Erstellung von 3D-Fibrin-Gerüste für Stem Cell Culture Anwendungen

Diese Arbeit wird die Herstellung von 3D-Fibrin-Gerüste für die Kultivierung und Differenzierung von Stammzellen plutipotent. Solche Gerüste verwendet werden, um die Auswirkungen von verschiedenen biologischen Verbindungen zur Stammzellforschung Verhalten Bildschirm als auch modifiziert werden, um Drug Delivery-Systemen enthalten sein.

Die Stammzellen werden in natürlich vorkommenden 3D Mikroumgebungen in vivo, was oft als Stammzellnische ¹ sind gemäß vorhanden. Kultivierung von Stammzellen in der 3D-Gerüste Biomaterial bietet eine Möglichkeit, genau nachahmen diese Mikroumgebungen, was einen Vorteil gegenüber herkömmlichen 2D-Kulturverfahren unter Verwendung von Polystyrol als auch ein Verfahren zur Engineering Ersatzgewebe ^2. Während 2D Gewebekultur Polystyrol ist für die Mehrheit der Zellkultur-Experimente verwendet wurde, kann 3D Biomaterial Gerüsten näher replizieren Mikroumgebungen in vivo durch eine genauere strukturellen Zellpolarität in der Umwelt und besitzt biochemische und mechanische Eigenschaften ähnlich weichen Gewebe. ³ Eine Vielzahl von natürlich gewonnenen synthetischen Biomaterialien und Gerüste wurden als 3D-Umgebungen für die Unterstützung Stammzellwachstumsfaktoraktivität untersucht worden. Während synthetische Gerüste synthetisiert, um eine größere r haben werdenAnge von mechanischen und chemischen Eigenschaften und haben oft eine höhere Reproduzierbarkeit werden natürliche Biomaterialien oft von Proteinen und Polysacchariden in der extrazellulären Matrix und als Ergebnis enthalten Bindungsstellen für Zell-Adhäsion und bereitwillig unterstützen Zellkultur gefunden komponiert. Fibrin Gerüste, die durch Polymerisation von Fibrinogen aus Plasma erhalten hergestellt wurden in großem Umfang für eine Vielzahl von Anwendungen in der Gewebezüchtung in vitro und in vivo ⁴ untersucht. Solche Gerüste können modifiziert werden unter Verwendung einer Vielzahl von Methoden, um Systeme mit kontrollierter Freisetzung zur Abgabe von therapeutischen Faktoren ⁵ einzubauen. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass solche Gerüste, um erfolgreich Kultur embryonaler Stammzellen verwendet werden kann und das Grundgerüst-basierte Kultur kann verwendet werden, um die Wirkungen von verschiedenen Wachstumsfaktoren auf die Differenzierung der Stammzellen in ^6,7 ausgesät zu screenen.

Dieses Protokoll Details der Prozess der polymerizing Fibrin Gerüste aus Fibrinogen Lösungen mit der enzymatischen Aktivität von Thrombin. Der Prozess dauert 2 Tage in Anspruch, einschließlich einer nächtlichen Dialyse Schritt für die Fibrinogen-Lösung zu Citrate, die Polymerisation hemmen entfernen. Diese Methoden beruhen auf detaillierten Fibrinogenkonzentrationen bestimmt als optimal für die embryonale und induzierte pluripotente Stammzellen in Kultur. Andere Gruppen haben weitere Fibrin Gerüste für eine Vielzahl von Zelltypen und Anwendungen untersucht - die Vielseitigkeit dieses Ansatzes ^12.08.

Hinweise vor dem Start Protokoll: Fibrinogen ist ein Protein, Blut gewonnen und damit entsprechende Sicherheitsschulungen müssen vor Behandlung abgeschlossen sein. Dieses Protokoll erfordert 2 Tage Zeit in Anspruch, so die gewünschten Stammzellen Kulturen angemessen zu gewährleisten, sind sie bereit für die Aussaat. Im Hinblick auf die Berechnung, wie viel Fibrinogen abwiegen, drei 35-mm-Petrischalen von Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS, pH 7,4), die 110-130 mg Fibrinogen in 3 ml TBS gelöst wird ausreichend sein, um 1 24-Well-Platte mit 400 zu erzeugen ul Fibrin Gerüste in jede Vertiefung.

1. Day One: Making Fibrinogen-Lösungen und Dialyse über Nacht

1. Nehmen lyophilisiert Fibrinogen aus dem Kühlschrank und lassen Sie ihn 20 Minuten lang sitzen, damit es auf Raumtemperatur kommen.
2. In 3 ml Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) zu jedem 35 mm Petrischale. Jede Platte von Fibrinogen erhält man 2 bis 3 ml Fibrinogen-Lösung in einem Konzentrationsbereich von 12 bis 20mg / ml und die Gesamtmenge von Fibrinogen benötigt werden, können auf der Grundlage dieser Näherungen berechnet werden.
3. Abwiegen ca. 100-130 mg Fibrinogen (Fg) und streuen auf die Oberfläche des TBS, die in jedem Gericht. Warten Sie 5 Minuten für das Fibrinogen zu beginnen, in Lösung gehen. Cover Petri-Schale mit Deckel.
4. Petrischalen inkubieren bei 37 ° C für 2 Stunden, damit das Fibrinogen vollständig in die TBS-Lösung gehen.
5. Wet Dialyseschlauch (7000 MW abgeschnitten) mit TBS. Falten unteren Ende des Rohrs und Klemme Ende mit einer Dialyse Klemme geschlossen.
6. Pipettieren Sie die Fibrinogen-Lösungen von Geschirr in Dialyseschlauch. Falten Sie über oberen Ende und mit einer Klammer verschlossen Dialyse zu klemmen.
7. Platz Dialyseschlauch mit Fibrinogen-Lösung in einem 4 Liter-Behälter mit TBS gewaschen. Mix-Lösung mit Rührplatte setzen auf die niedrige Drehzahl (100 rpm).
8. Dialysieren Lösung über Nacht rühren auf Platte für mindestens 12 Stunden. Die TBS-Lösung muss nicht über diesen Zeitraum geändert werden.

2. Tag 2: Polymerisation von Fibrin Gerüste und Aussaat von Stammzellen in Gerüste

Alle Schritte für diesen Prozess beschrieben werden, sollten in einem sterilen Gewebekultur Abzug durchgeführt werden, da diese Gerüste mit Stammzell-Kulturen ausgesät werden.

1. Entfernen Sie die Fibrinogen-Lösung aus Dialyseschlauch und in einen geeigneten, großen konischen Rohr (entweder 15 ml oder 50 ml).
2. Filter Fibrinogen-Lösung mit einer 5,0 um Spritze zur Aufnahme größerer Verunreinigungen in der Lösung zu entfernen. Abhängig von dem Volumen der Lösung kann die Verwendung von mehreren Filtern erforderlich sein, die gesamte Lösung zu verarbeiten.
3. Sterilfilter der Fibrinogen-Lösung mit einem 0,22 um Filter in einem 50 ml konischen Röhrchen. Unter Verwendung eines geeigneten Größe Pipette bestimmen das Volumen des gefilterten Fibrinogen-Lösung für eine spätere Verwendung, wenn dabei Berechnungen. Abhängig von dem Volumen der Lösung kann die Verwendung von mehreren Filtern erforderlich sein, die ent verarbeitenIRE-Lösung.
4. Wird die Extinktion der Fibrinogen-Lösung bei 280 nm mit dem Spektralphotometer. Eine Verdünnung von 50 ist oft notwendig, eine Absorption unter 1 zu erhalten.
5. Berechnen Sie die Konzentration des Proteins in der Fibrinogen-Lösung mit der folgenden Gleichung: [Fibrinogen in mg / ml] = (A ₂₈₀ × Verdünnungsfaktor) 1,55 ÷ 1,55, wo ist der Extinktionskoeffizient bei A ₂₈₀ für humanes Fibrinogen ^13. Weiter berechnet die Menge an TBS erforderlich, um die Konzentration der Lösung auf 11,1 mg / ml Fibrinogen auf das ursprüngliche Volumen bezogen verdünnen. Die Endkonzentration des Proteins in der Fibrin-Gerüste werden mit 10 mg / ml nach der Polymerisation sein.
6. Erhalten sterilen Thrombin und Calciumchlorid-Lösungen. Fügen Sie zunächst 15 ul Thrombin-Lösung (Konzentration: 40 U / ml - Endkonzentration im Gerüst wird 2 U / ml) auf der rechten Seite jeder Vertiefung in der ersten Reihe der 24-Well-Platte. Als Nächstes fügen Sie 15 ul 50 mM Kalzium chlrid-Lösung auf der linken Seite eines jeden gut. Schließlich, fügen Sie 270 ul der Fibrinogen-Lösung auf die Platte. Schütteln Platte von Seite zu Seite durch Schütteln von hinten nach vorne, um sicherzustellen, Mischen von Lösungen an.
7. Lassen Sie die Zeile mit der Mischungen für 5 Minuten bei Raumtemperatur polymerisieren. Die Gerüste werden mehr undurchsichtig, da sie zu polymerisieren.
8. Wiederholen Sie die Schritte 2.6 und 2.7 bis die gewünschte Anzahl von Fibrin Gerüsten polymerisiert worden.
9. Nach der letzten 5-minütigen Inkubation, stellen die Platten in einer 37 ° C-Inkubator, um die vollständige Polymerisation von Gerüsten zu ermöglichen.
10. Nach der einstündigen Inkubation abgeschlossen ist, ist der nächste Schritt, um das Gerüst mit Samen Embryoidkörpern. Mit einer 20 ul pipettemen, wählen Sie eine individuelle Embryoidkörper und Platz in der Mitte des Fibrin Schafott. Prüfen Sie mit Mikroskop, dass jeder auch ein einzelnes Embryoidkörper enthält.
11. 5 l der Thrombin-Lösung (Konzentration: 40 U / ml) und 5 ul 50 mM CalciumchloridLösung auf der jeweils Embryoidkörper von 90 &mgr; l Fibrinogen-Lösung in jede Vertiefung gefolgt. Die Lösung sollte eine Blase bilden Kapselung der Embryoidkörpern.
12. Legen Sie die Platte wieder in 37 ° C Inkubator für eine weitere Stunde, um die Polymerisation zu gewährleisten.
13. Nach der Inkubation 1 ml der entsprechenden Zellkulturmedien in jede Vertiefung und Platz Platte wieder in 37 ° C Inkubator.

3. Repräsentative Ergebnisse

1 zeigt eine schematische Darstellung der Seitenansicht einer einzelnen Vertiefung, die das 3D-Gerüst Fibrin Kultursystem mit einer Embryoidkörper. 2A zeigt repräsentative Bilder ausgesät von Maus-induzierte pluripotente Stammzellen die auf embryonalen Maus-Fibroblasten-Feeder-Schichten kultiviert. Diese Zellen werden dann veranlaßt, Embryoid Bodies, Aggregate von Zellen, die neuralen Vorläuferzellen, unter Verwendung eines 8 Tage Retinsäure Behandlungsprotokoll (2B) als previousl bildeny beschrieben ^14, während Abbildung 3 zeigt das Aussehen eines iPS-abgeleitet Embryoidkörper nach 3 Tagen der Kultur innerhalb der 3D-Fibrin-Gerüsten. Ähnliche Ergebnisse wurden zuvor mit embryonalen Stammzellen der Maus ⁷ erhalten wird. Zusätzlich wurde diese Methode verwendet, um iPS-Kultur abgeleitet Embryoidkörpern hergestellt unter Verwendung eines anderen Protokolls mit Retinsäure und purmorphamine ¹⁵ innerhalb der 3D-Fibrin-Gerüste, demonstriert die Vielseitigkeit dieser Kultur-System.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der Seitenansicht eines einzelnen gut mit einem 3D-Gerüst entkernt Fibrin mit einem Embryoidkörper.

Abbildung 2. Maus induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) Zellkultur und Differenzierung. Um diese Zellen zu differenzieren neural Phänotypen sind die iPS-Zellen in Suspension kultiviert, um Aggregate von Zellen, die sogenannten Embryoidkörpern (EVG) zu produzieren. Diese werden dann mit EBs Retinsäure behandelt, um neuronale Differenzierung induzieren und das Protokoll wurde bereits verwendet, um neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen zu induzieren. A) Nicht differenzierte iPS-Zellen der Maus Kolonie auf einer embryonalen Maus-Fibroblasten-Feeder-Schicht kultiviert. B) Embryoidkörpern Maus aus iPS-Zellen in Suspensionskultur abgeleiteten am Tag 8 nach der Behandlung mit Retinsäure ergriffen werden, um neuronale Differenzierung zu induzieren. Maßstabsbalken ist 100 um.

3. Beispiel Ergebnisse einer Maus iPS Embryoidkörper nach 3 Tagen Kultur innerhalb eines 3D-Gerüst Fibrin. Die Zellen haben begonnen, zu migrieren und innerhalb des Fibrin Gerüst unterscheiden. Maßstabsbalken ist 500 um.

Dieses Protokoll oben genannten ein Verfahren zur Erzeugung von 3D Fibrin Gerüste für pluripotente Stammzellen in Kultur, die speziell für embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen. Diese 3D-basierte Biomaterial Kultursystem genauer imitiert die Stammzellnische in vivo gefunden und als Ergebnis kann verwendet werden, um biologische Signale zu screenen, um ihre Wirkung auf Differenzierung der Stammzellen ^zu bestimmen ⁶ werden. Unsere Beobachtungen haben gezeigt, dass diese Gerüste, wenn sie mit Stammzellen abgeleitet Embryoidkörpern bleiben für 2 Wochen in vitro, bevor er vollständig abgebaut ausgesät. Zur weiteren Erhöhung der Stabilität dieser Gerüste, kann Aprotinin (eine Protease-Inhibitor) verwendet, um den Abbau durch Addition an den Zellkulturmedien zu verlangsamen. ^7,16 Diese Gerüste wurden auch erfolgreich für neuronale Tissue Engineering-Anwendungen, insbesondere die Erzeugung von Gewebe verwendet ähnlich der in das zentrale Nervensystem ¹⁷ fanden. Während andere groups haben iPS-Zellen mit Fibrinkleber zur Behandlung ischämischer Schlaganfall ¹⁸ kombiniert, stellt diese Arbeit die erste bekannte Bericht der Kombination von iPS-Zellen mit Fibrin Gerüste für neuronale Tissue Engineering-Anwendungen. In dieser Arbeit wurde als Ausgangspunkt für die Kombination einer Reihe von Stammzelltypen mit Fibrin Gerüsten für andere Anwendungen in der Gewebezüchtung serviert.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Autoren danken dem NSERC Discovery Grant 402462 "Tissue Engineering Scaffolds zur Steuerung von induzierten pluripotenten Stammzellen-Verhalten" zu bestätigen.