Préparation de la 3D pour les applications de fibrine Échafaudages CULTURE DE CELLULES SOUCHES

Cet ouvrage détaille la préparation de la 3D de fibrine échafaudages pour la culture et la différenciation des cellules souches plutipotent. Ces échafaudages peuvent être utilisés pour cribler les effets de divers composés biologiques sur le comportement des cellules souches ainsi que modifié pour contenir des systèmes de délivrance de médicaments.

Les cellules souches se trouvent dans naturellement microenvironnements 3D in vivo, qui sont souvent appelés la niche de cellules souches ^1. Culture de cellules souches à l'intérieur de la 3D échafaudages biomatériau offre un moyen de précision imiter ces microenvironnements, fournissant un avantage sur les méthodes traditionnelles de culture 2D à l'aide de polystyrène ainsi que d'une méthode pour les tissus de remplacement d'ingénierie ^2. Alors que la culture de tissus 2D polystyrène a été utilisé pour la majorité des expériences de culture cellulaire, des matrices 3D biomatériaux peuvent plus étroitement reproduire les micro-environnements trouvés in vivo, en permettant l'établissement plus précis de la polarité cellulaire dans l'environnement et possédant des propriétés biochimiques et mécaniques similaires aux tissus mous. ³ Une variété de dérivés naturels et synthétiques échafaudages de biomatériaux ont été étudiés comme des environnements 3D pour soutenir la croissance sur les cellules souches. Alors que les échafaudages synthétiques peuvent être synthétisés à avoir une plus grande range de propriétés mécaniques et chimiques et ont souvent une plus grande reproductibilité, biomatériaux naturels sont souvent composés de protéines et de polysaccharides présents dans la matrice extracellulaire et par conséquent contenir des sites de liaison pour l'adhésion cellulaire et facilement soutenir la culture cellulaire. Échafaudages de fibrine, produite par la polymérisation du fibrinogène protéine obtenue à partir de plasma, ont été largement étudiés pour une grande variété d'applications d'ingénierie tissulaire à la fois in vitro et in vivo ^4. Ces échafaudages peuvent être modifiés en utilisant une variété de méthodes permettant d'intégrer les systèmes de libération contrôlée de la prestation des facteurs thérapeutiques ^5. Des travaux antérieurs ont montré que ces échafaudages peuvent être utilisés avec succès des cellules souches embryonnaires et la culture ce système de culture basé sur échafaudage peut être utilisé pour cribler les effets de divers facteurs de croissance sur la différenciation des cellules souches ensemencées à l'intérieur de ^6,7.

Ce protocole décrit le processus de polymerizing de fibrine à partir de solutions de fibrinogène échafaudages aide de l'activité enzymatique de la thrombine. Le processus prend 2 jours pour compléter, y compris une étape de dialyse de nuit pour la solution de fibrinogène pour enlever les citrates qui inhibent la polymérisation. Ces méthodes détaillées s'appuient sur les concentrations de fibrinogène jugées optimales pour la culture de cellules embryonnaires pluripotentes induites et la tige. D'autres groupes ont en outre étudié les échafaudages de fibrine pour un large éventail de types de cellules et des applications - démontrant la polyvalence de cette approche ^8-12.

Remarques avant de commencer le protocole: Le fibrinogène est une protéine du sang dérivé et formation à la sécurité ainsi approprié doit être rempli avant de le manipuler. Ce protocole nécessite 2 jours pour compléter ainsi le temps des cultures souches voulues de façon appropriée afin de s'assurer qu'ils sont prêts pour l'ensemencement. En termes de calculer combien de fibrinogène de peser, trois boîtes de Pétri de 35 mm de solution saline tamponnée au tris (TBS, pH 7,4) contenant 110 à 130 mg de fibrinogène dissous dans 3 ml de TBS sera suffisante pour produire 1 24 plaques à puits contenant 400 échafaudages de fibrine ul dans chaque puits.

1. Day One: Faire des solutions de fibrinogène et de dialyse nuit

1. Prenez fibrinogène lyophilisé en dehors du réfrigérateur et laisser reposer pendant 20 minutes pour lui permettre de revenir à température ambiante.
2. Ajouter 3 ml de solution saline tamponnée Tris (TBS) à chaque plat de 35 mm de Pétri. Chaque plaque de rendements fibrinogène 2 à 3 mL de solution de fibrinogène allant de la concentration de 12 à 20mg / ml et la quantité totale de fibrinogène nécessaire peut être calculée sur la base de ces approximations.
3. Peser environ 100-130 mg de fibrinogène (Fg) et saupoudrer sur la surface de la présente SCT dans chaque plat. Attendez 5 minutes pour le fibrinogène pour commencer à passer en solution. Couvrir le plat de Pétri avec couvercle.
4. Incuber les boîtes de Pétri à 37 ° C pendant 2 heures afin de permettre le fibrinogène pleinement entrer dans la solution de TBS.
5. Tube de dialyse Wet (7000 MW coupés) avec le SCT. Extrémité inférieure de la Fold l'extrémité du tuyau et le collier fermé avec une pince de dialyse.
6. Introduire à la pipette les solutions de fibrinogène de la vaisselle dans un tube de dialyse. Pliez sur l'extrémité supérieure et pince fermée avec une pince de dialyse.
7. Tube de dialyse Lieu contenant une solution de fibrinogène dans un récipient de 4 litres du SCT. Mélanger la solution en utilisant plaque d'agitation réglé à basse vitesse (100 rpm).
8. Dialyser solution du jour au lendemain sur le plateau pour mélanger au moins 12 heures. La solution de TBS n'a pas besoin d'être changé au cours de cette période.

2. Jour 2: La polymérisation de la fibrine et l'ensemencement des échafaudages de cellules souches en échafaudages

Toutes les étapes décrites dans ce processus doit être effectuée sous une hotte à la culture de tissus stérile comme ces échafaudages seront ensemencés avec des cultures de cellules souches.

1. Retirer la solution de fibrinogène à partir de tubes de dialyse et le lieu dans un tube conique appropriée entreprises (soit 15 ml ou 50 ml).
2. Solution de fibrinogène filtre avec un filtre 5,0 um seringue pour enlever les grosses impuretés dans la solution. En fonction du volume de la solution, l'utilisation de plusieurs filtres peut être nécessaire pour traiter l'ensemble de la solution.
3. Filtre stériles de la solution de fibrinogène avec un filtre de 0,22 um dans un tube de 50 ml conique. Utilisation d'une pipette taille appropriée, déterminer le volume de la solution de fibrinogène filtrée à utiliser plus tard lorsque effectuer des calculs. Selon le volume de la solution, l'utilisation de plusieurs filtres peuvent être nécessaires pour traiter l'entsolution la colère.
4. Mesurer l'absorbance de la solution de fibrinogène à 280 nm en utilisant le spectrophotomètre. Un facteur de dilution de 50 est souvent nécessaire pour obtenir une absorbance de moins de 1.
5. Calculer la concentration de protéine présente dans la solution de fibrinogène en utilisant l'équation suivante: [fibrinogène en mg / ml] = (A × ₂₈₀ facteur de dilution) ÷ 1,55 1,55 où est le coefficient d'extinction à ₂₈₀ A pour fibrinogène humain ^13. Suivant calculer la quantité de SCT nécessaire pour diluer la concentration de la solution à 11,1 mg / ml de fibrinogène sur la base de son volume initial. La concentration finale de protéines dans l'échafaudage de fibrine sera de 10 mg / ml après la polymérisation.
6. Obtenir thrombine stérile et des solutions de chlorure de calcium. Tout d'abord, ajouter 15 ul solution de thrombine (concentration: 40 U / ml - concentration finale dans échafaudage sera de 2 U / ml) à droite de chaque bien dans la première rangée de la plaque de 24 puits. Ensuite, ajouter 15 ul de 50 mM de calcium chlsolution là pour jouer à gauche de chaque puits. Enfin, ajouter 270 ul de la solution de fibrinogène à la plaque. Serrer la plaque d'un côté à côté suivi par agitation arrière vers l'avant pour assurer un mélange de solutions.
7. Laissez la ligne contenant les mélanges polymériser pendant 5 minutes à température ambiante. Les échafaudages deviennent plus opaques comme ils se polymériser.
8. Répétez les étapes 2.6 et 2.7 jusqu'à ce que le nombre souhaité de fibrine échafaudages ont été polymérisés.
9. Après les 5 dernières minutes d'incubation, placer les plaques à l'intérieur d'un incubateur à 37 ° C pour permettre la polymérisation complète d'échafaudages.
10. Après l'incubation d'une heure est terminée, la prochaine étape est d'ensemencer l'échafaud avec des corps embryoïdes. L'utilisation d'un 20 pipettemen ul, sélectionnez un corps embryoïdes individu et sa place dans le centre de l'échafaud de fibrine. Vérifiez avec le microscope que chaque puits contient un corps embryoïdes unique.
11. Ajouter 5 pi de solution de thrombine (concentration: 40 U / ml) et 5 pi de 50 mM de chlorure de calciumsolution sur le dessus de chaque corps embryoïdes suivie 90 pl de solution de fibrinogène à chaque puits. La solution doit former une bulle encapsuler les corps embryoïdes.
12. Placez la plaque arrière dans 37 incubateur ° C pendant une heure supplémentaire pour assurer la polymérisation.
13. Après incubation, ajouter 1 ml des médias appropriés de culture cellulaire à chaque plaque bien et remettez-les dans 37 ° C incubateur.

3. Les résultats représentatifs

La figure 1 montre un schéma de la vue de côté d'un puits individuel contenant le système 3D de fibrine culture échafaudage ensemencées avec un corps embryoïdes. Figure 2A montre des images représentatives de la souris cellules souches pluripotentes induites étant cultivées sur des couches nourricières de souris embryonnaires fibroblastiques. Ces cellules sont ensuite amenés à former des corps embryoïdes, agrégats de cellules contenant progéniteurs neuronaux, en utilisant une 8 jours de traitement acide rétinoïque protocole (Figure 2B) previously décrit ^14, tandis que la figure 3 montre l'aspect d'un iPS dérivées corps embryoïdes après 3 jours de culture à l'intérieur des échafaudages de fibrine 3D. Des résultats similaires ont été obtenus précédemment en utilisant des cellules souches embryonnaires de souris ^7. En outre, cette méthode a été utilisée pour la culture iPS dérivées corps embryoïdes produits en utilisant un protocole différent impliquant l'acide rétinoïque et purmorphamine ^{15 à l'intérieur} des échafaudages de fibrine 3D, ce qui démontre la polyvalence de ce système de culture.

Figure 1. Schéma montrant la vue de côté d'un puits individuel contenant une 3D de fibrine échafaudage tête de série avec un corps embryoïdes.

Figure 2. Souris pluripotentes induites sur les cellules souches de la culture (iPS) et de la différenciation. Pour différencier ces cellules dans neurphénotypes al, les cellules iPS sont cultivées en suspension pour produire des agrégats de cellules appelées corps embryoïdes (EBS). Ces EB sont ensuite traités avec de l'acide rétinoïque pour induire la différenciation neuronale et ce protocole a déjà été utilisé pour induire la différenciation neurale des cellules souches embryonnaires. A) indifférencié colonie de cellules iPS de souris cultivées sur des fibroblastes de souris chargeur couche embryonnaire. B) Les corps embryoïdes dérivés de cellules iPS de souris en culture en suspension prises au jour 8 après le traitement avec de l'acide rétinoïque pour induire la différenciation neurale. La barre d'échelle est de 100 um.

Exemples de résultats Figure 3. De quelques iPS de souris embryoïdes corps après 3 jours de culture à l'intérieur d'un échafaudage 3D fibrine. Les cellules ont commencé à migrer et se différencier à l'intérieur de l'échafaudage de fibrine. La barre d'échelle est de 500 um.

Ce protocole détaillé ci-dessus fournit une méthode pour générer des matrices 3D de fibrine pour la culture de cellules souches pluripotentes, spécialement pour les embryonnaire de la souris et cellules souches pluripotentes induites. Ce système 3D biomatériau culture fondée sur plus de précision imite la niche de cellules souches in vivo et ont trouvé, par conséquent, il peut être utilisé pour cribler des indices biologiques afin de déterminer leurs effets sur la différenciation des cellules souches ^6. Nos observations ont montré que ces échafaudages quand ensemencé avec des cellules souches dérivées des corps embryoïdes restent pendant 2 semaines in vitro avant de devenir complètement dégradé. Pour augmenter encore la stabilité de ces échafaudages, l'aprotinine (un inhibiteur de protéase) peuvent être utilisés pour ralentir la dégradation par l'addition aux milieux de culture cellulaire. ^7,16 Ces échafaudages ont également été utilisés avec succès pour neuronaux applications d'ingénierie tissulaire, en particulier la génération de tissus similaire à celle trouvée dans le ¹⁷ système nerveux central. Alors que d'autres groups ont combiné des cellules iPS avec de la colle de fibrine pour le traitement des AVC ischémiques ^18, ce travail représente le premier rapport connu de combiner des cellules iPS avec des échafaudages de fibrine pour neuronaux applications d'ingénierie tissulaire. Ce travail a également servi comme point de départ pour combiner toute une gamme de types de cellules souches avec des échafaudages de fibrine pour d'autres applications d'ingénierie tissulaire.

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Les auteurs tiennent à remercier découverte du CRSNG 402462 "échafaudages ingénierie tissulaire pour contrôler les comportements induits par les cellules souches pluripotentes".