Preparação de fibrina Andaimes 3D para aplicações de cultura de células-tronco

Isso detalhes o trabalho de preparação de fibrina scaffolds 3D para cultura e diferenciação das células-tronco plutipotent. Tais suportes podem ser usados ​​para examinar os efeitos de vários compostos biológicos sobre o comportamento das células estaminais, bem como modificada para conter sistemas de entrega de drogas.

As células estaminais são encontrados em que ocorre naturalmente microambientes 3D in vivo, os quais são muitas vezes referida como a célula nicho haste ^1. A cultura de células-tronco dentro de 3D ​​biomaterial andaimes fornece uma maneira para exatidão imitar estes microambientes, proporcionando uma vantagem sobre os métodos tradicionais de cultura 2D usando poliestireno, bem como um método para tecidos de engenharia de substituição ^2. Enquanto polystrene cultura 2D tecido tem sido utilizada para a maioria das experiências de cultura de células, andaimes 3D biomaterial pode mais estreitamente replicar os microambientes encontrados in vivo, permitindo estabelecimento mais precisa da polaridade de células no meio ambiente e possuindo propriedades bioquímicas e mecânicas semelhantes a tecido mole. ³ A variedade de origem natural e andaimes biomaterial sintético têm sido investigados como ambientes 3D para apoiar o crescimento de células-tronco. Enquanto andaimes sintéticos podem ser sintetizados a ter uma maior range de propriedades mecânicas e químicas e muitas vezes têm uma maior reprodutibilidade, biomateriais naturais são frequentemente compostas de proteínas e polissacáridos encontrados na matriz extracelular e, como resultado contêm sítios de ligação para a adesão celular e prontamente suporte de cultura de células. Fibrina andaimes, produzido por polimerização do fibrinogénio proteína obtida a partir de plasma, têm sido amplamente investigados para uma variedade de aplicações de engenharia de tecidos tanto in vitro como in vivo ^4. Tais suportes pode ser modificada usando uma variedade de métodos para incorporar os sistemas de libertação controlada para a entrega de factores terapêuticos ^5. O trabalho anterior mostrou que andaimes tais pode ser utilizado com sucesso para a cultura de células estaminais embrionárias e este sistema de cultura de andaime baseado pode ser usado para examinar os efeitos de vários factores de crescimento sobre a diferenciação das células-tronco semeadas dentro ^6,7.

Este detalhes protocolo do processo de polymerizing de fibrina scaffolds a partir de soluções de fibrinogénio, usando a actividade enzimática da trombina. O processo leva 2 dias para se completar, incluindo um passo de diálise durante a noite para a solução de fibrinogénio para remover citratos que inibem a polimerização. Estes métodos detalhados contar com as concentrações de fibrinogênio determinados a ser o ideal para embrionário e induzida por cultura de células pluripotentes estaminais. Outros grupos têm investigado andaimes de fibrina para uma vasta gama de tipos de células e aplicações - demonstrando a versatilidade desta abordagem ^8-12.

Notas antes de iniciar o protocolo: O fibrinogênio é uma proteína derivada de sangue e treinamento de segurança, pois, adequado deve ser concluída antes do manuseio. Este protocolo requer 2 dias para ser concluído assim que o tempo das culturas-tronco desejadas de forma adequada para garantir que eles estão prontos para a semeadura. Em termos de cálculo quanto fibrinogénio a pesar, três pratos 35 mm de petri de solução salina tamponada com tris (TBS, pH 7,4) contendo 110-130 mg de fibrinogénio dissolvido em 3 mL de TBS será suficiente para produzir uma placa de 24 poços contendo 400 uL andaimes de fibrina em cada poço.

1. Dia: Fazendo soluções de fibrinogênio e diálise durante a noite

1. Tome fibrinogênio liofilizado da geladeira e deixe descansar por 20 minutos para permitir que a temperatura ambiente.
2. Adicionar 3 ml de solução salina tamponada com Tris (TBS) a cada placa de Petri de 35 mm. Cada placa de rendimentos de fibrinogénio 2-3 mL de solução de fibrinogénio variando em concentração de 12-20mg / mL e da quantidade total de fibrinogénio necessária pode ser calculada com base na estas aproximações.
3. Pesar cerca de 100-130 mg de fibrinogénio (Fg) e salpique para a superfície do presente TBS em cada prato. Espere 5 minutos para que o fibrinogénio para começar a entrar em solução. Cubra placa de Petri com tampa.
4. Pratos de Petri incubar a 37 ° C durante 2 horas para permitir que o fibrinogénio em totalmente ir para dentro da solução de TBS.
5. Tubo de diálise Wet (7000 MW cortado) com TBS. Extremidade inferior dobra da extremidade da tubagem e se fecham com uma braçadeira de diálise.
6. Pipetar as soluções de fibrinogénio a partir de pratos em tubo de diálise. Dobre extremidade superior e se fecham com uma braçadeira de diálise.
7. Tubo de diálise contendo o local de solução de fibrinogénio em um recipiente de 4 litros de TBS. Solução mistura usando placa de agitação definido para a baixa velocidade (100 rpm).
8. Dialisar solução durante a noite em agitar placa durante, pelo menos, 12 horas. A solução de TBS não precisa de ser alterada ao longo deste período de tempo.

2. Dia 2: Polimerização de andaimes de fibrina e semeadura de células estaminais em andaimes

Todos os passos descritos para este processo deve ser realizado em um capuz estéril de cultura de tecidos como estes suportes serão semeada com culturas de células estaminais.

1. Remover a solução de fibrinogénio a partir de tubo de diálise e coloque em um tubo de tamanho apropriado cónica (quer mL 15 ou 50 mL).
2. Solução de fibrinogénio filtro com um filtro de seringa de 5,0 mm a remover as impurezas grandes na solução. Dependendo do volume da solução, a utilização de filtros múltiplos pode ser necessário para processar a solução inteira.
3. Filtro estéril, a solução de fibrinogénio com um filtro de 0,22 um para um tubo de 50 mL cónico. Usando uma pipeta de tamanho adequado, determinar o volume da solução de fibrinogénio filtrou-se para uso posterior ao fazer cálculos. Dependendo do volume da solução, a utilização de filtros múltiplos pode ser necessário para processar a entsolução ira.
4. Medir a absorvância da solução de fibrinogénio a 280 nm utilizando o espectrofotómetro. Um factor de diluição de 50 vezes é necessário para obter uma absorvância inferior a 1.
5. Calcular a concentração de proteína presente na solução de fibrinogénio através da seguinte equação: [Fibrinogénio em mg / mL] = (A ₂₈₀ × factor de diluição) ÷ 1,55 1,55 onde é o coeficiente de extinção a ₂₈₀ A para o fibrinogénio humano ^13. Em seguida calcular a quantidade de TBS necessário para diluir a concentração da solução a 11,1 mg / mL de fibrinogénio com base no volume inicial. A concentração final de proteína na andaimes de fibrina será de 10 mg / mL, após a polimerização.
6. Obter trombina estéril e soluções de cloreto de cálcio. Em primeiro lugar, adicionar 15 uL solução de trombina (concentração: 40 U / mL - concentração final no andaime será de 2 U / mL) para o lado direito de cada poço na primeira linha da placa de 24 poços. Em seguida, adicionar 15 uL de 50 mM de cálcio chlsolução oride para o lado esquerdo de cada poço. Finalmente, adicionar 270 uL da solução de fibrinogénio ao prato. Agitar placa de lado a lado, seguido por agitação trás para a frente para assegurar a mistura de soluções.
7. Deixe a linha que contém as misturas polimerizar durante 5 minutos à temperatura ambiente. Os andaimes tornam-se mais opaca como polimerização.
8. Repetir os passos 2.6 e 2.7 até que o número desejado de andaimes de fibrina foram polimerizados.
9. Após a incubação último minuto 5, colocar as placas dentro de uma incubadora a 37 ° C para permitir a polimerização completa de andaimes.
10. Após a incubação de uma hora é completa, o próximo passo é a semente da andaime com corpos embrióides. Usando um 20 pipettemen microlitro, selecione um corpo embrióides individual e lugar no centro do andaime de fibrina. Verifique com microscópio que cada poço contenha um corpo único embrióides.
11. Adicionar 5 uL de solução de trombina (concentração: 40 U / mL) e 5 uL de 50 mM de cloreto de cálciosolução no topo de cada corpo embrióides seguido por 90 uL de solução de fibrinogénio a cada poço. A solução deve formar uma bolha encapsulando os corpos embrióides.
12. Colocar a placa de volta em 37 ° C incubadora durante uma hora adicional para assegurar a polimerização.
13. Após a incubação, adicionar 1 mL de meio de cultura de células apropriadas para cada placa bem e de volta para o local de 37 ° C incubadora.

3. Os resultados representativos

A Figura 1 mostra um diagrama esquemático do vista lateral de um indivíduo bem contendo o 3D fibrina sistema de cultura de andaime semeado com um corpo embrióides. Figura 2A mostra imagens representativas de rato células pluripotentes induzidas estaminais a ser cultivado em camadas alimentadoras de fibroblastos de rato embrionários. Estas células são então induzida a formar corpos embrióides, agregados de células que contenham progenitores neurais, utilizando um ácido retinóico 8 dias de tratamento protocolo (Figura 2B) como previously descrito ¹⁴ enquanto que a Figura 3 mostra o aspecto de um IPS-derivada corpo embrióides após 3 dias de cultura dentro de andaimes 3D de fibrina. Resultados semelhantes têm sido obtidos anteriormente usando células de ratinho estaminais embrionárias ^7. Além disso, este método tem sido utilizado para a cultura IPS-derivados corpos embrióides produzido usando um protocolo diferente envolvendo ácido retinóico e purmorphamine ¹⁵ dentro de andaimes 3D de fibrina, demonstrando a versatilidade da presente sistema de cultura.

Figura 1. Esquemático, mostrando a vista lateral de um indivíduo bem contendo um 3D fibrina andaime semeado com um corpo embrióides.

Figura 2. Rato tronco pluripotentes induzidas cultura de células (iPS) e diferenciação. Para diferenciar essas células em neurfenótipos al, as células iPS são cultivadas em suspensão para produzir agregados de células chamados corpos embrióides (EBS). Estes EBS são então tratadas com ácido retinóico para induzir a diferenciação neuronal e este protocolo foi previamente utilizado para induzir a diferenciação neuronal das células estaminais embrionárias. A) Indiferenciado rato colônia de células iPS cultivadas sobre uma camada de fibroblastos embrionários alimentador do mouse. B) corpos embrióides derivados de células de rato iPS em cultura em suspensão tomada no dia 8 após tratamento com ácido retinóico para induzir a diferenciação neuronal. Barra de escala é 100 mm.

Resultados Figura 3. Exemplo de um mouse iPS embrióides corpo após 3 dias de cultura dentro de um andaime 3D fibrina. As células começaram a migrar e se diferenciar dentro do andaime de fibrina. Barra de escala é 500 mm.

Este protocolo detalhado acima fornece um método para a geração de andaimes 3D de fibrina para a cultura de células estaminais pluripotentes, especificamente para o rato embrionário e células estaminais pluripotentes induzidas. Este sistema de cultura de 3D ​​biomaterial baseado com mais precisão imita o nicho de células-tronco encontrada in vivo e, como resultado, pode ser utilizado para rastrear sinais biológicos para determinar os seus efeitos sobre a diferenciação de células-tronco ^6. Nossas observações têm mostrado que estes andaimes quando semeadas com células-tronco derivadas corpos embrióides permanecer por 2 semanas in vitro antes de se tornar completamente degradada. Para aumentar ainda mais a estabilidade destas estruturas, aprotinina (um inibidor de protease) pode ser usado para retardar a degradação através da adição ao meio de cultura de células. ^7,16 Estes suportes também têm sido utilizados com sucesso para aplicações de engenharia de tecido neural, especificamente a geração de tecido semelhante ao encontrado no sistema nervoso central ^17. Enquanto outros groups combinaram células iPS com cola de fibrina no tratamento de acidente vascular cerebral isquêmico ^18, este trabalho representa o primeiro relato conhecido de combinar células iPS com andaimes de fibrina para aplicações de engenharia de tecidos neurais. Este trabalho também serviu como ponto de partida para a combinação de uma variedade de tipos de células-tronco com andaimes de fibrina para outras aplicações de engenharia de tecidos.

Os autores não têm nada a revelar.

Os autores gostariam de agradecer NSERC Discovery Grant 402462 "andaimes da engenharia de tecidos para controlar pluripotentes induzidas comportamento de células-tronco".