les en-têtes de fichiers image ou des données entrées par l'utilisateur. Par conséquent, cette boîte à outils fonctionne dans le sens inverse de ce que nous proposons. Au lieu de changer la taille de voxel des images pour s'adapter à SPM, les paramètres par défaut du SPM sont modifiés pour utiliser des images avec différentes tailles de voxel.

3. Réaligner les données d'IRMf. Co-enregistrer le jeu de données 3D anatomique til séries chronologiques IRMf. Normaliser les données 3D (et la série co-recommandé temps IRMf) pour le diamant mandarin IRM cérébrale atlas. Appliquer la matrice de transformation de l'ensemble de données IRMf. Tout cela peut être fait en utilisant la cartographie statistique paramétrique (SPM) du logiciel 8.
4. Lisser les données avec une largeur noyau gaussien de 0,5 mm en utilisant SPM8.
5. Effectuer des analyses statistiques voxel en utilisant SPM8. Modéliser les données sous forme de box-car (pas de fonction de réponse hémodynamique). Estimer les paramètres du modèle avec l'algorithme de maximum de vraisemblance restreint classique. Calculer l'effet moyen de chaque stimulus auditif dans chaque matière (analyse des effets fixes), puis calculer les statistiques comme souhaité pour des analyses de groupe (analyses à effets mixtes).
6. Projeter la carte paramétrique statistique sur le diamant mandarin atlas (Figure 5) ⁹ SPM8 pour localiser les activations fonctionnelles (figure 6).

Nous avons ici présentés visuellement une séquence optimisée des procédures pour l'imagerie réussie de substrats neuronaux de stimuli auditifs chez le pinson cerveau zèbre. Tout d'abord, la procédure décrite pour la préparation des stimuli auditifs résultats de stimuli qui peut être incorporé dans un ON / OFF paradigme de bloc (Figure 2) et qui sont normalisés afin d'éliminer les différences potentielles dans le niveau de pression acoustique qui pourrait évoquer une réponse différentielle dans le cerveau . Après avoir préparé le diamant mandarin pour l'IRM et le positionner dans l'alésage de l'aimant (figure 1), l'IRMf peut être acquise. En outre, une image 3D de haute résolution est prise afin de normaliser les données de l'atlas diamant mandarin ^9. Enfin, l'analyse de pré-traitement et statistique des données permet de visualiser les résultats obtenus (Figure 6).

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Figure 1. Spectrogrammes de bruit blanc enregistrées dans l'ordre d'établir des bandes de fréquences qui sont améliorées / supprimées au sein de l'aimant portait. A. White bruit extérieur de l'aimant portait. B. Le bruit blanc enregistré à l'emplacement de la tête de l'oiseau à l'intérieur de l'aimant portait. C. White bruit après l'application de la fonction d'égaliseur pour corriger améliorées / suppression des bandes de fréquences.

Figure 2. Vue d'ensemble de la touche ON / OFF paradigme du bloc dans lequel les périodes de stimulation auditives sont alternées avec des périodes de repos. Chaque bloc (stimulus / repos) dure 16 secondes au cours de laquelle 2 images sont acquises. Les différents stimuli sont constitués de motifs représentatifs du chant des oiseaux ou d'autres types de sonsen fonction de l'expérience. Ces motifs sont enchaînés et entrelacées avec des périodes de silence et la durée des périodes de silence est ajustée pour maintenir le montant total de son et le silence identique sur tous les stimuli.

Figure 3. . Configuration pour IRMf auditif en petits chanteurs A. lit animale médaillon:. Aperçu schématique détaillée du positionnement de l'oiseau dans le lit des animaux du scanner: B. bobine de la tête RF, C. masque de bec avec D. fourniture de gaz anesthésique, écouteurs non magnétiques E., F. Capteur de coussin pneumatique pour surveiller la vitesse de respiration, G. sonde de température du cloaque, le système de chauffage régulé de rétroaction pour maintenir le corps H.température de l'écurie d'oiseaux pendant la mesure. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 4. la géométrie de la tranche d'imagerie IRMf du cerveau entier. Composition des captures d'écran de l'éditeur de géométrie dans le logiciel ParaVision. Axiaux, images pilotage RARE sagittale et coronale précédemment acquises sont utilisées pour définir l'orientation de la tranche pour l'analyse IRMf.

Figure 5. Vue latérale d'une représentation en 3D de l'hémisphère gauche avec des structures délimitées du diamant mandarin atlas ^9, projetée sur sa tranche sagittale médiane. Le code de couleur des noyaux délimitée est présenté sur la droite. Ces delineatstructures ed font partie de la voie de moteur vocal: HVC, le noyau robustus arcopallii (RA), NXII pars tracheosyringealis (nXIIts); la voie du cerveau antérieur antérieur: noyau lateralis magnocellularis pars lateralis (LMAN), la zone X (X), le système auditif: champ L, noyau ovoidalis (Ov), noyau mesencephalicus lateralis pars dorsalis (MLD), le système olfactif: bulbe olfactif (OB) et le système visuel: noyau entopalliallis (E), tectum opticum (TeO).

Figure 6. Exemple d'une réponse GRAS IRMf dans la région primaire auditif, Champ L et régions auditives secondaires adjacents évoqués par différents stimuli auditifs par rapport à l'état de repos. Les images sont constituées de cartes paramétriques statistiques superposées sur les images anatomiques à haute résolution à partir de l'Finch cerveau zèbre atlas ^9. T-valeurs sont codés par couleur en fonction de laéchelle affichée dans la figure et que voxels dans lequel le t-test a été jugée significative (p <0,001) sont affichés.

Dans ce rapport, nous décrivons un protocole optimisé pour la fiche détaillée de la caractérisation in vivo des substrats neuronaux de la stimulation auditive en diamants mandarins anesthésiés.

En accord avec le protocole présenté, la majorité des études d'activation cérébrale fonctionnelle chez les animaux à l'aide de l'IRMf BOLD, anesthésier les animaux lors de l'acquisition. animaux de formation pour les habituer à l'environnement de l'aimant et le bruit du scanner pendant les périodes d'études est également possible, mais plutôt fastidieux et difficile, et donc rarement employée.

Bien que l'anesthésie minimise les effets induits par le stress sur les réactions physiologiques d'intérêt et facilite la manipulation des animaux, son effet tant sur la réponse neuronale et sur la fonction de transfert entre l'activité neuronale et la réponse BOLD mesurée en IRMf est un sujet de recherche en cours et importante . Par conséquent, les effets de l'anesthésie sur la réponse BOLD lors audstimulation itory en diamants mandarins ont été étudiés dans notre laboratoire ^2. En conséquence, trois anesthésiques largement utilisés dans les diamants mandarins - medetomodine, l'isoflurane et l'uréthane - agissant sur les différents systèmes de neurotransmetteurs, ont été étudiés. Les résultats indiquent que la stimulation auditive a abouti à des réponses claires BOLD avec les trois anesthésiques, mais que de légères différences ont eu lieu entre les trois réactifs par rapport à par exemple l'extension de la zone d'activation. Sur la base des résultats de cette étude et sur le fait que l'isoflurane est l'anesthésique le plus courant dans les applications cliniques, il a le grand avantage d'avoir reprise relativement rapide et des effets secondaires mineurs et a donc le plus grand potentiel pour une utilisation dans des études longitudinales, l'isoflurane est devenu l'anesthésique de choix pour zebra finch IRMf dans notre laboratoire.

Dans ce protocole, nous utilisons écho de spin (SE) IRMf au lieu de l'écho de gradient (GE) IRMf plus traditionnelle. Par rapport à GE IRMf, SE IRMf ale grand avantage de fournir des signaux de l'ensemble du cerveau comme il n'ya pas de perte de signal dans les images. Un autre avantage de SE BOLD IRMf est sa spécificité mieux spatial ^10,11. En effet, à champ magnétique élevé, la composante du signal intravasculaire GRAS SE est réduite (à cause d'une longue TE) et de la composante extra-vasculaire de gros vaisseaux est supprimée (par l'impulsion de refocalisation à 180 ° de la séquence IRM SE). Le signal BOLD SE est donc dominée par un signal extravascular précis provenant de petits bateaux ^12-14. La principale limitation de SE IRMf est sa sensibilité relativement faible, ce qui nécessite des séquences optimisées et des paradigmes de stimulation optimisés. Le contraste sur bruit (CNR) augmente avec l'intensité du champ ^15. Une longue TE augmente également le CNR, mais compromet le rapport signal-sur-bruit ^12,13,15. Le optimale TE correspond généralement à un temps égal ou supérieur à la valeur de T ₂ des tissus à. Nous avons montré que, à 7T,une valeur TE de 60 ms fournit un CN et un rapport signal à bruit suffisant pour détecter une différence significative dans les réponses GRAS déclenchées par différents stimuli (Poirier, 2010).

Par rapport à GE-T2 * revanche, SE contraste pondérée en T2 nécessite un long TR (1500-2000 msec à 7T). Pour être en mesure d'images 15 tranches, nous avons utilisé un TR de 2000 ms. Pour garder le temps d'acquisition à une limite raisonnable, des séquences IRM SE doivent être accélérés. Ceci est habituellement réalisé en utilisant le plan d'imagerie écho (PEV) de plan d'échantillonnage ^10,16-19. Cependant, EPI induit des distorsions d'image qui augmentent avec l'intensité du champ magnétique, et contamine le signal BOLD avec T2 * effets (rendant le signal le plus fort mais moins spécifique). EPI produit également un bruit acoustique très intense, ce qui rend moins pertinente pour une utilisation dans les enquêtes sur des stimuli auditifs. Nous avons donc utilisé une séquence RARE avec une taille de matrice de 64 x 32, ce qui a entraîné un temps d'acquisition de 8 sec. Cette résolut temporelleion est toujours compatible avec la réponse BOLD lent induit par des conceptions de bloc, mais trop lent pour échantillonner correctement l'évolution temporelle de la réponse BOLD ou à utiliser des modèles liés à l'événement. Avec cette séquence, on obtient ainsi un signal SE pondérée en T2 pure, qui se caractérise par une très bonne spécificité spatiale, une sensibilité suffisamment élevée pour détecter des réponses BOLD différentielles et une résolution temporelle compatible avec le paradigme de relance utilisé ^20,21.

Avantages et limites de l'utilisation de l'IRMf chez les oiseaux chanteurs

Durant les dernières décennies, l'IRMf est devenue l'une des techniques de neuro-imagerie les plus populaires dans les neurosciences cognitives cliniques pour l'étude de l'activité cérébrale au cours de diverses tâches allant du simple sensori-motrice à des tâches hautement cognitives. En recherche préclinique, cette méthode est, cependant, encore que rarement utilisé. La rareté des expériences IRMf achevée en petits animaux et en particulier les oiseaux chanteurs à ce jour, peut-êtretient au fait que l'anesthésie ou sédation est nécessaire pour parvenir à une immobilisation complète des sujets (voir ci-dessus). Par conséquent, cela est considéré comme le principal inconvénient de la technique et restreint le type de questions qui peuvent être abordées. Cependant, bien que l'IRMf nécessite une anesthésie et le signal BOLD reflète principalement les potentiels de champ locaux et donc diffère des potentiels d'action mesurés dans le gène précoce électrophysiologiques et immédiate (IEG) études ^(22), l'IRMf BOLD a confirmé de nombreux résultats obtenus par ces techniques.

À ce jour, les techniques les plus populaires dans Songbird neurosciences sont toujours l'expression dépendant de l'activité des enregistrements IEG et électrophysiologiques de l'activité mono-ou multi-unités. Ces techniques bénéficient d'une très haute résolution spatiale (5-30 um; niveau cellulaire). Cependant, ils sont très envahissante ou même mortels. En outre, des techniques électrophysiologiques sont limitées par le nombre de locations qui peuvent être échantillonnés dans une expérience et nécessitent donc une hypothèse a priori sur la localisation du substrat neuronal impliqué dans le processus d'une enquête. En revanche, l'IRMf BOLD permet une approche globale de cerveau - avec une résolution spatiale de 250 um - et peut donc être utilisé pour effectuer des expériences hypothèse libres. Enfin et surtout, la non-invasif de l'IRM permet des mesures longitudinales répétées sur les mêmes sujets, ce qui ouvre un large éventail de nouvelles possibilités.

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Cette recherche a été financée par des subventions de la Fondation de la recherche - Flandre (FWO, le projet Nr G.0420.02 et G.0443.11N), la Fondation Hercules (subvention Nr AUHA0012), Actions de Recherche Concertées (financement GOA) de l'Université d'Anvers, et en partie financé par la CE - projet FP6 DiMI, LSHB-CT-2005-512146 et CE - projet FP6 EMIL LSHC-CT-2004-503569 à A.VdL. G.DG et CP sont des boursiers postdoctoraux de la Fondation de la recherche - Flandre (FWO).