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Questi i dettagli del lavoro per la preparazione di fibrina scaffold 3D per la coltura e differenziazione delle cellule staminali plutipotent. Tali ponteggi può essere usata per selezionare gli effetti di vari composti biologici sul comportamento cellule staminali nonché modificata per contenere sistemi di drug delivery.
Cellule staminali si trovano in natura microambienti 3D in vivo, che sono spesso denominati nicchia cellule staminali 1. Coltura di cellule staminali all'interno di 3D scaffold biomateriale fornisce un modo per riprodurre accuratamente questi microambienti, fornendo un vantaggio rispetto ai tradizionali metodi di coltura 2D utilizzando polistirene nonché un metodo per tessuti di ricambio ingegneria 2. Mentre 2D polistirene coltura tissutale è stato utilizzato per la maggior parte degli esperimenti di coltura cellulare, 3D ponteggi biomateriale può più strettamente replicare i microambienti trovate in vivo consentendo costituzione più accurata di polarità cella nell'ambiente e possiede proprietà biochimiche e meccaniche simili a tessuti molli. 3 Una varietà di derivazione naturale e sintetico ponteggi biomateriale sono stati studiati come ambienti in 3D per sostenere la crescita delle cellule staminali. Mentre ponteggi sintetici possono essere sintetizzati per avere una maggiore range di proprietà meccaniche e chimiche e spesso hanno una maggiore riproducibilità, biomateriali naturali sono spesso composti di proteine e polisaccaridi presenti nella matrice extracellulare e di conseguenza contengono siti di legame per l'adesione cellulare e facilmente sostenere la coltura cellulare. Ponteggi fibrina, prodotto polimerizzando il fibrinogeno proteina ottenuta da plasma, sono stati ampiamente studiati per una varietà di applicazioni di ingegneria tissutale sia in vitro e in vivo 4. Tali ponteggi può essere modificata utilizzando una varietà di metodi per incorporare sistemi a rilascio controllato per fornire fattori terapeutici 5. Studi precedenti hanno dimostrato che tali ponteggi può essere utilizzato con successo per coltura di cellule staminali embrionali e questo scaffold sistema di coltura può essere usata per selezionare gli effetti di vari fattori di crescita sulla differenziazione delle cellule staminali seminate dentro 6,7.
Questo protocollo dettagli il processo di polymerizing fibrina ponteggi da soluzioni fibrinogeno utilizzando l'attività enzimatica della trombina. Il processo si fa in 2 giorni per completare, compresa una fase di dialisi per tutta la notte per la soluzione del fibrinogeno per rimuovere citrati che inibiscono la polimerizzazione. Questi metodi dettagliati contare su concentrazioni di fibrinogeno determinati a essere ottimale per la coltura embrionale e indotto cellule staminali pluripotenti. Altri gruppi hanno ulteriormente investigato ponteggi fibrina per una vasta gamma di tipi di cellule e applicazioni - dimostrare la versatilità di questo approccio 8-12.
Note prima di iniziare il protocollo: Il fibrinogeno è una proteina del sangue derivato e formazione sulla sicurezza quindi opportuno deve essere completata prima manipolazione. Questo protocollo richiede 2 giorni per completare così il tempo delle culture staminali desiderati in modo appropriato per assicurare che siano pronti per la semina. In termini di calcolare la quantità di fibrinogeno da pesare, tre piastre da 35 mm di Petri di soluzione salina tamponata Tris (TBS, pH 7,4) contenente 110-130 mg di fibrinogeno sciolto in 3 ml di TBS sarà sufficiente a produrre 1 24 pozzetti contenente 400 ponteggi fibrina pl in ogni pozzetto.
1. Day One: Making soluzioni di fibrinogeno e la dialisi per tutta la notte
2. Giorno 2: Polimerizzazione di ponteggi di fibrina e la semina di cellule staminali in ponteggi
Tutte le fasi descritte per tale processo deve essere eseguito in una cappa sterile coltura tissutale come questi scaffold saranno seminate con colture di cellule staminali.
3. Risultati rappresentativi
Figura 1 mostra una schematica vista laterale di un singolo pozzetto contenente il 3D fibrina sistema cultura scaffold seminati con un corpo embrioide. Figura 2A mostra immagini rappresentative di cellule staminali pluripotenti indotte topo in coltura su strati di fibroblasti embrionali di topo feeder. Queste cellule vengono quindi indotte a formare corpi embrionali, aggregati di cellule contenenti progenitori neurali, utilizzando uno 8 giorni retinoico protocollo di trattamento (Figura 2B) come previously descritto 14 mentre la Figura 3 mostra l'aspetto di un IPS-derivato corpo embrioide dopo 3 giorni di coltura all'interno di 3D ponteggi fibrina. Risultati simili sono stati ottenuti in precedenza con cellule staminali embrionali di topo 7. Inoltre, questo metodo è stato utilizzato per la cultura IPS-derivati corpi embrionali prodotte utilizzando un protocollo diverso, con l'acido retinoico e purmorphamine 15 all'interno del 3D ponteggi fibrina, a dimostrazione della versatilità di questo sistema di coltura.
Figura 1. Schematico che mostra la vista laterale di un singolo pozzetto contenente un 3D fibrina scaffold seminato con un corpo embrioide.
Figura 2. Mouse staminali pluripotenti indotte (iPS), coltura cellulare e la differenziazione. Per differenziare queste cellule in neurfenotipi al, le cellule iPS sono coltivate in sospensione per la produzione di aggregati di cellule chiamate corpi embrionali (EBS). Questi EBs vengono poi trattate con acido retinoico di indurre il differenziamento neurale e questo protocollo è stato precedentemente usato per indurre il differenziamento neurale delle cellule staminali embrionali. A) indifferenziato topo cellule iPS colonia coltivati su una embrionale strato di fibroblasti topo alimentatore. B) corpi embrionali derivate da cellule iPS topo in coltura in sospensione adottata il giorno 8 dopo trattamento con acido retinoico di indurre il differenziamento neurale. Barra della scala è di 100 micron.
Risultati dell'esempio Figura 3. Di un IPS topo embryoid corpo dopo 3 giorni di coltura all'interno di uno scaffold 3D fibrina. Le cellule hanno cominciato a migrare e differenziarsi all'interno del patibolo fibrina. Barra della scala è di 500 micron.
Questo protocollo dettagliato sopra fornisce un metodo per generare 3D ponteggi di fibrina per la coltura di cellule staminali pluripotenti, in particolare per embrionali di topo e cellule staminali pluripotenti indotte. Questo sistema biomateriale cultura 3D basato più accuratamente imita la nicchia delle cellule staminali trovato in vivo e, di conseguenza, può essere usata per selezionare segnali biologici per determinare i loro effetti sulla differenziazione delle cellule staminali 6. Le nostre osservazioni hanno mostrato che quando questi scaffold seminati con cellule staminali derivate corpi embrionali rimangono per 2 settimane in vitro prima di diventare completamente degradata. Per aumentare ulteriormente la stabilità di questi scaffold, aprotinina (un inibitore della proteasi) può essere usato per rallentare la degradazione mediante aggiunta ai mezzi di coltura cellulare. 7,16 Tali ponteggi sono stati utilizzati con successo per applicazioni di ingegneria tissutale neurali, in particolare la generazione di tessuti simile a quella presente nel sistema nervoso centrale 17. Mentre altri groups hanno combinato le cellule iPS con colla di fibrina per il trattamento di ictus ischemico 18, questo lavoro rappresenta il primo rapporto nota di combinare cellule iPS, con impalcature di fibrina per applicazioni di ingegneria dei tessuti neurali. Questo lavoro è stato anche un punto di partenza per combinare una serie di tipi di cellule staminali con impalcature di fibrina per altre applicazioni di ingegneria tissutale.
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Gli autori desiderano ringraziare NSERC Discovery Grant 402462 "scaffolds di ingegneria tessutale indotta per il controllo delle cellule staminali pluripotenti comportamento".
Attrezzatura necessaria:
Bilancia analitica
pH-metro
Tissue incubatore (37 ° C, 5% CO 2)
Mescolare piastra
Spettrofotometro
Sterile tessuto cappa cultura
Tris soluzione salina tamponata (pH 7.4) (Need 4 L plus abbastanza per sciogliere fibrinogeno)
50 mM di soluzione di cloruro di calcio
Sterili provette coniche (15 o 50 mL)
35 mm Scatole Petri
Dialisi tubi (7.000 MW cutoff)
Dialisi clip
5.0 micron filtri per siringa
Confezionati singolarmente siringhe sterili 0,22 micron filtri
Siringa
24 e piastre di coltura di tessuto
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
Fibrinogeno (umano) | Calbiocorlo | 341578 | |
Trombina (umana) | Sigma | T7009 |
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